鐘丹，殷瑜，戈梅，錢秀萍

益生菌促進(jìn)阿卡波糖降低糖尿病小鼠餐后血糖的研究

鐘丹，殷瑜，戈梅，錢秀萍

目的 研究四聯(lián)益生菌對(duì)阿卡波糖降低糖尿病小鼠餐后血糖作用的影響。

方法 高脂飼料喂養(yǎng) 4 周的小鼠腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ）造模，隨機(jī)血糖大于 16.7 mmol/L 即視為糖尿病造模成功。造模成功的小鼠灌胃四聯(lián)益生菌（嗜酸乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、長(zhǎng)雙歧桿菌及地衣芽孢桿菌）各 109cfu/d，3 周后，考察益生菌是否具有促進(jìn)阿卡波糖降低糖尿病小鼠餐后血糖的作用。并通過檢測(cè)小鼠血清膽固醇、甘油三酯、胰島素及胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）水平，研究益生菌對(duì)小鼠糖尿病的改善作用。

結(jié)果 單獨(dú)給以低劑量阿卡波糖 30 mg/kg 或四聯(lián)益生菌均無明顯降低餐后血糖的作用，但兩者聯(lián)合給藥組小鼠餐后1 ～ 2 h 血糖值明顯低于的糖尿病組及單獨(dú)給以阿卡波糖或益生菌組。四聯(lián)益生菌組小鼠血清 TG 水平明顯低于糖尿病組，而 GLP-1 水平則明顯高于糖尿病組，兩組間血清膽固醇及胰島素?zé)o顯著性差異。

結(jié)論 四聯(lián)益生菌具有促進(jìn)阿卡波糖降低糖尿病小鼠餐后血糖的作用，這種促進(jìn)作用可能跟益生菌改善甘油三酯及GLP-1 的水平有關(guān)。

糖尿??； 阿卡波糖； 小鼠，肥胖； 益生菌； 胰高血糖素樣肽 1

www.cmbp.net.cn 中國(guó)醫(yī)藥生物技術(shù), 2016, 11(5):441-445

糖尿病是一類以長(zhǎng)期高血糖為特征的代謝性疾病，由基因、環(huán)境、生活習(xí)慣等多種因素引起，嚴(yán)重威脅人類的健康［1］。目前治療的藥物主要有胰島素增敏藥、促胰島素分泌藥物及 α-葡萄糖苷酶抑制劑等［2］。其中，α-葡萄糖苷酶抑制劑是臨床常用于 II 型糖尿病治療的藥物，它通過競(jìng)爭(zhēng)性抑制小腸上皮絨毛膜刷狀緣的葡萄糖苷酶活性，抑制淀粉、蔗糖、麥芽糖的分解，使葡萄糖的生成和吸收減緩，從而降低餐后血糖峰值。目前已用于臨床的該類藥物有阿卡波糖、伏格列波糖、米格列醇等，但臨床使用中會(huì)產(chǎn)生藥物耐受，且有腹瀉、胃腸道不適等不良反應(yīng)，因此，需要尋找具有協(xié)同降糖作用的藥物或減輕副作用的方法。

越來越多的研究表明，腸道菌群的失衡與糖尿病的發(fā)生有著密切的關(guān)系［3］，益生菌已被證明是治療胰島素抵抗的有效輔助方法。臨床實(shí)驗(yàn)顯示長(zhǎng)雙歧桿菌［4］、嗜酸乳桿菌［5-6］及鼠李糖乳桿菌［7-8］等益生菌在改善腸道微生態(tài)平衡的同時(shí)，具有降低體內(nèi)促炎性因子，改善胰島素與胰高血糖素樣肽水平，增加葡萄糖耐量與胰島素敏感性等糖尿病癥狀改善的作用。

本研究通過動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，考察四聯(lián)益生菌與阿卡波糖聯(lián)合改善糖尿病小鼠餐后血糖的可行性，期望降低阿卡波糖的給藥劑量，緩解其副作用，為治療糖尿病提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性 C57/BL 小鼠，3 周，CL級(jí)，購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。自由攝食、進(jìn)水，12 h 燈光晝夜循環(huán)，室溫 25 ℃，相對(duì)濕度55% ± 5%，實(shí)驗(yàn)過程環(huán)境穩(wěn)定，小鼠適應(yīng)環(huán)境 4 d后隨機(jī)分組。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物所有喂養(yǎng)程序由上海交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心管理，經(jīng)上海交通大學(xué)動(dòng)物倫理和使用委員會(huì)（IACUC）審批。

1.1.2 菌株 嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus，HCCB20535），鼠李糖乳桿菌（L.rhamnosus，HCCB20555），長(zhǎng)雙歧桿菌（Bifidobacterium longum，HCCB20558），地衣芽胞桿菌（Bacillus icheniformis，HCCB20544）。

1.1.3 藥品、試劑與飼料 鏈脲佐菌素（STZ）購(gòu)自上海譜振生物科技公司；高脂高糖飼料（HFD）（10% 豬油、10% 蔗糖、2.0% 膽固醇、0.5% 豬膽酸鹽、77.5% 常規(guī)飼料）購(gòu)自上海普路騰生物科技有限公司；小鼠胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）ELISA檢測(cè)試劑盒和小鼠胰島素 ELISA 檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自上海銘睿生物；SYBR?PrimeScript? Real Time-PCR Kit購(gòu)自 Tiangen 公司。

1.1.4 儀器 安穩(wěn)免調(diào)碼血糖儀為三諾生物傳感股份有限公司產(chǎn)品；HZQ-QX 全溫振蕩器為哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司產(chǎn)品；Catalyst Dx?動(dòng)物專用干式生化分析儀為美國(guó) IDEXX Laboratories公司產(chǎn)品；Onestep Q-PCR 儀為美國(guó) Thermo Fisher Scientific 公司產(chǎn)品；酶標(biāo)儀為美國(guó) Biotek 公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 小鼠糖尿病造模 雄性 C57/BL 小鼠高脂高糖飼料喂養(yǎng) 4 周后，腹腔注射 STZ 150 mg/kg（pH 4.2 檸檬酸緩沖液溶解），隨機(jī)血糖值 ＞16.7 mmol/L 即視為糖尿病造模成功。

1.2.2 動(dòng)物分組及喂養(yǎng)方式 3 周大的雄性C57/BL 小鼠適應(yīng)環(huán)境 4 d 后分為正常組（普通飼料喂養(yǎng)，不注射 STZ）與糖尿病造模組（高脂高糖飼料喂養(yǎng) 4 周，腹腔注射 STZ）；造模成功的小鼠分為益生菌組及生理鹽水組，益生菌組小鼠連續(xù)灌胃益生菌，生理鹽水組每日灌胃生理鹽水；3 周后將生理鹽水組 12 只小鼠隨機(jī)分為兩組，分別記為模型對(duì)照組 D 及阿卡波糖對(duì)照組 A，將益生菌組12 只小鼠隨機(jī)分為兩組，分別記為益生菌組 P 及阿卡波糖 + 益生菌組 AP，具體方案見圖 1。

益生菌促進(jìn)阿卡波糖降糖作用實(shí)驗(yàn)前，所有小鼠禁食 16 h，自由給水，實(shí)驗(yàn)時(shí)以 2 g/kg 劑量給各組小鼠灌胃淀粉溶液，同時(shí)灌胃藥物，用血糖儀檢測(cè)空腹血糖（FBG）和餐后 1 h、2 h 血糖（PBG）值。各組灌胃藥物設(shè)置如下：正常組（N 組）：生理鹽水溶液；糖尿病組（D 組）：生理鹽水溶液；阿卡波糖組（A 組）：阿卡波糖 30 mg/kg；益生菌組（P 組）：益生菌液 4 × 109cfu/只；阿卡波糖 + 益生菌組（AP 組）：阿卡波糖 30 mg/kg，益生菌液4 × 109cfu/只。

1.2.3 血液中相關(guān)指標(biāo)檢測(cè) 益生菌促進(jìn)作用考察結(jié)束后，次日使用離心管收集各組小鼠血液，3000 r/min 離心 15 min，將血清和血細(xì)胞迅速小心分離，制備血清樣本。用干式血液生化分析儀測(cè)定血清中膽固醇、甘油三酯濃度。取血清樣本進(jìn)行相應(yīng) ELISA 檢測(cè)試劑盒檢測(cè)，按試劑盒說明書操作測(cè)定胰島素、GLP-1 水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 益生菌對(duì)阿卡波糖降低糖尿病小鼠餐后血糖的促進(jìn)作用

如表 1 所示，D、A、P 及 AP 組餐后 1 h 和2 h 血糖均明顯高于 N 組，即糖尿病小鼠對(duì)餐后血糖代謝能力較差；A 組及 P 組餐后血糖與 D 組間無明顯差異；AP 組餐后 1 h 及 2 h 血糖均明顯低于 D 組，差異顯著。即四聯(lián)益生菌具有促進(jìn)阿卡波糖降低餐后血糖的作用。

2.2 灌胃益生菌對(duì)糖尿病小鼠血清膽固醇、甘油三酯水平的影響

如圖 2A 所示，糖尿病小鼠（D、A、P、AP）血清膽固醇含量均明顯高于正常小鼠；連續(xù)給益生菌（P、AP）小鼠血清膽固醇含量略低于未給益生菌的糖尿病小鼠（D、A），但無顯著性差異。

圖 2B 中可見，D、A 組的糖尿病小鼠血清甘油三酯含量明顯高于正常小鼠；而持續(xù)灌胃益生菌（P、AP）后，血清甘油三酯含量相較糖尿病小鼠（D、A）明顯降低，P ＜ 0.05。

圖1 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分組及喂養(yǎng)方式Figure 1 Grouping and feeding mode of animal experiment

表 1 益生菌對(duì)阿卡波糖降低餐后血糖的促進(jìn)作用（mmol/L）Table 1 Effect of probiotics on reducing postprandial blood glucose of acarbose （mmol/L）

圖2 益生菌對(duì)糖尿病小鼠血清膽固醇（A）及甘油三酯（B）的影響Figure 2 Effect of probiotics on the level of plasma cholesterol （A） and triglyceride （B） in diabetic mice

圖3 益生菌對(duì)小鼠血清胰島素水平（A）、GLP-1（B）水平的影響Figure 3 Effect of probiotics on the level of insulin （A） and GLP-1 （B） in diabetic mice

糖尿病通常伴有血脂（膽固醇、甘油三酯為主）代謝異常，高血脂是引起動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的重要因素，因此膽固醇、甘油三酯水平的降低有助于緩解糖尿病心血管并發(fā)癥發(fā)生的危險(xiǎn)。

2.3 灌胃益生菌對(duì)糖尿病小鼠血清胰島素、胰高血糖素樣肽-1 含量的影響

糖尿病尤其是 II 型糖尿病多為胰島素相對(duì)不足，即機(jī)體產(chǎn)生胰島素抵抗。而 GLP-1 可刺激胰島 β 細(xì)胞增殖和胰島素分泌，且具有抑制 β 細(xì)胞凋亡，提高肌肉、肝臟細(xì)胞對(duì)胰島素敏感性的作用［9］。因此，檢測(cè)益生菌對(duì)糖尿病小鼠上述指標(biāo)的影響將有助于闡釋益生菌促進(jìn)阿卡波糖降餐后血糖的作用機(jī)制。

由圖 3A可見，D、A、P 及 AP 組小鼠血清胰島素水平均顯著高于正常小鼠（N），P ＜ 0.05。灌胃益生菌 3 周的糖尿病小鼠（P、AP）胰島素水平相較未給菌的糖尿病小鼠（D、A）并無顯著差異。

由圖 3B 可見，D、A 組小鼠血清 GLP-1 水平明顯低于 N 組，P ＜ 0.01；長(zhǎng)期灌胃益生菌的 P、AP 組 GLP-1 水平同樣低于 N 組，但明顯高于未給菌的 D、A 組，P ＜ 0.05。表明長(zhǎng)期食用益生菌具有提高糖尿病小鼠 GLP-1 水平的作用。

3 討論

糖尿病已成為全球性的健康問題，阿卡波糖作為臨床常用的糖尿病口服治療藥物，能夠有效降低餐后血糖，且不易導(dǎo)致低血糖，但容易產(chǎn)生耐藥及腸功能紊亂等副作用，本研究從改善腸道微生態(tài)出發(fā)，探討益生菌促進(jìn)阿卡波糖降血糖作用的可行性。結(jié)果顯示，單獨(dú)給予益生菌并未降低餐后血糖，當(dāng)與低劑量（30 mg/kg）的阿卡波糖聯(lián)用后，其降低餐后血糖的效果顯著優(yōu)于單用該劑量的阿卡波糖。益生菌的添加不僅具有降低阿卡波糖用量的作用，而且益生菌本身還具有胃腸功能改善的活性。

本研究中，灌胃益生菌 3 周后改善了糖尿病小鼠血清甘油三酯水平，并顯著提高了血液中GLP-1 水平。研究表明，GLP-1 是一種重要的腸促胰島素，可刺激進(jìn)食后的胰島素分泌，發(fā)揮葡萄糖依賴性降糖作用［10］，并且可以增加胰島素敏感性［11］，對(duì) II 型糖尿病的發(fā)生發(fā)展有重要的影響。因此，本研究中益生菌對(duì)糖尿病的改善作用可能與調(diào)節(jié)甘油三酯及 GLP-1 水平有關(guān)。同時(shí)，據(jù)報(bào)道，某些乳酸菌本身也具有 α-葡萄糖苷酶抑制活性［12］，本文中益生菌促進(jìn)阿卡波糖的降糖機(jī)制是否還跟α-葡萄糖苷酶抑制劑活性的疊加或協(xié)同有關(guān)，仍有待進(jìn)一步研究。

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Objective To evaluate the effect of four-combination probiotics on reducing postprandial blood glucose of acarbose in diabetic mice.

Methods The mice were fed with diet enriched with high glucose and high fat， and after 4 weeks streptozotocin （STZ） was injected intraperitoneally. The criteria for the successful modelling was random blood sugar （RBS） aboved the cutoff value （16.7 mmol/L）. The probiotics group mice were given orally four-combination probiotics （Lactobacillus acidophilus， L. rhamnosus, Bifidobacterium longum, Bacillus icheniformis）， after 3 weeks their promotion on hypoglycemic activities to acarbose in diabetic mice were assayed. At the end of the experimental period， triglyceride， total cholesterol， insulin and GLP-1 in the plasma were determined.

Results Neither four-combination probiotics nor 30 mg/kg acarbose alone showed obvious hypoglycemic activity in mice. But when 30 mg/kg acarbose combined with probiotics was administrated， postprandial blood glucose of probiotics group mice was reduced more than that of the control group with no drug. Plasma triglyceride was significantly lower in probiotics group than that in diabetic group， while the GLP-1 levels of probiotic group was significantly higher than that of diabetic group. The levels of cholesterol and insulin were not significantly different between the two groups.

Conclusion Hypoglycemic function of acarbose is significantly promoted by probiotics， probably because of the improvement of plasma GLP-1 and triglyceride levels.

Author Affiliation： School of Pharmacy， Shanghai Jiaotong University， Shanghai 200240， China （ZHONG Dan， YIN Yu， QIAN Xiu-ping）； Shanghai Laiyi Center for Biopharmaceutical R&D， Shanghai 201203， China （YIN Yu， GE Mei）

www.cmbp.net.cn Chin Med Biotechnol, 2016, 11(5):441-445

Study on the reduction of postprandial blood glucose with acarbose promoted by four-combination probiotics in diabetic mice

ZHONG Dan， YIN Yu， GE Mei， QIAN Xiu-ping

Diabetes mellitus； Acarbose； Mice， obese； Probiotics； Glucagon-like peptide 1

QIAN Xiu-ping， Email： qianxp@sjtu.edu.cn

10.3969/j.issn.1673-713X.2016.05.010

200240 上海交通大學(xué)藥學(xué)院（鐘丹、殷瑜、錢秀萍）；201203上海來益生物藥物研究開發(fā)中心有限責(zé)任公司（殷瑜、戈梅）

錢秀萍，Email：qianxp@sjtu.edu.cn

2015-10-12