邵曉青，呂　申，馮　璐，李　梅

(1.大連醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院 科研中心，遼寧 大連 116027；2.大連醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 病理科，遼寧 大連 116011)

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三種熒光染料SYBR GreenⅠ、LCGreen PLUS、EvaGreen在實時定量PCR應(yīng)用中的比較

邵曉青1，呂申1，馮璐2，李梅1

(1.大連醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院 科研中心，遼寧 大連 116027；2.大連醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 病理科，遼寧 大連 116011)

目的探討定量PCR中三種熒光染料SYBR GreenⅠ、LC Green PLUS、EvaGreen定量效果的差異。方法以三個樣品基因組DNA為模板，應(yīng)用巢氏PCR法先擴增G6PDH大片段，純化回收產(chǎn)物，定量，并分別以10倍、5倍和2倍倍比稀釋，作為定量PCR制作標準曲線的模板。應(yīng)用real-time PCR儀指定試劑盒檢測模板質(zhì)量，再分別以含有相同Taq酶并分別含有SYBR GreenⅠ、LC Green PLUS、EvaGreen染料的試劑進行小片段定量PCR擴增，每個濃度3復(fù)孔。標準曲線擬合，結(jié)果分析用儀器自帶分析軟件完成。結(jié)果應(yīng)用三種熒光染料獲得的標準曲線回歸系數(shù)≥0.98(除1個樣品為0.97)，10倍、5倍梯度稀釋標準曲線PCR效率為0.8～1.0，2倍稀釋標準曲線PCR效率應(yīng)用SYBR GreenⅠ有2/3樣品>1.2，而后兩種染料為0.9～1.2。應(yīng)用SYBR GreenⅠ較另兩種染料的標準曲線誤差較大，且樣品間分散度也較大。結(jié)論在定量PCR中飽和染料LC Green PLUS、EvaGreen的定量效果好于SYBR GreenⅠ。

定量PCR；SYBR GreenⅠ；LC Green PLUS；EvaGreen

[引用本文]邵曉青，呂申，馮璐，等.三種熒光染料SYBR GreenⅠ、LCGreen PLUS、EvaGreen在實時定量PCR應(yīng)用中的比較[J].大連醫(yī)科大學學報，2016,38(5)：428-431.

實時定量PCR(quantitative real-time PCR, qPCR)是重要的生物、醫(yī)學研究方法之一，廣泛應(yīng)用于mRNA、miRNA等基因表達定量分析，基因拷貝數(shù)變異(CNV)分析，線粒體DNA檢測，基因甲基化分析，異源基因檢測等[1-2]。探針法和染料法是進行實時定量PCR定量分析的兩種基本方法。探針法雖然定量分析相對敏感，但熒光探針設(shè)計較復(fù)雜，依據(jù)目的片段序列不同有時需要設(shè)計多條探針進行條件優(yōu)化，另外探針合成費用較高，探針保存條件要求比較嚴格。染料法無需探針合成，熒光染料較探針易于保存，價格也較低，因此在定量分析研究中染料法更受研究者青睞。

自1997年美國猶他大學C.T. Wittwer教授報道將不飽和DNA雙鏈染料SYBR GreenⅠ用于實時定量PCR，染料法實時定量PCR技術(shù)迅速推廣應(yīng)用于各類生物、醫(yī)學研究，SYBR GreenⅠ也成為定量PCR的標志性熒光染料[3]。但該染料對PCR反應(yīng)有一定的抑制作用，染料濃度以及染料與反應(yīng)體系組成，如各離子濃度等都需要繁瑣和嚴格的優(yōu)化，才能實現(xiàn)良好的定量分析目的[4]。因此，目前染料法定量PCR大多應(yīng)用商家優(yōu)化好的SYBR GreenⅠ定量試劑盒完成。這樣雖然使實驗操作變得簡單，易于操作，但無疑也使實驗設(shè)計缺少按需設(shè)計的靈活性。LCGreen PLUS、EvaGreen是常用于高分辨熔解曲線分析的飽和DNA雙鏈熒光染料，國外有報道這兩種染料可用于定量PCR，但國內(nèi)尚缺乏相關(guān)研究。本研究應(yīng)用三種熒光染料構(gòu)建濃度梯度的定量標準曲線，通過統(tǒng)計學分析比較三者用于定量分析的差異。

1　材料和方法

1.1實時定量PCR標準曲線DNA模板制備

應(yīng)用本實驗室提取并保存的三個基因組DNA樣品(S1，S2分別為非小細胞肺癌NCI-H1975，NCI-H2228細胞系gDNA，細胞系均購自南京科佰生物科技有限公司；S3為2008年大連醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院手術(shù)切除肺癌癌旁肺組織，經(jīng)病理學證實為非癌的肺組織的gDNA)為模板，上下游引物分別為：5′-TAAACTCCCGACCTCCAATG-3′和5′-CTGGACCCTCTATGGCTGAG-3′，PCR擴增G6PDH基因片段(960 bp)。PCR反應(yīng)體系(20 μL)組成：Ex Taq?HS (TaKaRa)0.025 Ut/μL，1× Ex Taq Buffer，dNTP 200 μmol/L，上下游引物各0.5 μmol/L，gDNA模板5 ng。PCR反應(yīng)條件為：98 ℃ 10 s，60 ℃ 10 s，72 ℃ 40 s，共50個循環(huán)。每個樣品3復(fù)孔，瓊脂糖凝膠(2%)電泳明確單一特異性條帶，DNA純化回收(GeneJETTMGel Extraction Kit，F(xiàn)ermentas)。應(yīng)用Nanodrop2000(Thermo Scientific)測定濃度，并計算拷貝數(shù)。起始濃度為1.5×107拷貝數(shù)/μL，分別進行10倍和5倍連續(xù)7次梯度稀釋，以1.5×103拷貝數(shù)/μL為起始濃度進行2倍連續(xù)7次梯度稀釋，作為定量PCR標準曲線DNA模板。

1.2濃度梯度標準曲線定量PCR擴增和熔解曲線分析

應(yīng)用Real-time PCR儀器(Roche: LightCycler?96)染料法定量啟動試劑盒(含SYBGreen Ⅰ)，TaKaRa公司染料法定量試劑盒(含Ex Taq?HS 和SYBR Green Ⅰ)和應(yīng)用TaKaRa公司Ex Taq?HS PCR試劑盒分別加入LCGreen Plus(BioFire Defense)和EvaGreen(Biotium)熒光染料進行定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系按試劑盒推薦配制，以上述3個濃度梯度(10×，5×，2×)稀釋好的DNA片段為模板(1 μL)，上下游引物各0.5 μmol/L(序列為：5′-GGAAAAGGAATGGCAGACAA-3′和5′-CCCCACAGTACATCGCTTTC-3′，產(chǎn)物長度76 bp)。LCGreen PLUS和EvaGreen均為0.5×。PCR反應(yīng)條件(Roche試劑盒)為：95 ℃ 10 min預(yù)變性，95 ℃ 10 s，60 ℃ 10 s，72 ℃ 40 s，共50個循環(huán)。TaKaRa試劑盒為：98 ℃ 10 s，60 ℃ 10 s，72 ℃ 40 s，共50個循環(huán)。反應(yīng)體系10 μL，覆蓋2滴石蠟油，每個樣品濃度設(shè)3復(fù)孔。

所有樣品，PCR反應(yīng)結(jié)束后，都進行1次95 ℃ 10 s，65 ℃ 到97 ℃的熔解曲線檢測。

1.3數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采集，PCR反應(yīng)效率，標準曲線線性擬合及誤差估計等均應(yīng)用LightCycler?96儀器自帶分析軟件(v1.1)完成。

2　結(jié)　果

2.1梯度稀釋DNA片段模板質(zhì)量檢測

熔解曲線分析顯示10倍和5倍稀釋樣品最高濃度(1.5×107拷貝數(shù)/μL)均有非特異性擴增，樣品S2、S3的1.5×106拷貝數(shù)/μL濃度對10倍稀釋定量標準曲線擬合優(yōu)化有影響，樣品S1的3.0×106拷貝數(shù)/μL濃度對5倍稀釋定量標準曲線擬合優(yōu)化有影響。模板DNA來源于細胞還是組織對定量標準曲線沒有區(qū)別。去除10倍、5倍稀釋1～2個最高濃度，以及各稀釋梯度中由于加樣誤差導(dǎo)致的異常值復(fù)孔，各樣品3個梯度稀釋定量標準曲線都得到最佳優(yōu)化，回歸系數(shù)(R2)≥0.98(除了樣品S1在2倍稀釋標準曲線為0.97)，PCR反應(yīng)效率為0.8～1。圖1顯示樣品S1各梯度稀釋的擴增曲線和定量標準曲線。

2.2三種熒光染料的定量擴增和熔解曲線分析

應(yīng)用含SYBR GreenⅠ的定量試劑盒(TaKaRa)和與該試劑盒相同的Taq酶配制的含LC Green Plus、EvaGreen的定量PCR反應(yīng)體系擴增3個DNA來源的3個梯度稀釋全部樣品。依據(jù)上述模板質(zhì)量檢測結(jié)果，去除相應(yīng)10倍、5倍稀釋的1～2個最高濃度，熔解曲線顯示均為單一熔解峰的特異性擴增。去除各濃度復(fù)孔中的異常值，進行定量標準曲線計算。不同樣品3個梯度稀釋定量標準曲線計算結(jié)果見表1。

圖1　樣品S1的PCR擴增曲線和定量標準曲線(Roche試劑盒)Fig 1 Amplification curves and standard curves in sample S1 by 10-fold,5-fold,2-fold dilution (Roche kit)10-f、5-f、2-f分別為10倍、5倍和2倍三個濃度梯度稀釋；不同顏色表示不同濃度，每個濃度3復(fù)孔

10-f斜率截距效率R25-f斜率截距效率R22-f斜率截距效率R2SYBRGreenⅠ S1-3.8334.700.830.99-3.5133.310.930.99-2.5032.201.510.98 S2-3.3732.850.980.99-3.6132.770.891.00-2.7332.791.330.97 S3-3.8735.120.930.99-3.8335.550.830.98-3.5133.880.930.99LCGreenPlus S1-3.6634.610.881.00-3.3933.410.971.00-3.0532.781.130.99 S2-3.3232.961.001.00-3.5733.600.911.00-3.5732.411.170.98 S3-3.4834.010.941.00-3.6535.290.880.98-3.3733.830.980.99EvaGreen S1-3.7334.710.851.00-3.4533.720.951.00-3.4434.120.950.98 S2-3.3732.990.980.99-3.6033.490.901.00-3.2232.721.040.99 S3-3.7035.070.861.00-3.7335.190.850.99-3.4733.690.940.99

三種熒光染料定量PCR在三個樣品各梯度稀釋的標準曲線的線性回歸均系數(shù)均能在0.98以上(除了SYBR GreenⅠ試劑盒的樣品S2)，10倍和5倍稀釋的標準曲線計算得到的PCR反應(yīng)效率在0.8～1.0， 而2倍稀釋的標準曲線PCR反應(yīng)效率略有差別：SYBR GreenⅠ試劑盒樣品S1和S2反應(yīng)效率>1.2，應(yīng)用LCGreen PLUS和EvaGreen反應(yīng)效率在0.9～1.2。由于上樣誤差導(dǎo)致異常Cq值的復(fù)孔在三種熒光染料定量試劑10倍、5倍梯度稀釋標準曲線中都較少(不到所有上樣數(shù)的5%)，但對2倍稀釋標準曲線各染料試劑出現(xiàn)異常值的復(fù)孔數(shù)差異較大(3個樣品共63個標準曲線上樣點)：應(yīng)用LCGreen PLUS試劑無異常復(fù)孔，應(yīng)用EvaGreen共有6個，TaKaRa公司SYBR GreenⅠ試劑盒共有8個，Roche公司試劑盒共有16個。

2.3三種熒光染料定量擴增的標準曲線誤差分析

三個樣品不同熒光染料定量擴增的標準曲線由誤差值和斜率獲得的樣品定量估計誤差分布見圖2，可以看出應(yīng)用飽和熒光染料LCGreen PLUS和EvaGreen獲得的標準曲線定量估計的誤差較小，且樣品間差異較小，而應(yīng)用SYBR GreenⅠ的兩種試劑盒樣品間定量誤差分散度較大(可達理論樣品濃度的1.1～1.6倍)。另外，無論應(yīng)用哪種熒光染料試劑，樣品定量檢測誤差有隨標準曲線樣品間梯度稀釋增大而減小的趨勢。

圖2　不同染料試劑盒標準曲線估計誤差造成的樣品定量濃度誤差分布Fig 2 The distribution of concentration ratio (error concentration/theory concentration) among different dyes 縱坐標為Cq誤差值造成的定量濃度誤差與理論濃度比值，橫坐標為不同染料，其中SYB(R)為Roche試劑盒，SYB為TaKaRa試劑盒；不同梯度稀釋如圖例

3　討　論

染料法熒光定量PCR操作簡便、快速、檢測靈敏度高，廣泛用于生物、醫(yī)學等科研的核酸定量分析中。但是從樣品保存處理、核酸提取、反轉(zhuǎn)錄效果、引物設(shè)計和選擇、定量PCR體系、條件優(yōu)化到數(shù)據(jù)分析等多方面的處理不當都能影響核酸定量分析結(jié)果的準確性，以至于不同實驗室報道的結(jié)果出現(xiàn)較大偏差，甚至完全相反。為了得到可靠的結(jié)果，減少實驗室之間數(shù)據(jù)偏差，歐美等多國2009年聯(lián)合發(fā)布了針對qPCR實驗的指南(The MIQE Guidelines)，用以規(guī)范qPCR實驗設(shè)計、實驗具體過程、數(shù)據(jù)分析和文章報道。目前，該指南已經(jīng)成為qPCR實驗數(shù)據(jù)發(fā)表的規(guī)范[5]。

染料法qPCR定量也有自身局限性。即使引物設(shè)計，PCR條件等關(guān)鍵環(huán)節(jié)都得到最佳優(yōu)化，樣品間上樣誤差、隨機誤差也是導(dǎo)致定量敏感性下降的重要原因。根據(jù)泊松分布概率計算，理論上，95%概率能檢測檢測到模板(limit of detection, LOD)至少需要3個拷貝[6]。模板拷貝數(shù)過高，會導(dǎo)致PCR抑制，非特異性擴增的增加等，如本實驗中梯度稀釋最高濃度在應(yīng)用Roche試劑盒擴增時，均出現(xiàn)了非特異性擴增。因此實驗前對含有待測片段的模板拷貝數(shù)初步估計是保證定量檢測靈敏性和特異性的必要環(huán)節(jié)。由于隨機誤差導(dǎo)致每次上樣模板拷貝數(shù)的差異會造成定量結(jié)果的誤差，通過增加實驗重復(fù)次數(shù)可以盡可能提高檢測敏感性，例如對于一般95%可信區(qū)間的定量結(jié)果，如果從2個拷貝中定量得到1個拷貝差異至少需要4～5次重復(fù)，從4個拷貝中定量得到3個拷貝差異至少需要11～12次重復(fù)[7]。對于實驗不能達到一定重復(fù)次數(shù)時，只能犧牲檢測靈敏度。按標準曲線回歸系數(shù)和PCR效率評估三種熒光染料試劑獲得的不同濃度梯度稀釋標準曲線基本都能滿足一般定量要求，但標準曲線回歸的誤差分布有所不同，根據(jù)回歸標準曲線的各自誤差值和斜率可以得到因為誤差造成的樣品定量產(chǎn)生的誤差。本次實驗應(yīng)用3次重復(fù)(3復(fù)孔)制作標準曲線，去除異常Cq值復(fù)孔，定量估計誤差達到理論值的1.1～1.6倍。應(yīng)用LCGreen PLUS和EvaGreen做定量時，誤差有所減低，但還需要增加實驗重復(fù)次數(shù)進一步驗證。

不同于SYBR GreenⅠ，LCGreen PLUS和EvaGreen都是飽和雙鏈DNA熒光染料，常用于高分辨熔解曲線基因變異掃描(gene mutation scan)和基因分型(genotype)分析[8-9]。因為對PCR沒有抑制作用，這兩種染料可以根據(jù)具體引物，待擴增目的片段序列實際情況自由調(diào)整優(yōu)化反應(yīng)體系，不受染料干擾的限制。本實驗結(jié)果表明LCGreen PLUS和EvaGreen可用于qPCR的定量分析，而且樣品間定量均一性，異常復(fù)孔出現(xiàn)頻率均優(yōu)于SYBR GreenⅠ試劑盒。

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Comparison of SYBR GreenⅠ, LCGreen PLUS, EvaGreen in quantitative real-time PCR

SHAO Xiao-qing1, LV Shen1, FENG Lu2, LI Mei1

(1.ScientificResearchCenter，theSecondAffiliatedHospitalofDalianMedicalUniversity，Dalian116027，China; 2.PathologyDepartment,theFirstAffiliatedHospitalofDalianMedicalUniversity，Dalian116011)

Objective To compare with SYBR GreenⅠ, LCGreen PLUS, EvaGreen in quantitative real-time PCR (qPCR). Methods Large G6PDH fragment (960 bp) was amplified from 3 gDNA samples by nest PCR. PCR products were purified and quantified, then diluted 7 times with 10-, 5-, 2-fold as the templates of qPCR. The quality of templates was tested with qPCR kit of Roche, which is the start kit of the qPCR instrument.Short G6PDH fragment (76 bp) was amplified by qPCR with the same Taq enzyme and different dye, SYBR GreenⅠ, LCGreen PLUS, EvaGreen respectively. Commercial software was used to analyze data.Results R2of all standard curves from 3 dyes were equal or more than 0.98 (0.97 in a sample). PCR efficiency of 10-fold and 5-fold dilution standard curve were 0.8-1.0 in all 3 dyes. PCR efficiency of 2-fold dilution was spacemore than 1.2 in 2/3 samples with SYBR GreenⅠ, while 0.9-1.2 in all others.The estimate error in standard curve with SYBR GreenⅠwas larger and more dispersed than in those with other two dyes.Conclusion Saturated dye, LCGreen PLUS and EvaGreen may be better in quantity of qPCR.

quantitative real-time PCR (qPCR); SYBR GreenⅠ;LC Green PLUS; EvaGreen

國家自然科學青年基金項目(81501832)；國家自然科學基金面上項目(81572919)；遼寧省教育廳一般項目(L2015144)

邵曉青(1990-)，女，山東威海人，碩士研究生。

李 梅，副主任醫(yī)師。E-mail：rosemaryli80@163.com

??著

10.11724/jdmu.2016.05.03

R331

A

1671-7295(2016)05-0428-04

2016-06-27；

2016-09-09)