梁　　斌，謝　　琦

（桂林醫(yī)學(xué)院生物技術(shù)學(xué)院，廣西桂林　541004）

技術(shù)方法

GST融合蛋白活性測定條件的優(yōu)化*

梁斌，謝琦△

（桂林醫(yī)學(xué)院生物技術(shù)學(xué)院，廣西桂林541004）

谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶；分光光度法；活性測定

谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶（GST，EC2.5.1.18）是一種廣泛分布于動植物和微生物體內(nèi)，具有多種生理功能的同工酶家族。在醫(yī)學(xué)研究中，由于它是生物體內(nèi)重要的解毒酶系，其在體內(nèi)活性的高低與代謝環(huán)境致癌物和化療藥物能力之間的關(guān)系受到人們的關(guān)注［1］。在基因工程研究中，GST的基因已被克隆和表達，GST可被作為一種融合表達蛋白來提高重組蛋白的可溶性表達，與GST融合的重組蛋白很容易利用GST標簽，通過親和層析進行純化，所以各種帶有GST標簽的重組蛋白被大量表達。在各種與GST相關(guān)的研究中，都涉及到GST酶活性的測定。目前，建立的GST酶活性測定方法有分光光度法、熒光底物法、滴定法、重疊氮法、氰化物法、對硝基酚法等。張丹參等［2］比較了上述方法后認為，以1-氯-2，4-二硝基苯（CDNB）和還原型谷胱甘肽（GSH）為底物的分光光度法具有操作簡便，靈敏度高，穩(wěn)定性好的優(yōu)勢。我學(xué)院在參照Habdous等［3-4］建立的以CDNB和GSH為底物的分光光度法的基礎(chǔ)上，針對基因工程研究中大量使用的帶有GST標簽的融合蛋白的酶活測定條件進行了優(yōu)化。

1　材料與方法

1.1材料大腸桿菌BL21（DE3）［PGEX-4T-1］，攜帶重組胸腺肽Tα1-TP5基因， 由本實驗室構(gòu)建［5］。CDNB（1-氯-2，4-二硝基苯）， 購自SIGMA公司。GSH（還原型谷胱甘肽），購自上海生工。大腸肝菌培養(yǎng)基：酵母粉2.4%，蛋白胨1.2%，甘油0.4%，磷酸二氫鉀17mmol/L，磷酸氫二鉀72mmol/L，硫酸鎂1mmol/L，高壓滅菌時磷酸鹽和硫酸鎂與其它組分分開，待溶液冷卻至60℃以下后混合。

1.2實驗方法

1.2.1GST－Tα1-TP5融合蛋白的粗提：500ml三角瓶裝大腸桿菌培養(yǎng)基100ml，接種量0.5%，37℃、250r/ min搖床培養(yǎng)，2.5h后加終濃度1g/L乳糖誘導(dǎo)，繼續(xù)培養(yǎng)6h后離心收集菌體。用0.1mol/LPBS重懸菌體，冰浴超聲破碎10min（工作30s，間歇30s），破碎后在14000r/min下冷凍離心10min，所得上清中含有GST－Tα1-TP5融合蛋白，即為粗酶液。

1.2.2GST活性測定：

1.2.2.1酶活測定步驟：樣品管和空白管分別配底物溶液4ml，混勻，在設(shè)定的溫度中保溫5min； 樣品管加入酶樣20μl，立刻計時，空白管加入PBS 20μ l，5min 時分別向樣品管、空白管加入終止劑后混勻。用1cm的石英比色杯于340nm處測定樣品管和空白管的OD值，計算差值△OD。

1.2.2.2GST活性計算：在特定條件下，每分鐘催化1μmol/L的CDNB與GSH結(jié)合的GST的量為 GST活力。

GST活力（U/L）=（△OD/t）×TV×106/（ε×d×SV）

上式中，t：反應(yīng)時間（min）； TV：反應(yīng)總體積（ml）；106：摩爾分子換算成微摩爾分子；ε：產(chǎn)物在340nm處摩爾吸光系數(shù)為9.6×103mol/cm；d：比色杯光徑（cm）；SV：樣品量（ml）。

1.2.3GST酶活測定反應(yīng)條件優(yōu)化：

1.2.3.1酶促反應(yīng)終止方法的選擇：根據(jù)GST酶促反應(yīng)的機制，催化反應(yīng)的第一步是GSH的去質(zhì)子化，生成H+和GS－，酸性條件可抑制GSH的去質(zhì)子化，不利于反應(yīng)的進行，而且在pH值較小的情況下，GST酶變性失活，酶促反應(yīng)終止。因此采用加酸的方法終止酶促反應(yīng)：選擇5mol/L的鹽酸和5mol/L的硫酸作為酶促反應(yīng)終止劑，按1.2.2.1的方法，在酶促反應(yīng)5min后加入5μ l，10μ l，15μ l，20μ l，40μ l，100μ l的鹽酸或硫酸，30min內(nèi)每隔30秒測定吸光值的變化情況。

1.2.3.2底物濃度的選擇：根據(jù)1.2.3.1的結(jié)果，終止劑選擇5mol/L的鹽酸，加入量為40 μl。以下實驗采用此條件。反應(yīng)體系采用0.1mol/L，pH6.5的PBS緩沖液，反應(yīng)溫度30℃，固定酶量和固定一個底物濃度，另一個底物的濃度分別選擇1.0、1.5、2.0、2.5 mmol/L，按1.2.2.1的方法測定酶活，觀察不同底物濃度與酶活性的關(guān)系。

1.2.3.3反應(yīng)溫度的選擇：按1.2.2.1的方法，采用最佳的底物濃度，單因素改變反應(yīng)溫度，分別為25℃、30℃、37℃、45℃，觀察不同反應(yīng)溫度與酶活性的關(guān)系。

1.2.3.4 pH的選擇：按1.2.2.1的方法，采用以上實驗確定的最優(yōu)反應(yīng)條件，單因素改變PBS緩沖液的pH，分別為6.5、7.0、7.5，觀察不同反應(yīng)pH條件與酶活性的關(guān)系。

1.2.3.5反應(yīng)體系緩沖液濃度的選擇：按1.2.2.1的方法，采用以上實驗確定的最優(yōu)反應(yīng)條件，單因素改變反應(yīng)體系緩沖液的終濃度，分別為0.05、0.1、0.2、0.3、0.4 mol/L，觀察反應(yīng)體系的離子強度與酶活性的關(guān)系。

1.2.3.6反應(yīng)條件優(yōu)化前后GST酶活測定結(jié)果的比較：文獻［2-5］中采用以CDNB和GSH為底物的分光光度法測定GST酶活的反應(yīng)條件各有不同，其中常用的反應(yīng)條件是：底物濃度CDNB和GSH均為1mmol/L，緩沖溶液采用pH=6.5，0.1mol/L磷酸鹽緩沖液，溫度采用30℃，反應(yīng)時間5min。本實驗也是在此基礎(chǔ)上進行優(yōu)化。取兩份酶樣，分別用上述反應(yīng)條件和優(yōu)化后的反應(yīng)條件測定，比較測定結(jié)果。

2　結(jié)果與分析

2.1酶促反應(yīng)終止方法的選擇在4ml的反應(yīng)體系中，當(dāng)加入5mol/L的鹽酸≧40μl或5mol/L的硫酸≧20μl后，反應(yīng)體系的吸光值基本保持不變，且在30min內(nèi)保持穩(wěn)定，說明當(dāng)反應(yīng)體系的pH小于1后，CDNB與GSH混合后發(fā)生的不論是自發(fā)反應(yīng)還是酶促反應(yīng)均有效終止。在340nm處，硫酸和鹽酸的光吸收近似為零，對產(chǎn)物的測定無影響?？紤]到應(yīng)盡量不往反應(yīng)體系里增加新的離子或基團，因此選擇鹽酸為終止劑。

2.2最適底物濃度：通過對兩種底物在不同濃度下進行交叉實驗發(fā)現(xiàn)，GSH濃度與CDNB濃度越大對應(yīng)的GST酶活力也越大，但是當(dāng)CDNB濃度＞3mmol/L時，反應(yīng)體系開始變渾濁。當(dāng)CDNB的濃度為2.5mmol/L，GSH濃度＞3mmol/L時，樣品與空白對應(yīng)的吸光度的差值△OD不再穩(wěn)定，而當(dāng)GSH濃度與CDNB濃度各為2.5mmol/L時，對應(yīng)的GST酶活性值最大且穩(wěn)定。因此，最適底物濃度為GSH 2.5mmol/L，CDNB 2.5mmol/L。實驗結(jié)果見圖1。

圖1　底物濃度對GST酶活的影響

2.3最適反應(yīng)溫度在25℃-37℃范圍內(nèi)，隨著溫度升高，GST酶的活性也隨之升高，45℃時由于酶失活速率加快等因素，酶活性下降，選擇該酶的最適反應(yīng)溫度為37℃。結(jié)果見圖2。

圖2　溫度對GST酶活的影響

2.4最適pH通過測定pH為6.5、7.0、7.5時對應(yīng)的樣品與空白實驗的吸光值，發(fā)現(xiàn)隨著pH值的增大，不論是自發(fā)反應(yīng)還是酶促反應(yīng)，反應(yīng)速率都隨之增大。但二者的吸光度的差值在pH7.0時最大，可見，pH7.0為本實驗所用酶的最適反應(yīng)pH。結(jié)果見圖3。

圖3　pH對GST酶活的影響

2.5PBS緩沖液濃度的選擇反應(yīng)體系的離子強度是影響酶促反應(yīng)速率的因素之一。通過測定在酶活性測定的時間內(nèi)反應(yīng)體系的pH，發(fā)現(xiàn)當(dāng)PBS緩沖液的濃度大于0.05 mol/L時，反應(yīng)體系的pH保持不變。本實驗通過改變磷酸鹽緩沖液的濃度，研究反應(yīng)體系的離子強度對酶促反應(yīng)速率的影響，PBS緩沖液的濃度為0.1mol/L時最優(yōu)。結(jié)果見圖4：

圖4　離子強度對GST酶活的影響

2.6反應(yīng)條件優(yōu)化前后GST酶活測定結(jié)果的比較取兩份酶樣，分別用優(yōu)化前后兩種反應(yīng)條件進行酶活測定。從實驗結(jié)果可知，在優(yōu)化后的酶活測定條件下，測定結(jié)果的酶活性要高于優(yōu)化前3-4倍，可提高檢測結(jié)果的靈敏度。結(jié)果見圖5。

圖5　優(yōu)化前后酶活測定結(jié)果的比較

3　討論

谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶廣泛存在于各種生物組織細胞液中，是一個具有多種同工酶的超基因Ⅱ相代謝酶家族，參與外來化學(xué)物質(zhì)，包括致癌物、致突變物和藥物等的代謝，具有多種生理功能。人們對不同來源的GST酶展開了各種研究，對其活性進行測定是研究的重要組成部分。由于不同來源的GST酶具有不同的理化性質(zhì)，可表現(xiàn)出不同的催化特性，在催化以CDNB和GSH為底物的反應(yīng)時，最適反應(yīng)條件也會有差異。因此，不同的研究人員在研究如：人的血清［3］、海洋雙殼類動物［6］、大鼠的肝臟［2］等來源的GST酶時，優(yōu)化后的最適反應(yīng)條件是各不相同的。

本實驗研究的是在基因工程領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用的GST融合表達載體，攜帶的是日本血吸蟲GST基因，其表達的GST融合蛋白具有完全的GST酶活。通過實驗優(yōu)化了GST融合蛋白活性測定的反應(yīng)條件，提高了測定的靈敏度。本實驗測定酶活時采用的是固定時間法，通過添加一定量的鹽酸來終止反應(yīng)，與連續(xù)動態(tài)測定法相比，優(yōu)點是操作簡單，對儀器設(shè)備要求不高。優(yōu)化后的酶活性測定方法具有簡便、快速、靈敏、穩(wěn)定等特點，為GST融合蛋白的進一步系統(tǒng)研究奠定了方法學(xué)基礎(chǔ)。

［1］蔡群芳，鄔強.谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶的研究進展［J］.海南醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2 011，17（12）：1735-1738.

［2］張丹參，張?zhí)焯?，李韶菁，?谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶抑制劑的高通量篩選［J］.藥學(xué)學(xué)報，2008，43（1）：108-112.

［3］Habdous M， Vincent-Viry M， Visvikis S， et al. Rapid spectrophotometric method for serum glutathione S-transferases activity（1 items） ［J］. Clin Chim Acta， 2002，326（1-2）：131-142.

［4］蔡俊，邱雁臨，馬輝文.含谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶基因工程菌表達條件研究［J］.微生物學(xué)雜志，2004，24（4）：18-22.

［5］謝琦，李娟，王鳳山.乳糖誘導(dǎo)胸腺融合肽Ta1－TP5在大腸桿菌中的表達［J］.中國生化藥物雜志，2012，33（3）：229-232.

［6］陳穎，陳榮.海洋雙殼類谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶活性測定條件的優(yōu)化［J］.海洋環(huán)境科學(xué)，2007，26（4）：386-389.

Q78

A

1004-6879（2016）05-0413-03

*廣西教育廳高校科研基金資助項目（200103YB091）

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（2016-01-15）