尹良偉 ，王禹茲，陳　濤，張舒珊，初海鷹，孔　力，馬海英

(1.大連市中心醫(yī)院 綜合六病房，遼寧 大連 116033；2.大連醫(yī)科大學(xué) 組織胚胎學(xué)教研室，遼寧 大連 116044)

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BDNF基因轉(zhuǎn)染神經(jīng)干細(xì)胞移植腦損傷大鼠移植細(xì)胞存活率和Trkβ、Erk1/2、Ras及Trx的表達(dá)

尹良偉1，王禹茲2，陳濤2，張舒珊2，初海鷹2，孔力2，馬海英2

(1.大連市中心醫(yī)院 綜合六病房，遼寧 大連 116033；2.大連醫(yī)科大學(xué) 組織胚胎學(xué)教研室，遼寧 大連 116044)

目的探討腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子基因修飾神經(jīng)干細(xì)胞(BDNF/NSCs)移植大鼠創(chuàng)傷性腦損傷(TBI)模型后，對(duì)移植細(xì)胞存活數(shù)量的影響及其機(jī)制。方法采用Feeney法制備TBI模型，于造模后72 h，隨機(jī)分為兩組：BDNF/NSCs移植組及 NSCs移植組，將3 μL(1×108/mL)BDNF/NSCs或 NSCs直接移植于腦損傷區(qū)。分別于移植后1、2、3和4周取腦組織，凍存或制備冰凍切片。在熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)移植細(xì)胞存活數(shù)量，并采用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)p-Erk1/2、Ras蛋白的表達(dá)；通過(guò)RT-PCR技術(shù)檢測(cè)腦損傷區(qū)及周圍組織中Trx、Trkβ基因的表達(dá)。結(jié)果BDNF/NSCs 組和NSCs 組細(xì)胞存活數(shù)隨移植時(shí)間延長(zhǎng)而減少，在移植后的不同時(shí)間點(diǎn)，BDNF/NSCs 組移植細(xì)胞存活率均明顯高于NSCs 組(P<0.05)；BDNF/NSCs組在移植后不同時(shí)間點(diǎn)移植細(xì)胞的p-Erk1/2、Ras蛋白表達(dá)強(qiáng)度均明顯高于NSCs組(P<0.05)；與NSCs組比較，BDNF/NSCs組損傷灶及周圍腦組織中Trx、Trkβ基因的表達(dá)水平均明顯增強(qiáng)(P<0.05)。結(jié)論BDNF基因轉(zhuǎn)染NSCs移植大鼠TBI后，能夠明顯提高移植細(xì)胞的存活率，上調(diào)Trkβ、p-Erk1/2、Ras及Trx的表達(dá)。BDNF與其受體Trkβ結(jié)合后，可能通過(guò)Ras/Raf/Erk途徑激活其下游的Trx基因從而激活細(xì)胞的抗氧化作用，進(jìn)而減少移植細(xì)胞的氧化損傷，提高移植細(xì)胞在腦組織損傷區(qū)的存活率。

腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子；神經(jīng)干細(xì)胞；創(chuàng)傷性腦損傷；Ras/Raf/Erk

[引用本文]尹良偉，王禹茲，陳濤，等.BDNF基因轉(zhuǎn)染神經(jīng)干細(xì)胞移植腦損傷大鼠移植細(xì)胞存活率和Trkβ、Erk1/2、Ras及Trx的表達(dá)[J].大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2016,38(5)：422-427.

創(chuàng)傷性腦損傷(traumatic brain injury，TBI)是指由外傷引起的腦組織損傷，是損傷致死的主要原因之一，也是兒童和青少年致殘的主要原因之一[1]。隨著現(xiàn)代醫(yī)療技術(shù)的不斷發(fā)展，對(duì)TBI的治療已經(jīng)取得了很大的進(jìn)展，但對(duì)TBI患者恢復(fù)腦功能仍缺乏有效的治療手段。神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells，NSCs)或神經(jīng)前體細(xì)胞(neural progenitor cells，NPCs)的特征及其成功地體外分離培養(yǎng)使直接移植這些細(xì)胞治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷成為可能。本課題組之前的研究表明， NSCs移植治療TBI大鼠后1周，即發(fā)揮了促進(jìn)感覺(jué)運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)的作用[2]。但是，隨著移植時(shí)間的不斷推移，移植的NSCs存活數(shù)量不斷減少，移植后第4周的存活率為(6.3±1.0)%[3]，而這種移植細(xì)胞的損失可能主要由腦組織損傷后引發(fā)的繼發(fā)損傷引起，包括血腦屏障破壞、炎性因子、氧化應(yīng)激損傷等[4-5]。因此，如何提高移植NSCs的存活數(shù)量成為了保障其治療效果的關(guān)鍵因素之一。

腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain derived neurophic factor，BDNF)，是BDNF基因編碼的一種生物活性蛋白，是神經(jīng)源性營(yíng)養(yǎng)因子家族中的一種，廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)及周圍神經(jīng)系統(tǒng)，且視網(wǎng)膜、腎臟等臟器均有不同程度的分布。近年來(lái)因其廣泛的生理活性功能成為研究焦點(diǎn)。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，對(duì)新神經(jīng)元及突觸的生長(zhǎng)發(fā)育、分化起重要作用，并具有能防止神經(jīng)元受損傷死亡、改善神經(jīng)元的病理狀態(tài)、促進(jìn)受損傷神經(jīng)元再生及分化等生物效應(yīng)，在中樞及周圍神經(jīng)系統(tǒng)中對(duì)成熟神經(jīng)元的維持，對(duì)長(zhǎng)時(shí)程記憶的保護(hù)、正常生理營(yíng)養(yǎng)因子的刺激及控制等都有重要作用。BDNF對(duì)下游作用通路方式及產(chǎn)生的級(jí)聯(lián)作用非常廣泛，如Trkβ，LNGFR等，但尤以BDNF-Trkβ通路最為重要，產(chǎn)生的生理功能也最為廣泛。 Trkβ是酪氨酸激酶受體蛋白家族的一種，具有廣泛的生理功能，作為BDNF下游的一種的受體蛋白，被BDNF蛋白激活產(chǎn)生級(jí)聯(lián)效應(yīng)，從而激活下游的蛋白受體，使得BDNF在細(xì)胞中調(diào)節(jié)各種生理功能的作用得以實(shí)現(xiàn)[6-7]。本課題組以前的研究也表明，BDNF基因轉(zhuǎn)染NSCs(BDNF/NSCs)后，與NSCs相比，BDNF呈現(xiàn)為過(guò)表達(dá)，將二者同等條件下分別移植治療TBI大鼠后，BDNF/NSCs組感覺(jué)運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)均明顯好于NSCs組[3]，但其作用過(guò)程的機(jī)制尚不完全明確。

本研究采用熒光示蹤劑PKH26標(biāo)記BDNF/NSCs與NSCs，移植于TBI模型大鼠腦內(nèi)，觀察移植細(xì)胞的存活率，并進(jìn)一步探討了BDNF過(guò)表達(dá)對(duì)Trkβ、Ras/Raf/Erk1/2途徑、其下游抗氧化通路上的硫氧還蛋白(thioredoxin，Trx)等相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，以明確BDNF對(duì)移植細(xì)胞存活率的影響及機(jī)制。

1　材料和方法

1.1主要材料與儀器

成年Wister大鼠48只，150～200 g，雌雄各半(大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。兔抗鼠p-Erk1/2多克隆抗體(上海Upstate)；羊抗兔多克隆二抗(上海碧云天)；抗大鼠Ras單克隆抗體(美國(guó)Cell Signaling)；馬抗小鼠多克隆二抗(美國(guó)Vector)；RNA PCR KIT VER 3.0(大連寶生物)；PKH26(美國(guó)Sigma)。腦立體定向儀(美國(guó)Stoelting)。

1.2方法

1.2.1 創(chuàng)傷性腦損傷模型制備

采用改良的Feeney法制備創(chuàng)傷性腦損傷模型[2]。以10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠(40 mg/kg), 麻醉后固定于立體定向儀上，切開頭皮，分離皮下組織及骨膜。在前囟后3 mm、矢狀縫左3 mm處鉆取直徑約為3 mm 的骨窗，保持硬腦膜的完整。采用改良的打擊裝置，以10 g 砝碼從30 cm 高處自由墜落，撞擊該處硬腦膜，造成顱腦挫裂傷。

1.2.2BDNF/NSCs與NSCs的培養(yǎng)

采用本課題組已獲得的BDNF/NSCs或NSCs傳代培養(yǎng)[2]。培養(yǎng)基為DMEM/F12 培養(yǎng)基(含B27、EGF、bFGF)，接種密度為(1～2)×105個(gè)/mL，接種于T型瓶中，于37 ℃、飽和濕度、含5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。

1.2.3PKH26示蹤劑標(biāo)記BDNF/NSCs與NSCs

于移植前收集細(xì)胞，加入AccutaseTM酶，制備成單細(xì)胞懸液。PKH26染色方法按說(shuō)明書進(jìn)行。染色體系中PKH26和細(xì)胞的濃度分別為4×10-6mol/L和1×107/mL。用生理鹽水重懸BDNF/NSCs或NSCs，終濃度為1×108/mL，置于冰上備用。

1.2.4動(dòng)物分組與NSCs移植

于造模后72 h，將動(dòng)物隨機(jī)分為BDNF/NSCs移植組和NSCs移植組(各24只)。動(dòng)物麻醉后固定于立體定位儀上，暴露創(chuàng)傷灶。在創(chuàng)傷灶中心，用微量注射泵將3 μL PKH26標(biāo)記的BDNF/NSCs或NSCs懸液注入硬腦膜下1.1 mm處，注射10 min，停留5 min后拔出注射器，以后動(dòng)物常規(guī)飼養(yǎng)。每組動(dòng)物分別于移植后1、2、3、4周取全腦，用于移植細(xì)胞計(jì)數(shù)、免疫組化染色和RT-PCR檢測(cè)。

1.2.5細(xì)胞存活計(jì)數(shù)

對(duì)大鼠進(jìn)行4%多聚甲醛灌流固定，經(jīng)固定行全腦冰凍切片。于熒光顯微鏡下觀察NSCs的存活數(shù)。200倍鏡下，每10張切片計(jì)數(shù)1張PKH26標(biāo)記的NSCs(自前囟前1 mm至前囟后4 mm)，每只動(dòng)物計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)×10作為該動(dòng)物存活細(xì)胞數(shù)，存活率為存活細(xì)胞數(shù)與移植細(xì)胞總數(shù)的比值。

1.2.6免疫組化分析

冰凍切片室溫靜置30 min，PBS緩沖液沖洗3次，每次5 min；滴加山羊血清封閉20 min；滴加一抗(Ras 1∶200，p-Erk1/2 1∶100)，置于4 ℃過(guò)夜；PBS緩沖液沖洗3次，每次5 min，分別滴加二抗(馬抗小鼠多克隆二抗 1∶2000，羊抗兔多克隆二抗 1∶100)，室溫靜置1 h；PBS緩沖液沖洗3次，每次5 min；DAPI封片置于熒光顯微鏡下觀察。

1.2.7RT-PCR分析

分別于移植后不同時(shí)間點(diǎn)，取腦損傷灶及其周圍組織, 采用異硫氰酸胍-酚-氯仿(TRIzol)兩步法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，常規(guī)進(jìn)行RT-PCR。

以下引物委托寶生物有限公司合成：

Trx上游引物5'-CAAATGCATGCCGACCTTCCAGTT-3'

下游引物5'-TGGCAGTTGGGTATAGACTCTCCA-3'

Trkβ上游引物5'-AGCCAGCACTTCAGTGGTTCTA-3'

下游引物5'-TTGGTTTGGTCAGCAACATCCG-3'GAPDH上游引物5'-TGTGATGGGTGTGAACCACGAGAA-3'

下游引物5'-GAGCCCTTCCACAATGCCAAAGTT-3'

PCR 反應(yīng)條件：94 ℃ 3 min預(yù)變性；98 ℃ 10 s，50 ℃ 15 s，72 ℃ 1 min，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 延伸10 min。取2 μL PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，在凝膠成像系統(tǒng)下成像，用Image Master ED軟件計(jì)算各電泳條帶的強(qiáng)度值，以目的基因條帶和內(nèi)參照基因條帶的強(qiáng)度之比(Trx/GAPDH；Trkβ/GAPDH)為目的基因mRNA表達(dá)的相對(duì)值，據(jù)此相對(duì)值，判斷各樣品中各基因 mRNA表達(dá)程度的差異。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，同一時(shí)間點(diǎn)內(nèi)組間比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)　果

2.1BDNF/NSCs與NSCs移植后在腦內(nèi)的存活情況

對(duì)移植細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，BDNF/NSCs 組和NSCs 組細(xì)胞存活率均隨移植時(shí)間延長(zhǎng)而減少，在移植后的不同時(shí)間點(diǎn)，BDNF/NSCs 組移植細(xì)胞存活率均明顯多于NSCs組(P<0.05)，見(jiàn)圖1。BDNF/NSCs組移植細(xì)胞的突起豐富且較長(zhǎng)。

圖1BDNF/NSCs組與NSCs組移植后不同時(shí)間點(diǎn)移植細(xì)胞的存活情況

Fig 1 The survival cells of BDNF/NSCs-transplated group and NSCs-transplated group in different time of post-transplantation

A：移植后不同時(shí)間點(diǎn)，BDNF/NSCs組與NSCs組細(xì)胞存活率比較，BDNF/NSCs組存活細(xì)胞率明顯高于NSCs組；B(NSCs組)和C(BDNF/NSCs組)為移植后第4周 PKH26標(biāo)記的移植細(xì)胞存活情況。*與NSCs組比較，P<0.05

2.2免疫組化結(jié)果

免疫組化觀察p-Erk1/2、Ras蛋白表達(dá)情況，圖2、3顯示PKH26標(biāo)記的BDNF/NSCs或NSCs移植后第2周 p-Erk1/2、Ras蛋白陽(yáng)性表達(dá)結(jié)果。可見(jiàn)BDNF/NSCs組腦組織中移植細(xì)胞的p-Erk1/2和Ras蛋白的熒光染色強(qiáng)度較強(qiáng)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，BDNF/NSCs組Ras、p-Erk1/2蛋白表達(dá)水平均明顯高于NSCs組(圖4)，差異有顯著性意義(P<0.01)。

圖2　損傷鼠腦皮質(zhì)移植NSCs存活及p-Erk1/2蛋白表達(dá)(bar=50 μm)Fig 2 The expression of p-Erk1/2 protein and survivals of neural stem cells in rat cortical injury(scale bars=50 μm)

圖3　損傷鼠腦皮質(zhì)移植NSCs存活及Ras蛋白表達(dá)(bar=50 μm)Fig 3 The expression of Ras protein and survivals of neural stem cells in rat cortical injury (scale bars=50 μm)

圖4　p-Erk1/2與Ras蛋白表達(dá)光密度值分析Fig 4 The optical density value analysis of expression of p-Erk1/2 and Ras proteins*與NSCs組相比，P<0.05

2.3 RT-PCR結(jié)果

RT-PCR測(cè)定TBI大鼠損傷灶與周圍腦組織中Trkβ與Trx 的mRNA表達(dá)。分析結(jié)果顯示，于移植后的1，2，3和4周，BDNF/NSCs組Trkβ與Trx的基因表達(dá)水平均明顯高于NSCs組(P<0.05)。見(jiàn)圖5、6。

圖5　移植后不同時(shí)間點(diǎn)Trx、Trkβ基因產(chǎn)物RT-PCR電泳圖Fig 5 The Trx and Trkβ gene product RT-PCR electrophoregram in different time of post-transplantation1，3，5，7為NSCs組；2，4，6，8為BDNF/NSCs組。1和2，3和4，5和6，7和8分別為移植后第1，2，3，4周

圖6　Trx、Trkβ基因表達(dá)產(chǎn)物RT-PCR電泳圖分析Fig 6 The annlysis of the Trx and Trkβ gene product RT-PCR electrophoregramA：Trx基因表達(dá)結(jié)果；B：Trkβ基因表達(dá)結(jié)果。*與NSCs組相比P<0.05

3　討　論

NSCs是一種具有多向分化潛能和自我更新能力的細(xì)胞。源于胚胎中樞神經(jīng)系統(tǒng)不同區(qū)域的NSCs在不同的微環(huán)境中可分化為神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞[8]。成年哺乳動(dòng)物腦內(nèi)的NSCs主要位于海馬齒狀回顆粒下層(subgranular zone，SGZ)與腦室下區(qū)(subventracular zone，SVZ)。近年來(lái)，NSCs移植治療中樞及周圍神經(jīng)系統(tǒng)的損傷及神經(jīng)退行性疾病的研究得到廣泛關(guān)注。影響NSCs移植后存活、增殖和分化的因素很多，包括細(xì)胞因子、創(chuàng)傷灶周圍的微環(huán)境改變以及內(nèi)源性基因調(diào)控等。研究表明，在移植早期，急性炎癥所產(chǎn)生的毒性因子可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，減少細(xì)胞存活，導(dǎo)致活細(xì)胞的明顯減少。另外，由原發(fā)損傷引起的繼發(fā)損傷、血腦屏障的破壞和氧化應(yīng)激反應(yīng)介導(dǎo)了細(xì)胞死亡，并且負(fù)面的影響了移植細(xì)胞的存活[4-5,9]。

許多研究表明，BDNF在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中具有促進(jìn)神經(jīng)元的發(fā)育、存活、分化等生理作用，而且在神經(jīng)元損傷后的修復(fù)及突觸重建過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[7]。研究表明，BDNF直接注入脊索損傷紅核附近能夠防止和逆轉(zhuǎn)神經(jīng)細(xì)胞萎縮，促進(jìn)軸突再生，但這種給藥途徑限制了給藥量，并且反復(fù)給藥容易引起炎癥和局部組織損傷[10-11]?；蛑委煘閮?yōu)化NSCs移植策略提供了潛在的可能。因此，本研究采用BDNF基因轉(zhuǎn)染NSCs移植于TBI，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，移植后4周內(nèi)，BDNF/NSCs移植組的存活率均明顯高于NSCs移植組，BDNF基因轉(zhuǎn)染NSCs后移植于腦損傷區(qū)，明顯提高了移植細(xì)胞的存活率。

本文進(jìn)一步探討了BDNF過(guò)表達(dá)促進(jìn)移植細(xì)胞的存活率的分子機(jī)制。其機(jī)制可能是多方面的，包括BDNF介導(dǎo)的神經(jīng)保護(hù)作用、抗氧化損傷、細(xì)胞與細(xì)胞間的信號(hào)傳導(dǎo)等[12-13]。Trkβ是由酪氨酸激酶原癌基因編碼的酪氨酸激酶蛋白受體，BDNF與下游的Trkβ特異性結(jié)合發(fā)揮廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，促進(jìn)神經(jīng)元的生長(zhǎng)、繁殖、分化，維持成熟神經(jīng)元生存、加快神經(jīng)突的生長(zhǎng)、釋放特異神經(jīng)遞質(zhì)、介導(dǎo)神經(jīng)元的可塑性。當(dāng)神經(jīng)元在受到損傷或發(fā)生退行性變等情況下，BDNF可起到保護(hù)作用，延長(zhǎng)其生存時(shí)間、恢復(fù)其受損功能[14-16]。

Ras/Raf/Erk是MAPK下游通路中的一種重要通路，是細(xì)胞最重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之一，涉及到調(diào)節(jié)多種生理過(guò)程，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育，也是多種基因產(chǎn)物實(shí)現(xiàn)其生理功能的重要通路[17-19]。Ras/Raf/Erk激活水平的增高與細(xì)胞增殖及分化密切相關(guān)。這一信號(hào)通路可以激活其下游抗氧化通路上的核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid-2 related factor 2，Nrf2)和硫氧還蛋白(thioredoxin，Trx)等相關(guān)蛋白的表達(dá)，使其抗氧化功能得以表現(xiàn)。Nrf2是一種抗氧化應(yīng)激的重要調(diào)節(jié)因子，在神經(jīng)元抗氧化應(yīng)激及谷氨酸誘導(dǎo)的神經(jīng)興奮性毒性等生理過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。其在體內(nèi)體外的神經(jīng)保護(hù)作用被廣泛認(rèn)同，但作用機(jī)制尚不十分明確。Nrf2通過(guò)上調(diào)下游靶基因，促進(jìn)Trx和熱休克蛋白70，從而作為一種保護(hù)神經(jīng)元的重要途徑[18]。Trx是一種小分子多功能蛋白質(zhì)家族，通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的關(guān)鍵蛋白及細(xì)胞內(nèi)第二信使過(guò)氧化氫，從而發(fā)揮重要的生理作用[20]。Trx在氧化還原中起到重要的作用，且在細(xì)胞存活及生長(zhǎng)過(guò)程中發(fā)揮重要的生理作用，目前機(jī)制尚不十分明確， Trx可能通過(guò)它的抗氧化效應(yīng)直接抑制氧化應(yīng)激，或通過(guò)與關(guān)鍵信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用而間接抑制氧化應(yīng)激。內(nèi)因或外因所致的Trx過(guò)表達(dá)能抑制細(xì)胞氧化損傷[21]。由此可見(jiàn)，激活Ras/Raf/Erk1/2途徑進(jìn)而激活其下游的Nrf2、Trx基因及其相關(guān)蛋白表達(dá)，是對(duì)抗氧化應(yīng)激損傷的重要途徑。

本研究發(fā)現(xiàn)，與NSCs移植組比較，在移植后4周內(nèi)，BDNF/NSCs組BDNF的過(guò)表達(dá)使其受體Trkβ、Ras/Raf/Erk通路中相關(guān)因子Ras、p-Erk1/2及其下游與細(xì)胞抗氧化損傷相關(guān)的Trx的表達(dá)明顯增強(qiáng)。這些結(jié)果表明，BDNF促進(jìn)移植細(xì)胞的存活，可能與激活其受體介導(dǎo)的細(xì)胞抗氧化損傷途徑相關(guān)。

本研究結(jié)果提示，BDNF基因轉(zhuǎn)染NSCs移植大鼠TBI后，能夠明顯提高移植細(xì)胞的存活率，上調(diào)Trkβ、Ras、p-Erk1/2和Trx的表達(dá)。推測(cè)其提高移植細(xì)胞存活率的機(jī)制之一可能是BDNF作用于其受體Trkβ，通過(guò)Ras/Raf/Erk途徑激活其下游的Trx基因，從而激活細(xì)胞的抗氧化機(jī)制，減少了移植細(xì)胞的氧化損傷，促進(jìn)了損傷區(qū)及周圍移植細(xì)胞的存活。BDNF促進(jìn)NSCs移植TBI后存活的機(jī)制尚需要進(jìn)一步的研究，為臨床上優(yōu)化NSCs移植的策略提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Neural stem cells overexpressing brain-derived neurotrophic factor improve cell survival and elevate the expression of Trkβ, Erk1/2, Ras and Trx following transplantation in a rat model of traumatic brain injury

YIN Liang-wei1, WANG Yu-zi2，CHEN Tao2, ZHANG Shu-shan2, CHU Hai-ying2, KONG Li2, MA Hai-ying2

(1.ComprehensiveWards6,DalianCentralHospital,Dalian116033,China; 2.DepartmentofHistologyandEmbryology,DalianMedicalUniversity,Dalian116044,China)

Objective To investigate the survival of engrafted cells after transplantation of NSCs modified by BDNF gene(BDNF/NSCs) into rat models of traumatic brain injury(TBI)and underlying mechnisms. Methods TBI models built as described by Feeney were divided into two groups after 72 hours, BDNF/NSCs-transplanted group and NCSs-transplanted group, both directly transplanted with 3 μL(1×108/mL)BDNF/NSCs or NSCs, respectively. Brain samples were freezed or made into freezed slices at 1, 2, 3, and 4 weeks after transplantation. The survival of engrafted cells was accounted with fluroescent microscope. Immunohistochemical staining and RT-PCR were conducted to evaluted the expression of Erk and Ras protein and the expression of the Trx and Trkβ gene. Results The survival numbers in both BDNF/NSCs-transplanted group and NSCs-transplanted group were decreased with the passage of time. However, the survival in BDNF/NSCs-transplantated group was significantly more than that in NSCs-transplantate group during the experimental period(P<0.05). Immunohistochemical staining showed the expressions of p-Erk1/2 and Ras proteins in BDNF/NSCs-transplanted group were higher than those in NCSs-transplanted group(P<0.05), and RT-PCR showed the expressions of Trx and Trkβ genes around the injured areas in BDNF/NSCs-transplanted group were increased significantly compared to those in NCSs-transplanted group(P<0.05). Conclusions BDNF gene transfection improves the survival of engrafted NSCs in rat models of TBI, and upregulates the levels of Trkβ, p-Erk1/2, Ras and Trx. The underlying mechanisms may be that BDNF gene combining with its receptor Trkβ activates its downstream Trx gene through the anti-oxidate pathway Ras/Raf/Erk1/2, subsequently reduces the oxidative damage of engrafted cells and improves the survival rate in TBI.

brain-derived neurotrophic factor(BDNF); neural stem cells (NSCs); traumatic brain injury (TBI); Ras/Raf/Erk1/2

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31300812)

尹良偉(1975-)，男，遼寧大連人，主任醫(yī)師。E-mail：lwyin2008@163.com

馬海英，副教授。E-mail：mahaiying@dlmedu.edu.cn

??著

10.11724/jdmu.2016.05.02

R742.3

A

1671-7295(2016)05-0422-06

2016-06-27；

2016-09-19)