王　輝，庫莉博，徐國權(quán)，趙志華，馬　莉

(1. 唐山職業(yè)技術(shù)學(xué)院 口腔系，河北 唐山 063000；2. 華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院 口腔科，河北 唐山 063000)

?

唾液代謝組學(xué)方法對(duì)早期牙周炎的快速鑒定

王輝1，庫莉博1，徐國權(quán)2，趙志華1，馬莉1

(1. 唐山職業(yè)技術(shù)學(xué)院 口腔系，河北 唐山 063000；2. 華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院 口腔科，河北 唐山 063000)

目的探討將基于氫譜核磁共振(1H-NMR)的代謝組學(xué)方法應(yīng)用于牙周炎患者和健康個(gè)體鑒定的可行性。方法通過血常規(guī)檢測選取符合條件的受試者作為試驗(yàn)組和對(duì)照組，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析試驗(yàn)組與對(duì)照組的基本指標(biāo)的差異；收集唾液進(jìn)行核磁共振檢測，比較圖譜的差異；利用多元統(tǒng)計(jì)分析相關(guān)數(shù)據(jù)研究聚類關(guān)系。結(jié)果統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示試驗(yàn)組與對(duì)照組在白細(xì)胞計(jì)數(shù)、淋巴細(xì)胞百分比、中性粒細(xì)胞百分比三個(gè)方面無明顯差異(P>0.05)。牙周炎患者的圖譜與健康個(gè)體的圖譜比較在δ 3.0～4.0和δ 2.0～2.6區(qū)域以及δ 1.0附近的波峰有明顯的變化。主成分分析和偏最小二乘判別分析顯示，牙周炎患者和健康個(gè)體相應(yīng)的數(shù)據(jù)內(nèi)部有集中的聚類關(guān)系。結(jié)論基于氫譜核磁共振的代謝組學(xué)方法可以區(qū)分牙周炎患者和健康個(gè)體，代謝組學(xué)方法有望在早期牙周炎的快速診斷中成為一種新的檢測手段。

牙周炎；唾液；代謝組學(xué)；核磁共振

[引用本文]王輝，庫莉博，徐國權(quán)，等.唾液代謝組學(xué)方法對(duì)早期牙周炎的快速鑒定[J].大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2016,38(5)：440-443.

牙周炎是牙周組織的一種慢性感染性疾病，是口腔主要疾病之一。由于早期多無明顯自覺癥狀而易被忽視，待有癥狀時(shí)已較嚴(yán)重，甚至導(dǎo)致牙齒不能保留。因而早期的診斷和治療顯得尤為重要。對(duì)于牙周炎患者的診斷，一般采用臨床牙周病指數(shù)(CPDI)、牙周袋內(nèi)深度和細(xì)菌學(xué)改變來判定[1]。這些方法往往缺乏客觀性數(shù)據(jù)，而以醫(yī)師的主觀判斷為主。

代謝組學(xué)是一門“在新陳代謝的動(dòng)態(tài)進(jìn)程中，系統(tǒng)研究代謝產(chǎn)物的變化規(guī)律，揭示機(jī)體生命活動(dòng)代謝本質(zhì)”的學(xué)科。近年來被越來越多地應(yīng)用到生物技術(shù)的各個(gè)領(lǐng)域，監(jiān)測和評(píng)估一些代謝物的變化以便更全面地分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)[2]。Wong等[3]建立了專業(yè)唾液組學(xué)數(shù)據(jù)庫(salivaomics knowledge base, SKB)，系統(tǒng)性管理有關(guān)唾液研究方面的數(shù)據(jù)資料。Goldsmith 等[4]認(rèn)為代謝組學(xué)在臨床疾病診斷有重要的作用。而且，近年來對(duì)于唾液的基礎(chǔ)研究備受關(guān)注，唾液在疾病早期診斷中具有較明顯的優(yōu)勢[5]。

本研究通過收集牙周炎患者和健康個(gè)體的唾液，運(yùn)用代謝組學(xué)的方法分析它們的聚類關(guān)系，嘗試將基于氫譜核磁共振(1H-nuclear magnetic resonance, 1H-NMR)[6]的代謝組學(xué)方法應(yīng)用于早期牙周炎的鑒定。

1　材料和方法

1.1主要試劑和儀器

重水(D2O, 99.8%)(北京百靈威科技有限公司，Cat.261750)，3-三甲基甲硅烷基丙酸-d4鈉鹽(TSP-d4) (Cambridge Isotope Laboratories Inc., MA, USA)，直徑5 mm核磁管(Landisville, NJ, USA)，-80 ℃低溫冰箱(Heto Ultra, USA)，DRX600核磁共振儀(Bruker Biospin Rheinstetten, Germany)，分析軟件SIMCA-P v11.0(Umea, Sweden)。

1.2試驗(yàn)對(duì)象

試驗(yàn)對(duì)象從2015年10月—12月華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院口腔科就診患者中選擇，年齡27～50歲。全部受試者在人工光源下行常規(guī)口腔檢查，應(yīng)用口鏡和CPI 探針檢測全口的牙齦出血指數(shù)、牙周袋深度(PD)、附著喪失(AL)和牙齒松動(dòng)度，全部口腔檢查均由同一口腔專業(yè)醫(yī)師進(jìn)行。按照牙周炎嚴(yán)重程度分組標(biāo)準(zhǔn)[7]：牙齦存在炎癥、探診時(shí)出血，PD不超過4 mm，AL 在1～2 mm者判定為輕度牙周炎者。檢查結(jié)束后，抽取靜脈血 2 mL作血常規(guī)檢查。在符合血常規(guī)基本指標(biāo)在正常水平范圍的前提下，選擇10名輕度牙周炎作為試驗(yàn)組，男女比例1∶1，同時(shí)選取同樣條件的10名健康個(gè)體(來自華北工理大學(xué)在校師生)作為對(duì)照。所有參試者均無全身性疾??；婦女未處于懷孕期及哺乳期；半年內(nèi)未做過牙周基礎(chǔ)治療；未服用過抗生素，患牙無齲壞。均知情同意。

1.3方法

1.3.1唾液采集處理與NMR樣本制備

按照Rhodus改良的方法[8]，收集所有參試者非刺激性全唾液，采集時(shí)間為上午9:00～11:00，采集前禁食1 h，并用蒸餾水漱口。采集時(shí)參試者向4 ℃無菌Eppendorf管內(nèi)吐出，持續(xù)5 min。所得唾液樣本于-80 ℃保存。將所有樣本在4 ℃，15000 r/min，離心15 min。取上清1 mL加入1/2體積的0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液，混勻后靜置10 min。4 ℃，15000 r/min，離心10 min，取上清500 μL，加入D2O 250 μL，混勻后取500 μL移入已滅菌的直徑為5 mm的NMR管，密封管口，置于-80 ℃低溫冰箱保存。測試前取出，解凍并在0 ℃存放。

1.3.2核磁共振圖譜的采集和處理

本試驗(yàn)采用600M氫譜核磁共振對(duì)樣品進(jìn)行檢測，設(shè)置參數(shù)為：譜寬11261.262 Hz，采樣點(diǎn)數(shù)32 K，疊加次數(shù)64次，飽和頻率和中心頻率都在水峰位置。所有樣本的掃描溫度設(shè)置為300 K，每個(gè)樣本核磁掃描均收集到65536個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)，以D2O為溶劑，經(jīng)檢測得到所測樣本的原始自由感應(yīng)衰減信號(hào)(Free Induction Decay, FID)數(shù)據(jù)。將這些FID信號(hào)導(dǎo)入MestReC v4.9.9.6軟件進(jìn)行傅立葉轉(zhuǎn)換(Fourier Transform, FT)，相位校正和基線校正等一系列的操作后獲得相位滿意、對(duì)稱性較好的1H-NMR圖譜。并將TSP-d4的信號(hào)峰值定為0。調(diào)用軟件中的工具對(duì)已處理的圖譜進(jìn)行譜以δ 0.04為單位進(jìn)行分段積分，積分區(qū)域選定在δ 0.0～4.0，每個(gè)樣品得到100個(gè)對(duì)應(yīng)的積分值，所有樣本的1H-NMR圖譜都進(jìn)行同樣的分段積分后，將所有的積分值導(dǎo)入到Excel文件中保存。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

對(duì)于試驗(yàn)對(duì)象的選取采用兩總體方差未知的t檢驗(yàn)，評(píng)估血常規(guī)檢測指標(biāo)是否存在差異；運(yùn)用SIMCA-P v11.0軟件對(duì)1H-NMR采集處理的積分?jǐn)?shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析(principal components analysis, PCA)和偏最小二乘判別分析(partial least squares discriminant analysis, PLS-DA)，研究牙周炎患者和健康個(gè)體的聚類關(guān)系。

2　結(jié)　果

2.1試驗(yàn)對(duì)象基本指標(biāo)統(tǒng)計(jì)結(jié)果

試驗(yàn)組與對(duì)照組在白細(xì)胞計(jì)數(shù)、淋巴細(xì)胞百分比、中性粒細(xì)胞百分比三個(gè)方面無明顯差異(P>0.05)。見表1。

表1研究樣本基本指標(biāo)總體統(tǒng)計(jì)結(jié)果

Tab 1 The overall statistical results of the basic parameters of the study samples

分組白細(xì)胞計(jì)數(shù)(×109)淋巴細(xì)胞 (%)中性粒細(xì)胞(%)試驗(yàn)組7.1±1.41)38.9±3.41)56.7±4.51)對(duì)照組6.3±1.636.5±2.558.8±5.7

1)與對(duì)照組相比，P均>0.05。表中白細(xì)胞計(jì)數(shù)正常水平(4～10)×109，淋巴細(xì)胞百分比正常水平20%～40%，中性粒細(xì)胞百分比正常水平50%～70%；試驗(yàn)組為牙周炎患者，對(duì)照組為健康個(gè)體

2.2核磁共振檢測結(jié)果

將牙周炎患者和健康個(gè)體的代謝圖譜進(jìn)行比較可見：牙周炎患者的圖譜在δ 3.0～4.0和δ 2.0～2.6區(qū)域的波峰與健康個(gè)體的圖譜比較有較明顯不同(圖1)，而且圖1B在δ 1.0 附近的波峰有明顯的升高。

2.3多元統(tǒng)計(jì)分析

圖2和圖3分別是主成分分析得分圖和偏最小二乘判別分析得分圖，橢圓形區(qū)域代表95%的置信區(qū)間。圖中顯示健康個(gè)體和牙周炎患者呈現(xiàn)良好的聚類，雖然它們有的較為分散，但是健康個(gè)體和牙周炎患者之間并無交叉與重疊，它們之間可以有效區(qū)分。而且偏最小二乘判別分析的類聚效果要優(yōu)于主成分分析。

圖1　健康個(gè)體和牙周炎患者唾液的1H-NMR圖譜Fig 1 The saliva 1H-NMR spectra of healthy individuals and periodontitis patientsA:健康個(gè)體；B:牙周炎患者。(1)：δ 3.0～4.0區(qū)域；(2)：δ 2.0～2.6區(qū)域；(3)：δ 1.0 附近

圖2　主成分分析得分圖Fig 2 The score plot of principal components analysis

圖3　偏最小二乘判別分析得分圖Fig 3 The score plot of partial least squares discriminant analysis

3　討　論

代謝組學(xué)是后基因組學(xué)時(shí)期新興的一門學(xué)科，已經(jīng)成為系統(tǒng)生物學(xué)的一個(gè)重要組成部分。和基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)這三大“組學(xué)”技術(shù)相比，代謝組學(xué)可以更全面地解釋實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)[9]，進(jìn)一步完善了系統(tǒng)生物學(xué)的技術(shù)平臺(tái)。

本研究在符合白細(xì)胞計(jì)數(shù)、淋巴細(xì)胞百分比、中性粒細(xì)胞百分比在正常水平范圍的前提下，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示試驗(yàn)組與對(duì)照組在白細(xì)胞計(jì)數(shù)、淋巴細(xì)胞百分比、中性粒細(xì)胞百分比三個(gè)方面無明顯差異(P>0.05)，說明所選入試驗(yàn)組與對(duì)照組的研究個(gè)體在基本生理指標(biāo)方面做到了組間平衡。收集唾液制取樣本經(jīng)核磁共振檢測后，發(fā)現(xiàn)牙周炎患者的圖譜與健康個(gè)體的圖譜比較在δ 3.0～4.0和δ 2.0～2.6區(qū)域以及δ 1.0 附近的波峰有明顯的變化，這些變化均說明牙周炎患者和健康個(gè)體的代謝存在著差異。通過主成分分析和偏最小二乘判別分析顯示健康個(gè)體和牙周炎患者都有良好的聚類效果，這種方法可以很好地區(qū)別健康個(gè)體和牙周炎患者。在進(jìn)行數(shù)據(jù)分析時(shí)，為了充分提取數(shù)據(jù)中的潛在信息，需要應(yīng)用多元統(tǒng)計(jì)分析方法。無監(jiān)督性的主成分分析(PCA)和監(jiān)督性的偏最小二乘判別分析(PLS-DA)是常用的分析方法。主成分分析是用降維的思想，將原來復(fù)雜的變量重新組合成一組新的互相無關(guān)的綜合指標(biāo)來代替原來的指標(biāo)，是考察多個(gè)變量間相關(guān)性的一種多元統(tǒng)計(jì)方法。雖然運(yùn)用PCA有一定的分類效果，但往往有較多重疊，而且在組內(nèi)聚集和組間離散方面分析效果明顯弱于PLS-DA。而偏最小二乘判別分析可以通過釆用響應(yīng)置換檢驗(yàn)判斷模型是否穩(wěn)定可靠，它可以進(jìn)一步放大組間差異最終對(duì)差異性的代謝物進(jìn)行指認(rèn)[10]。

代謝組學(xué)的相關(guān)研究經(jīng)過這幾年的發(fā)展，方法日趨成熟，目前，基于核磁共振代謝組學(xué)已被應(yīng)用到很多領(lǐng)域，其在臨床疾病診斷的應(yīng)用也逐漸增多，如心血管系統(tǒng)疾病診斷、腫瘤的早期診斷等[11-13]。而且在口腔癌[14]的早期臨床診斷和研究中，代謝組學(xué)也顯示出了巨大的應(yīng)用價(jià)值。后續(xù)研究將針對(duì)偏最小二乘判別分析中的VIP圖和權(quán)系圖尋找能夠用于鑒別早期牙周炎的差異代謝物。代謝組學(xué)正將在未來生物技術(shù)領(lǐng)域中將扮演重要的角色，期待這項(xiàng)新的技術(shù)在牙周炎早期診斷中成為一個(gè)有用的檢測工具。

[1] 張儂，付云，張祖雄．奈普生替硝唑局部給藥對(duì)成人牙周炎療效對(duì)比評(píng)價(jià)[J]．臨床口腔醫(yī)學(xué)雜志，1997，13(4)：227-229．

[2] 王輝，趙志華，徐國權(quán)，等．耐藥口腔鱗癌Tca8113胞外代謝產(chǎn)物的代謝組學(xué)分析[J]．第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2016，38(4)：396-400．

[3] Wong DT. Salivaomics[J]. J Am Dent Assoc, 2012, 143(10 Suppl):19S-24S.

[4] Goldsmith P, Fenton H, Morris-Stiff G, et al. Metabonomics: a useful tool for the future surgeon[J]. J Surg Res, 2010, 160(1):122-132.

[5] 程興群，鄧盟，徐欣，等．唾液和唾液組學(xué)與疾病早期診斷[J]．國際口腔醫(yī)學(xué)雜志，2014，41(2)：213-219．

[6] Wang H, Chen J, Feng Y, et al. 1H nuclear magnetic resonance-based extracellular metabolomic analysis of multidrug resistant Tca8113 oral squamous carcinoma cells[J]. Oncology lett, 2015, 9(6): 2551-2559.

[7] 張麗，桑曉紅，劉健，等．農(nóng)村維吾爾族慢性牙周炎與糖代謝異常相關(guān)性的研究[J]．新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，33(9)：1125-1131．

[8] Rhodus NL, Cheng B, Myers S, et al. A comparison of the pro-inflammatory, NF-kappaB-dependent cytokines: TNF-alpha, IL-1-alpha, IL-6, and IL-8 in different oral fluids from oral lichen planus patients[J]. Clin Immunol, 2005, 114(3):278-283.

[9] Shah SH, Newgard CB. Integrated metabolomics and genomics: systems approaches to biomarkers and mechanisms of cardiovascular disease[J]. Circ Cardiovasc Genet, 2015, 8(2):410-419.

[10] 阿基業(yè)．代謝組學(xué)數(shù)據(jù)處理方法—主成分分析[J]．中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2010，15(5)：481-489．

[11] Soininen P, Kangas AJ, Würtz P, et al. Quantitative serum nuclear magnetic resonance metabolomics in cardiovascular epidemiology and genetics[J]. Circ Cardiovasc Genet, 2015, 8(1):192-206.

[12] Zeng J, Huang X, Zhou L, et al. Metabolomics Identifies Biomarker Pattern for Early Diagnosis of Hepatocellular Carcinoma: from Diethylnitrosamine Treated Rats to Patients[J]. Sci Rep, 2015, 3(5):16101.

[13] Lin Y, Ma C, Liu C, et al. NMR-based fecal metabolomics fingerprinting as predictors of earlier diagnosis in patients with colorectal cancer[J]. Oncotarget, 2016, 7(20): 29454-29464.

[14] Tiziani S, Lopes V, Günther UL. Early stage diagnosis of oral cancer using 1H NMR-based metabolomics[J]. Neoplasia, 2009, 11(3): 269-276.

A quick identification of patients with early stage periodontitis using saliva metabolomics

WANG Hui1, KU Li-bo1, XU Guo-quan2, ZHAO Zhi-hua1, MA Li1

(1.DepartmentofStomatology,TangshanVocational&TechnicalCollege,Tangshan063000,China; 2.DepartmentofStomatology,AffiliatedHospitalofNorthChinaUniversityofScienceandTechnology,Tangshan063000,China)

Objective To study 1H-NMR based metabolomics method in early stage identification of patients with periodontitis. Methods The subjects were divided as the experimental group and the control group by blood routine test, and the differences of basic indicators in the experimental group and control group was analyzed by statistical analysis. The saliva was collected for nuclear magnetic resonance, and the difference between the spectra was preliminarily compared. The clustering relations of all the data was studied by multivariate statistical analysis. Results Statistical analysis showed that leukocyte count, lymphocyte percentage and neutrophil percentage in the experimental group and control group had no significant difference (P>0.05). The obvious changes were observed in the area of δ 3.0～4.0, δ 2.0～2.6 and around δ 1.0 in the spectra of periodontitis patients and healthy individuals. The principal component analysis and partial least-squares discriminant analysis showed that concentrated clustering relations in the internal data of periodontitis patients and healthy individuals. Conclusion 1H-NMR based metabolomics method could distinguish between periodontitis patients and healthy individuals. The metabolomics method is expected to be a new detection method in the early quick diagnosis of periodontitis.

periodontitis; saliva; metabolomics; nuclear magnetic resonance (NMR)

河北省高等學(xué)校科學(xué)技術(shù)研究青年基金項(xiàng)目(QN2015301; QN2016303)

王 輝(1984-)，男，山西大同人，講師。E-mail:wkate@126.com

??著

10.11724/jdmu.2016.05.06

R781.4

A

1671-7295(2016)05-0440-04

2016-05-26;

2016-09-04)