王　　平，郭曉宇，高　　宇△，何建秋，宋　　娜，劉曉燕

（1.承德醫(yī)學院，河北承德　067000；2.承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院內分泌科）

利拉魯肽降低高脂喂養(yǎng)大鼠胰腺GRP78的表達

王平1，郭曉宇2，高宇2△，何建秋2，宋娜2，劉曉燕2

（1.承德醫(yī)學院，河北承德067000；2.承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院內分泌科）

目的：通過觀察利拉魯肽對高脂喂養(yǎng)大鼠胰腺GRP78表達的影響，探討利拉魯肽對胰腺內質網應激的作用。方法：雄性Wistar大鼠24只隨機分為對照組、高脂組、干預組1（低劑量利拉魯肽100μg/kg/ d皮下注射2周）、干預組2（高劑量利拉魯肽200μg/kg/d皮下注射2周），每組6只。分別檢測各組大鼠的空腹血糖（FBG）、空腹胰島素（FINS）、血清游離脂肪酸（FFA）、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG），并計算HOMA-β。采用Western blotting法和Realtime-PCR技術檢測胰腺GRP78蛋白和mRNA的表達。結果：與對照組相比，高脂組大鼠FBG、FINS、FFA、TC、TG以及胰腺GRP78蛋白和mRNA的表達明顯升高，HOMA-β明顯降低（P＜0.01）；利拉魯肽可呈劑量依賴性地改善高脂喂養(yǎng)大鼠血脂代謝紊亂并降低胰腺GRP78蛋白和mRNA的表達（P＜0.01，P＜0.05）。結論：利拉魯肽可能通過降低胰腺GRP78蛋白和mRNA表達，改善胰腺的內質網應激，從而保護胰島β細胞。

利拉魯肽；葡萄糖調節(jié)蛋白78；內質網應激

2型糖尿病是一種進展性疾病，β細胞功能進行性衰竭是主要原因之一，研究顯示，高脂狀態(tài)不僅使胰島β細胞功能受損，并與內質網應激（ERS）密切相關［1］。胰高血糖素樣多肽-1（GLP-1）類似物利拉魯肽是治療2型糖尿病的新型藥物。有研究發(fā)現(xiàn)利拉魯肽能保護胰島β細胞，但具體機制尚不清楚［2］。本研究應用利拉魯肽對高脂喂養(yǎng)大鼠進行干預，觀察利拉魯肽對大鼠胰腺葡萄糖調節(jié)蛋白78（GRP78）表達的影響，探討利拉魯肽保護胰島β細胞的可能機制。

1 材料與方法

1.1動物與飼料Wistar雄性大鼠24只，體重230-260g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK（京）2012-0001。普通飼料：總熱量為337kCal/100g，碳水化合物64.19%、脂肪12.04%、蛋白質23.77%；高脂飼料：總熱量為486kCal/100g，碳水化合物30.01%、脂肪53.75%、蛋白質16.24%；均購于北京科奧協(xié)力有限公司。

1.2實驗分組大鼠適應性喂養(yǎng)3天，隨機分為對照組、高脂組、干預組1和干預組2，每組6只。對照組使用普通飼料喂養(yǎng)，高脂組、干預組1和干預組2使用高脂飼料喂養(yǎng)；第9周起，干預組1和干預組2分別給予不同劑量利拉魯肽（100μg/kg/d、200μg/kg/d）腹部皮下注射2周。用藥結束后，大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后打開腹腔，腹主動脈取血后處死大鼠，取胰腺入液氮速凍后移入-80℃冰箱保存。

1.3相關指標和測定方法

1.3.1血液指標：全血標本離心取上清，分別檢測空腹血糖（FBG）、游離脂肪酸（FFA）、空腹胰島素（FINS）水平、甘油三酯（TG） 和總膽固醇（TC）。FFA檢測使用ELASIA試劑盒（南京建成生物工程研究所），檢測FBG、FINS、TG和TC使用全自動生化分析儀。

1.3.2計算胰島β細胞功能指數(shù)（HOMA-β）：HOMA-β=20×FINS/（FBG-3.5）。

1.3.3Western blotting法檢測GRP78蛋白表達：提取胰腺總蛋白，按BCA法測定蛋白濃度。10% SDS-PAGE凝膠電泳、轉膜，加入一抗（GRP78 1：200，β-actin 1：400）和二抗（均購自武漢博士德生物工程有限公司），X光膠片曝光。應用Image J 1.49軟件分析，以目的條帶和β-actin條帶的灰度比值作為目的蛋白的相對表達水平。

1.3.4Real-time PCR法檢測GRP78 mRNA表達：提取胰腺總mRNA，逆轉錄合成cDNA。引物序列如下：GRP78：上游引物5-AACCCAGATGAGGCTGTAGCA-3，下游引物5-ACATCAAGCAGAACCAGGTCAC-3；β-actin：上游引物5-ATGCCATCCTGCGTCTGGACCTGGC-3，下游引物5-AGCATTTGCGGTGCACGATGGAGGG-3。以β-actin為內參，得出CT值，通過2-△△Ct法計算GRP78 mRNA的相對表達含量。

1.4統(tǒng)計分析使用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計處理，多組間均數(shù)的比較用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1各組大鼠血液指標結果與對照組相比：高脂組大鼠的FBG、FFA、FINS、TC、TG明顯升高，OMA-β明顯降低（P＜0.01，P＜0.05）。與高脂組相比：干預組1大鼠FFA明顯下降（P＜0.05）；干預組2大鼠FBG、FFA、FINS、TC、TG明顯下降，HOMA-β明顯升高（P＜0.05， P＜0.01）。與干預組1比較：干預組2大鼠的FBG、FFA、TC明顯下降，HOMA-β明顯升高（P＜0.05）。見表1：

表1　四組大鼠血液指標檢測結果（n=6±s ）

表1　四組大鼠血液指標檢測結果（n=6±s ）

與對照組比較：aP＜0.01，bP＜0.05；與高脂組比較：cP＜0.01，dP＜0.05；與干預組1比較：eP＜0.05

對照組　　高脂組　　干預組1　　干預組2 FBG（mmol/L）5.05±0.20　7.59±0.70a　6.88±0.20　5.87±0.40deFFA（mmol/L）0.30±0.04　0.66±0.05a　0.61±0.05d0.32±0.03ceFINS（mmol/L）19.24±0.68　30.93±0.27a29.26±0.3　24.42±0.31cTC（mmol/L）1.05±0.09　1.32±0.07a　1.37±0.05　1.23±0.06deTG（mmol/L）0.16±0.04　0.33±0.02a　0.29±0.02　0.27±0.02dHOMA-β（%）249.66±19.87 151.77±62.07a173.43±69.24 207.3±14.47ce

2.2各組大鼠胰腺GRP78的表達高脂組GRP78蛋白及mRNA表達較對照組大鼠明顯升高（P＜0.01）。干預組1和干預組2大鼠GRP78蛋白及mRNA表達較高脂組大鼠明顯降低（P＜0.01，P＜0.05）；并且，干預組2大鼠GRP78蛋白及mRNA表達較干預組1大鼠明顯降低（P＜0.05）。見附圖，表2。

附圖　各組大鼠胰腺GRP78蛋白的表達

與對照組比較：aP＜0.01；與高脂組比較：bP＜0.05，cP＜0.01；與干預組1比較：dP＜0.05

3 討論

脂毒性可導致胰腺β細胞功能減退，而胰島β細胞功能受損與內質網應激（ERS）密切相關［3-4］。GRP78是ERS的標志性因子，GRP78表達升高說明發(fā)生了ERS。GRP78表達升高，將激活下游肌醇需要酶1α（IRE1α）/X盒結合蛋白1 （XBP1）、RNA依賴的蛋白激酶樣激酶（PERK）/真核翻譯起始因子（elf2α）和轉錄激活因子6（ATF6）三條通路，并以不同方式造成胰腺的損傷，導致胰島β細胞出現(xiàn)功能障礙［5-6］。本研究發(fā)現(xiàn)，高脂組大鼠血脂異常、胰腺GRP78蛋白和mRNA的表達明顯升高、HOMA-β明顯降低，說明高脂飲食喂養(yǎng)大鼠在出現(xiàn)血脂異常的同時，胰腺GRP78表達升高且胰島β細胞功能下降。

GLP-1類似物利拉魯肽是新型降糖藥，以葡萄糖濃度依賴性來降低血糖。研究發(fā)現(xiàn)，利拉魯肽除降糖外，還能改善血脂代謝紊亂［7-8］。本研究亦證實了這一點，利拉魯肽可呈劑量依賴性地改善高脂飲食大鼠的血脂，與國內陳婷等［9］的研究結果一致。本研究還發(fā)現(xiàn)，利拉魯肽干預可明顯降低高脂喂養(yǎng)大鼠胰腺GRP78蛋白和mRNA的表達，并能升高HOMA-β，并且這種作用與利拉魯肽的劑量有關。因此本研究提示，利拉魯肽可能通過降低胰腺GRP78蛋白和mRNA表達，改善胰腺的ERS，從而保護胰島β細胞。

［1］王子婧，宋光耀，李萍.不同脂肪酸飲食對大鼠胰島β細胞功能及內質網應激影響的研究［J］.中國糖尿病雜志，2015，23（6）：562-564.

［2］Zhao L， Guo H， Chen H， et al. Effect of Liraglutide on endoplasmic reticulum stress in diabetes［J］. Biochem Biophys Res Commun， 2013， 441（1）： 133-138.

［3］Cnop M， Ladrière L， Igoillo-Esteve M， et al. Causes and cures for endoplasmic reticulum stress in lipotoxic β-cell dysfunction［J］. Diabetes Obes Metab， 2010， 12（Suppl 2）： 76-82.

［4］Tiano JP， Delghingaro-Augusto V， Le May C， et al. Estrogen receptor activation reduces lipid synthesis in pancreatic islets and prevents β cell failure in rodent models of type 2 diabetes［J］.J Clin Invest， 2011，121（8）： 3331-3342.

［5］Sommerweiss D， Gorski T， Richter S， et al. Oleate rescues INS-1E β-cells from palmitate-induced apoptosis by preventing activation of the unfolded protein response［J］.Biochem Biophys Res Commun， 2013， 441（4）： 770-776.

［6］Jung IR， Choi SE， Jung JG， et al. Involvement of iron depletion in palmitate-induced lipotoxicity of beta cells［J］. Mol Cell Endocrinol， 2015， 15（407）： 74-84.

［7］Vinodraj K， Nagendra Nayak IM， Rao JV， et al. Comparison of the efficacy of liraglutide with pioglitazone on dexamethasone induced hepatic steatosis， dyslipidemia and hyperglycaemia in albino rats［J］. Indian J Pharmacol， 2015， 47（2）： 181-184.

［8］Sélley E， Kun S， Kürthy M， et al. Para-Tyrosine Supplementation Improves Insulin- and Liraglutide-Induced Vasorelaxation in Cholesterol-Fed Rats［J］. Protein Pept Lett， 2015， 22（8）： 736-742.

［9］陳婷，陳璐璐，鄭涓，等.利拉魯肽早期干預對高脂飲食追趕生長大鼠脂肪追趕生長的作用［J］.中華內分泌代謝雜志，2014，30（5）：417-421.

EFFECTS OF LIRAGLUTIDE ON REDUCING GRP78 EXPRESSION IN PANCREAS OF RATS WITH HIGH FAT DIET

WANG Ping， GUO Xiao-yu， Gao Yu， et al
(Chengde Medical College, Hebei Chengde 067000, China)

Objective: To investigate the effects of liraglutide on pancreatic endoplasmic reticulum stress by observing the effects of liraglutide on glucose regulated protein 78 （GRP78） expression in pancreas of rats fed with high fat diet. Methods: 24 male Wistar rats were randomly divided into control group， high fat group， intervention group 1 and intervention group 2 （100μg/kg/d or 200μg/kg/d liraglutide， subcutaneous injection for 2 weeks） with 6 rats in each group. The fasting blood glucose （FBG）， fasting insulin （FINS）， free fatty acid （FFA）， total cholesterol（TC）， triglyceride （TG） of rats were respectively determined and HOMA-β was calculated. Western blotting and realtime-PCR were used to detect the GRP78 protein and mRNA expression in pancreas of rats. Results: Compared with rats in control group， the FBG， FINS， FFA， TC， TG and GRP78 protein and mRNA expression in pancreas of rats in high fat group increased obviously， but HOMA-β decreased obviously （P＜0.01）. Liraglutide could improve blood lipid metabolism disorders and reduce GRP78 protein and mRNA expression in pancreas of rats fed with high fat diet in a dose-dependent manner （P＜0.01，P＜0.05）. Conclusions: Liraglutide may improve pancreatic endoplasmic reticulum stress and protect islet beta cells by reducing expression of GRP78 protein and mRNA in pancreas.

Liraglutide； Glucose regulated protein 78 （GRP78）； Endoplasmic reticulum stress

R589

A

1004-6879（2016）05-0361-03

△

（2016-01-31）