張小康，咼生容，馬曉良，張大軍

抗腸道病毒靶點(diǎn)藥物研究進(jìn)展

張小康，咼生容，馬曉良，張大軍

人類腸道病毒（EVs）是小 RNA 病毒科下的一屬病毒，通常在夏秋季節(jié)爆發(fā)流行。在腸道病毒中，目前只有脊髓灰質(zhì)炎病毒（PV1-3）、甲型肝炎病毒（HAV）和腸道病毒71 型（EV71）有相應(yīng)的疫苗［1］，仍有超過 110 種的腸道病毒對(duì)人類健康造成巨大威脅。這些病毒最常造成的危害是呼吸道和消化道的輕度癥狀，但同時(shí)它們也是造成無菌性腦膜炎和心肌炎的常見元兇。腸道病毒造成的疾病多種多樣，且同一種、同一型病毒的感染所造成的危害程度也不盡相同，從輕度癥狀到嚴(yán)重臨床疾病的發(fā)展過程也是難以預(yù)知的。例如腸道病毒 71 型以及柯薩奇病毒 A16 型（CVA16）引起的手足口病，大多數(shù)病例都可康復(fù)，但少數(shù)患者則會(huì)發(fā)展為腦干腦炎、肺水腫或其他致命癥狀［2-3］。

近年來，腸道病毒感染呈現(xiàn)常年流行的態(tài)勢(shì)。在中國，手足口病已經(jīng)成為常見的兒童感染疾病，并且成為一個(gè)重要的公共健康問題，僅 2014 年一年，便報(bào)告了近 285 萬例手足口病病例。值得警惕的是，由于基因變異，已知血清型的毒株會(huì)產(chǎn)生具有新的致病特性的變異型，對(duì)人群健康不斷造成新的威脅。例如，2007 年美國出現(xiàn)的一新型柯薩奇B1 病毒（CVB1），便是全美 40 多個(gè)地區(qū)報(bào)道的新生兒膿毒血癥及心肌炎的罪魁禍?zhǔn)祝?-5］。與此類似，2014 年腸道病毒 D68（EV-D68）的爆發(fā)［6］，導(dǎo)致 1100 多例嚴(yán)重呼吸道疾病和 100 多例急性弛緩性脊髓炎，而此前該病毒毒力僅與鼻病毒相當(dāng)［7］。

盡管經(jīng)過了數(shù)十年的研究，目前仍沒有開發(fā)出可以應(yīng)用于臨床的抗腸道病毒藥物［8］。理論上講，病毒生命周期中的每一步都可以是設(shè)計(jì)抗病毒藥物的靶點(diǎn)，本文則聚焦于腸道病毒蛋白。

雖然腸道病毒所致疾病癥狀各異，但它們都有著相同的病毒學(xué)特征［9］。腸道病毒是單正鏈 RNA 無包膜小病毒（27 ～ 30 nm），其病毒衣殼為二十面體對(duì)稱結(jié)構(gòu)，由 60 個(gè)蛋白質(zhì)亞基組成，每一個(gè)蛋白亞基又都包含 4 個(gè)病毒結(jié)構(gòu)蛋白（VP1-VP4）。其基因組約有 7500 個(gè)核苷酸，單一的開放閱讀框編碼一個(gè)大的多聚體蛋白（約 240 kD），兩側(cè)為非翻譯區(qū)，參與基因組的復(fù)制與翻譯。細(xì)胞黏附分子是典型的病毒受體，促進(jìn)病毒顆粒與靶細(xì)胞的附著以及受體介導(dǎo)的胞吞作用?；蚪M RNA 從病毒顆粒中釋放后，被翻譯為病毒多聚體蛋白，多聚體蛋白自身水解分裂為 3 種蛋白，P1 ～P3，再進(jìn)一步分解為結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白（即酶蛋白）。早期的關(guān)鍵步驟是多聚體蛋白分解，釋放 P1，隨后 P1 經(jīng)過 3C 蛋白酶作用水解為 4 個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白，構(gòu)成成熟病毒顆粒的衣殼。P2 和 P3 的水解產(chǎn)物參與負(fù)鏈 RNA 的合成以及正鏈 RNA 的復(fù)制，進(jìn)而使病毒擴(kuò)增。腸道病毒的生命周期通常在 6 ～ 12 h 內(nèi)完成，之后細(xì)胞迅速溶解，病毒顆粒釋放。

1 病毒衣殼蛋白

腸道病毒衣殼蛋白是最早被開發(fā)的抗病毒藥物靶點(diǎn)。在VP1 中，存在一個(gè)疏水口袋結(jié)構(gòu)，在大多數(shù)腸道病毒中這一口袋結(jié)構(gòu)被脂肪酸所占據(jù)，起到穩(wěn)定病毒衣殼的作用。在病毒附著細(xì)胞的過程中，口袋結(jié)構(gòu)中的脂肪酸被釋放，進(jìn)而協(xié)助病毒進(jìn)入細(xì)胞和脫殼。病毒衣殼蛋白抑制分子便是與這一口袋結(jié)構(gòu)結(jié)合并觸發(fā)衣殼蛋白的構(gòu)象改變，進(jìn)而阻礙病毒與宿主細(xì)胞的結(jié)合以及脫顆粒過程。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)藥物在衣殼蛋白裝配過程中的整合抑制作用也與其抗病毒活性有關(guān)［10］。

研究獲得進(jìn)展最多的藥物是 pleconaril 和 vapendavir（BTA-798）（圖 1）。Pleconaril 于 2002 年申請(qǐng)應(yīng)用于普通感冒，但因安全性問題被 FDA 拒絕［11］。先靈葆雅在 2003年獲得許可，將 pleconaril 發(fā)展為治療普通感冒癥狀的鼻部噴霧，以及用于人輪狀病毒（HRV）誘導(dǎo)加重的哮喘或慢性阻塞性肺病（COPD）的高?；颊?。最近一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，pleconaril 對(duì)腸道病毒感染導(dǎo)致的新生兒膿毒血癥的治療效果顯著，這證實(shí) pleconaril 在抗腸道病毒方面仍值得繼續(xù)發(fā)展研究［12］。BTA-798 是一種 pleconaril 的衍生物，其體外抗病毒活性是 pleconaril 的 10 倍，并且半衰期更長，口服生物利用度更佳，目前正處于臨床前研究階段［13］。以pleconaril 為模型，發(fā)展出了一類吡啶基咪唑啉酮化合物，其中抗病毒活性最好的為 GPP3，其 EC50為 10 nmol/L［14］。最近，De Colibus 等［15］設(shè)計(jì)合成了 NLD，其為 GPP3 的衍生物，NLD 的體外抗 EV71 活性較 GPP3 高出一個(gè)數(shù)量級(jí)，EC50值是 25 pmol/L，且選擇指數(shù)高達(dá) 6 × 104，是一個(gè)極具開發(fā)潛力的抗 EV71 化合物。

然而，現(xiàn)在已有研究發(fā)現(xiàn)，衣殼蛋白疏水口袋區(qū)的單點(diǎn)氨基酸替換會(huì)阻礙藥物分子與疏水孔洞的整合，進(jìn)而引起病毒對(duì)衣殼抑制劑的高水平抵抗，這種單氨基酸替換已被證實(shí)是腸道病毒對(duì) pleconaril 及其衍生物產(chǎn)生耐藥性的原因［16-17］。一種新的吡唑并嘧啶類化合物，OBR-5-340，被發(fā)現(xiàn)對(duì)于柯薩奇病毒 B3 型（CVB3）誘導(dǎo)的慢性心肌炎小鼠具有明顯的預(yù)防及治療效果，它是一種廣譜抗腸道病毒化合物，對(duì)于 pleconaril 耐受的毒株，OBR-5-340 的體外EC50值為 0.04 ～ 0.64 μmol/L，并且對(duì)細(xì)胞色素酶基本無影響，口服利用度高，成為一個(gè)具有良好發(fā)展前景的抗腸道病毒藥物候選化合物［18］。

圖1 作用于病毒衣殼蛋白的化合物

2 3C 蛋白酶

病毒增殖過程中的一個(gè)關(guān)鍵步驟是將單個(gè)的多聚體蛋白切割，形成最終成熟的結(jié)構(gòu)蛋白以及非結(jié)構(gòu)蛋白。多聚體蛋白總共需要切割 13 次，其中 10 次是由同一種病毒編碼蛋白—— 3C 蛋白酶（3Cpro）完成的，同時(shí)在易感宿主體內(nèi)也沒有發(fā)現(xiàn)該酶的細(xì)胞同系物，這使得小 RNA 病毒的3Cpro 酶成為一個(gè)潛在的抑制病毒增殖的藥物靶點(diǎn)［19］。以口蹄疫病毒（FMDV）為例，3Cpro 是病毒基因組中最為保守的蛋白之一，在所有的病毒血清型中，3Cpro 的氨基酸序列相似度為 76%，其中底物結(jié)合位點(diǎn)是整個(gè)酶中特征最為保守的區(qū)域［20］。經(jīng)過對(duì) HRV 的 3Cpro 的詳細(xì)研究，發(fā)現(xiàn)其結(jié)合的底物上都有著 APAKQ-LLNFD 序列，在這一序列中，P4 ～ P1 殘基（PAKQ）是決定選擇性的關(guān)鍵，在 P1 位置用吸電子基團(tuán)替代，便可以與 3C 蛋白酶活性部位的半胱氨酸反應(yīng)，抑制其活性［21］。以此為基礎(chǔ)，發(fā)展出了一系列小分子化合物，ruprintrivir 便是其中最具有代表性的化合物（圖 2）。

圖2 作用于 3C 蛋白酶的化合物

Ruprintrivir 是一種針對(duì) 3Cpro 的不可逆抑制劑，其EC50值在納摩爾級(jí)。該化合物有很高的廣譜抗腸道病毒活性，被選中進(jìn)入臨床試驗(yàn)。由于其口服生物利用度低，ruprintrivir 需要采用鼻部給藥。然而，在自然感染的患者身上，ruprintrivir 對(duì)癥狀的嚴(yán)重程度及病毒負(fù)荷都沒有明顯的減輕，因此暫停了對(duì)該化合物的研究［22］。不過這并不意味著對(duì) 3Cpro 的研究走入困境，蛋白酶作為一種抗病毒靶點(diǎn)，早已在 HIV 和 HCV 感染患者的治療過程中證明了它的巨大價(jià)值［23］。Tan 等［24］合成了一種新的抗 3Cpro 化合物——SG85，其體外抗 EV71 和鼻病毒的活性濃度均在納摩爾水平。隨后的研究還證實(shí)，SG85 與 ruprintrivir 無交叉耐藥性，這表明該化合物對(duì) 3Cpro 的作用位點(diǎn)與ruprintrivir 不同［25］。此外，近來還有一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，chrysin可以抑制 EV71 的 3Cpro，且其衍生物展現(xiàn)出抗 EV71 和CVB3 活性，提示該化合物有一定的抗病毒發(fā)展?jié)摿Γ?6］。

3 3D 聚合酶

3D 聚合酶（3Dpol）是由腸道病毒編碼的一種 RNA 依賴的 RNA 聚合酶（RdRp），它在幾種細(xì)胞以及病毒蛋白的協(xié)助下，催化病毒 RNA 的合成?？紤]到該酶在病毒復(fù)制過程中起著關(guān)鍵作用，而人類宿主細(xì)胞中完全缺乏這種RdRp，因此 3Dpol 被認(rèn)為是一種極具發(fā)展前景的藥物靶點(diǎn)［27］。RNA 聚合酶抑制劑可被細(xì)分為兩類，目前發(fā)現(xiàn)的大多數(shù)抑制劑是核苷或核苷酸類似物，在 RNA 合成過程中，通過與內(nèi)源性核苷酸競(jìng)爭(zhēng)，使終止子提前產(chǎn)生或造成突變。Ribavirin 是這類藥物的代表（圖 3），它可以誘導(dǎo)新合成的病毒 RNA 產(chǎn)生致死性突變，抑制病毒的復(fù)制［28］。第二類聚合酶抑制劑是非核苷類抑制劑（NNIs），這一類抑制劑的作用機(jī)制多樣，主要是作用于 RNA 聚合酶表面上各自的結(jié)合位點(diǎn)，影響酶活性而發(fā)揮作用。NNIs 所結(jié)合的酶表面位點(diǎn)在病毒種間變異較大，因此其抗病毒譜較為局限。目前發(fā)現(xiàn)的非核苷類抗腸道病毒化合物不多。DTriP-22 于2009 年被發(fā)現(xiàn)可以抑制 EV71 復(fù)制，并顯示出廣譜抗腸道病毒活性，研究表明該化合物對(duì) 3Dpol 的影響是通過別構(gòu)調(diào)節(jié)阻礙核苷三磷酸鹽進(jìn)入酶結(jié)合位點(diǎn)，進(jìn)而抑制 RNA 鏈的延長［29］。

最近有研究報(bào)道了一種新的 NNI——GPC-N114。與其他 NNIs 不同，該化合物的結(jié)合位點(diǎn)在 3Dpol 核心區(qū)域，是第一種以 RNA 模板引物結(jié)合位點(diǎn)為靶點(diǎn)的 NNI，具有廣譜抗腸道病毒和心肌炎病毒活性，其在體外抗 CVB3 感染的 EC50值為（0.15 ± 0.02）μmol/L，并且相關(guān)分析表明，CVB3 和脊髓灰質(zhì)炎病毒對(duì)該化合物產(chǎn)生耐受變異的基因屏障很高。該類化合物及其作用靶點(diǎn)為抗腸道病毒藥物開發(fā)提供了一個(gè)新的起點(diǎn)［30］。

圖3 作用于 3D 聚合酶的化合物

圖4 作用于 3A 蛋白的化合物

圖5 作用于 2C 蛋白的化合物

4 3A 蛋白

非結(jié)構(gòu)蛋白 3A 及其前體 3AB 是病毒復(fù)制過程中的關(guān)鍵蛋白，該蛋白可以通過 C 端疏水區(qū)域與細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)結(jié)合，對(duì)病毒感染的多個(gè)方面均有影響，包括 RNA 復(fù)制、宿主細(xì)胞向性以及病毒毒力等。3A 蛋白還可以作用于細(xì)胞分泌通路，降低細(xì)胞因子的分泌以及免疫受體的表達(dá)。由于3A 蛋白作用廣泛且在遺傳上較為保守，使其成為一個(gè)抗腸道病毒藥物的潛在靶點(diǎn)，但它確切的作用機(jī)制還未完全闡明［31］。

Enviroxime（圖 4），一種苯并咪唑衍生物，是第一個(gè)被報(bào)道的具有抑制腸道病毒 3A 蛋白活性的化合物［32］。然而，臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示該化合物治療效果無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，且有較強(qiáng)的胃腸道與呼吸道副作用，enviroxime 的進(jìn)一步開發(fā)被暫停［33］。在此之后，探索合成了一系列 enviroxime 衍生物，較有代表性的為 GW5074，但發(fā)現(xiàn)其作用靶點(diǎn)可能并不是 3A 蛋白，而是與 3A 蛋白相互作用的宿主蛋白［34］。相關(guān)研究表明，3A 蛋白可以募集磷脂酰肌醇-4-激酶 IIIβ（PI4KIIIβ）到分泌細(xì)胞器膜，創(chuàng)造一個(gè)利于 3Dpol 結(jié)合的富磷脂酰肌醇-4-磷酸（PI4P）環(huán)境，進(jìn)而促進(jìn)病毒 RNA的復(fù)制［35］。

Itraconazole 是一種三唑類抗真菌藥，被發(fā)現(xiàn)可以有效抑制 EV71 的復(fù)制，其 EC50值為 1.15 μmol/L。研究顯示，其作用靶點(diǎn)為病毒 3A 蛋白，且與 GW5074 無交叉耐藥性。該化合物還顯示出廣譜抗腸道病毒活性，除 EV71 外，還可以抑制其他腸道病毒，包括 CVA16、CVB3、PV-1 以及 EV-D68 等［36］。此外，itraconazole 在兒童和嬰兒身上的耐受性也很好，提示其在人群中可以廣泛應(yīng)用［37］。

5 2C 蛋白

在所有腸道病毒非結(jié)構(gòu)蛋白中，2C 蛋白是最保守、最復(fù)雜的，也是最后被發(fā)現(xiàn)認(rèn)識(shí)的一種多功能蛋白?，F(xiàn)有的報(bào)道顯示，2C 蛋白參與腸道病毒感染的多種過程，包括 RNA結(jié)合、RNA 復(fù)制、膜定位和重排、抑制自體吞噬［38］、病毒衣殼化和形態(tài)建成［39］以及抑制核因子kappaB（NF-κB）活性［40］。最新的研究發(fā)現(xiàn)，2C 蛋白既是一種 RNA 解螺旋酶，以 ATP 依賴的方式從 3' ～ 5' 解開 RNA 螺旋，同時(shí)也發(fā)揮 RNA 分子伴侶的作用，在不依賴 ATP 的情況下，破壞螺旋的雙向穩(wěn)定性，促進(jìn) RNA 鏈退火和高級(jí)結(jié)構(gòu)的形成［41］。

在以 2C 蛋白為靶點(diǎn)的化合物中，鹽酸胍（Gua-HCl）（圖 5）是發(fā)現(xiàn)較早同時(shí)研究較多的一個(gè)化合物，它可在多個(gè)方面抑制病毒的復(fù)制，可以阻斷 RNA 負(fù)鏈起始合成，阻止 2C 蛋白及其前體與細(xì)胞膜的結(jié)合以及抑制其 ATP 酶活性。HBB 和 MRL-1237 也是兩種針對(duì) 2C 蛋白的化合物，對(duì)脊髓灰質(zhì)炎病毒和柯薩奇 A 型病毒有抑制作用，病毒對(duì)這兩種化合物的耐藥性存在極高的重疊度，提示這兩種化合物有著相同的作用機(jī)制［33］。還有一種苯并咪唑衍生物——TBZE-029，也被報(bào)道對(duì)柯薩奇病毒 A9 型（CVA9）以及?？刹《?9 型和 11 型具有抑制作用，該化合物作用于 2C 蛋白的解螺旋酶活性區(qū)域，而不抑制 2C 蛋白的ATP 酶活性［42］。值得注意的是，TBZE-029 誘導(dǎo)產(chǎn)生的耐藥毒株也呈現(xiàn)出與 HBB 和 MRL-1237 的交叉耐藥性，這提示在病毒 2C 蛋白中存在一個(gè)變異累積的“熱點(diǎn)”區(qū)域，需要進(jìn)一步探索研究。

6 小結(jié)

目前防治病毒感染的最佳手段是疫苗，但面對(duì)種類、數(shù)量如此眾多的腸道病毒，疫苗的研發(fā)之路艱難而漫長，發(fā)展廣譜抗病毒藥物仍是治療腸道病毒感染的重要手段，而且隨著近年來腸道病毒流行呈現(xiàn)抬頭趨勢(shì)，這一任務(wù)顯得日益緊迫。本文集中總結(jié)了抗腸道病毒的病毒靶點(diǎn)和相關(guān)抗病毒化合物的研究進(jìn)展，雖然針對(duì)病毒靶點(diǎn)的藥物產(chǎn)生耐藥的幾率不低，但其對(duì)病毒選擇性高，對(duì)宿主細(xì)胞正常的生命活動(dòng)影響較小。此外，進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段的抗腸道病毒化合物也大多是針對(duì)病毒靶點(diǎn)。隨著對(duì)腸道病毒結(jié)構(gòu)蛋白以及非結(jié)構(gòu)蛋白研究的深入，逐漸有新的靶點(diǎn)和藥物設(shè)計(jì)見諸報(bào)道，抗腸道病毒藥物的研發(fā)及臨床應(yīng)用將有更多的方向和選擇。

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10.3969/j.issn.1673-713X.2016.05.012

遼寧省科技廳一般項(xiàng)目（L2015543）；沈陽市科技計(jì)劃項(xiàng)目（F15-139-9-02）；沈陽醫(yī)學(xué)院大學(xué)生科研立項(xiàng)（20160823）

110034 沈陽醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系（張小康、馬曉良），醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)系（咼生容），化學(xué)教研室（張大軍）

張大軍，Email：zhangdajun2008@126.com

2016-05-25