王明杰 ，劉舒云 ，郭維民，張雨，彭江，盧世璧，郭全義

干細胞在軟骨再生中的應(yīng)用

王明杰 ，劉舒云 ，郭維民，張雨，彭江，盧世璧，郭全義

軟骨損傷是最常見的膝關(guān)節(jié)疾病之一。由于軟骨無血管、神經(jīng)、淋巴組織，營養(yǎng)成分主要來自膝關(guān)節(jié)的滑液，這些組織學(xué)的特點使得軟骨損傷的自我修復(fù)能力極為有限。創(chuàng)傷性的軟骨損傷和早期的骨性關(guān)節(jié)炎（OA）會引起患者關(guān)節(jié)的疼痛和腫脹，若損傷不予處理則會加速關(guān)節(jié)的退變，引起更嚴重的功能障礙。軟骨損傷以及后續(xù)的關(guān)節(jié)退變給患者生活帶來極大的不便，同時軟骨損傷作為長期和慢性的疾病也消耗著大量的醫(yī)療資源。然而，隨著組織工程相關(guān)再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展，使得軟骨損傷的修復(fù)得以實現(xiàn)［1］。

組織工程技術(shù)主要包括種子細胞、支架材料和細胞因子等，其中種子細胞是影響修復(fù)效果的重要因素之一。自體軟骨細胞移植（ACI）技術(shù)在修復(fù)軟骨損傷中應(yīng)用廣泛且臨床效果肯定，因此自體的軟骨細胞被認為是組織工程軟骨種子細胞的“金標準”。但自體軟骨細胞在臨床中的應(yīng)用存在著許多待解決的問題：①由于自體軟骨細胞的供區(qū)面積有限，為了滿足修復(fù)所需的細胞數(shù)量，在移植之前需要將細胞在體外單層擴增培養(yǎng)，然而在培養(yǎng)過程中會出現(xiàn)軟骨細胞的去分化，導(dǎo)致軟骨細胞表型丟失。去分化的軟骨細胞在再生修復(fù)過程中易生成質(zhì)量較差的纖維軟骨，而非透明軟骨。纖維軟骨生物力學(xué)特性差，無法達到經(jīng)久耐用的效果。②自體軟骨細胞移植需要二次手術(shù)，患者難以接受復(fù)雜的治療過程。③獲取自體軟骨細胞的健康供區(qū)雖然是膝關(guān)節(jié)非負重區(qū)的位置，但也存在供區(qū)破壞所導(dǎo)致的一系列風險。雖然“3D”或添加細胞因子的體外培養(yǎng)條件，能夠減少軟骨細胞表型的丟失，但損傷供區(qū)健康軟骨和二次手術(shù)的問題仍然使得自體軟骨細胞修復(fù)軟骨損傷的臨床應(yīng)用受到很多限制［2-3］。

干細胞根據(jù)發(fā)育潛能可分為全能干細胞（totipotent stem cells，TSCs）、多能干細胞（induced pluripotent stem cells，iPSs）和單能干細胞（unipotent stem cells，USCs）。由于干細胞的自我更新復(fù)制和多項分化的潛能，使得干細胞在組織再生領(lǐng)域得到了廣泛關(guān)注。同時由于軟骨組織不可自我修復(fù)的特性，也使得干細胞在軟骨組織再生領(lǐng)域的研究越來越多，且間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）相關(guān)的研究已經(jīng)在臨床中得到了應(yīng)用［4］。關(guān)注干細胞在軟骨再生領(lǐng)域的發(fā)展，利于提供一些軟骨再生的修復(fù)策略。

1 軟骨祖細胞與軟骨細胞的特點

基于軟骨細胞表面存在不斷損傷修復(fù)的理論［5］，軟骨祖細胞（cartilage derived progenitor cells，CDPCs）最先由Dowthwaite 等在 2007 年提出，并在研究中發(fā)現(xiàn)該細胞群對于纖維連接蛋白具有較高的親和性，集落形成能力較強，同時表達細胞命運選擇基因 Notch 1。另有研究報道，在晚期骨性關(guān)節(jié)炎患者的軟骨中發(fā)現(xiàn)軟骨祖細胞的存在［6］，該研究結(jié)果展示了軟骨祖細胞具有較好的成軟骨能力、具有向損傷區(qū)的軟骨組織趨化的特性、具有下調(diào)成骨轉(zhuǎn)錄因子 Run-2和上調(diào)成軟骨轉(zhuǎn)錄因子 Sox-9 的特性以及增加細胞外基質(zhì)合成的特性。先前的研究結(jié)果證明軟骨干細胞僅存在于軟骨組織的表層［5，7］，2014 年，Yu 等［8］發(fā)現(xiàn)軟骨組織的深層同樣有軟骨祖細胞的存在。在軟骨祖細胞數(shù)量方面，表層 1/3區(qū)域多于深層 2/3 的區(qū)域，但不同區(qū)域的軟骨祖細胞具有向不同組織系分化的不同基因表達特性，這種特性對于維持關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)在的穩(wěn)態(tài)具有重要的意義。近年來有研究表明：軟骨祖細胞與軟骨細胞相比較，過度表達白介素趨化因子-8（IL-8）和 C-C 基配體-2（CCL-2）。軟骨祖細胞過度表達的趨化因子使得免疫細胞集聚，從而在軟骨的損傷與修復(fù)過程中起到調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的作用。軟骨祖細胞具有干細胞的表面標志物，如 STRO-1、CD90 和 CD166 等，也同樣具有多項分化潛能。軟骨祖細胞成軟骨誘導(dǎo)后可檢測到大量的 II 型膠原和蛋白多糖且不含有與軟骨退變老化相關(guān)的X 型膠原，與骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSCs）的成軟骨誘導(dǎo)相比有著明顯的不同［9］。同時 BMSCs 與軟骨祖細胞體外成軟骨誘導(dǎo)相比更容易引起細胞肥大。另外也有文獻報道軟骨祖細胞的體外誘導(dǎo)成軟骨效果明顯優(yōu)于滑膜間充質(zhì)干細胞（synovium-derived mesenchymal stem cells，SMSCs）［10］。這些研究結(jié)果顯示軟骨祖細胞用于軟骨再生的效果很可能要優(yōu)于 MSCs。

2016 年，Jiang 等［11］進一步探討了人源性的軟骨祖細胞以及該細胞在臨床軟骨組織損傷修復(fù)中的應(yīng)用潛能。該研究在體內(nèi)和體外試驗中對比了軟骨祖細胞的成軟骨能力，發(fā)現(xiàn)在低密度、低糖的“2D”培養(yǎng)模式中，不經(jīng)誘導(dǎo)的軟骨祖細胞可以自發(fā)進入軟骨分化程序，為該細胞的臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。為了進一步檢驗該細胞修復(fù)軟骨的效果，15 名年輕患者接受了應(yīng)用軟骨祖細胞修復(fù) 6 ～ 13 cm2大小軟骨缺損的治療，修復(fù)效果顯著，患者的疼痛感消失，日?；顒幼匀纭ｋm然經(jīng)過誘導(dǎo)后的軟骨祖細胞和正常的關(guān)節(jié)軟骨細胞相比在細胞表型和再生軟骨的質(zhì)量上還有一定的差距，但是軟骨干細胞和其他大多數(shù)的干細胞相比，具有更好的軟骨再生能力。關(guān)于軟骨祖細胞的相關(guān)研究還停留在比較早期的階段，需要進一步的研究來闡釋其在軟骨再生中的作用。因為應(yīng)用自體軟骨祖細胞修復(fù)軟骨缺損同樣面臨損傷健康軟骨區(qū)域和二次手術(shù)等一系列問題，因此在克服細胞免疫排斥問題或者證明該細胞本身具有較低的免疫原性的基礎(chǔ)之上，應(yīng)用同種異體軟骨祖細胞修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損可能是未來較為有希望的方法之一。

2 干細胞成軟骨分化

干細胞的多項分化潛能和自我復(fù)制能力是其成為良好組織工程軟骨種子細胞的基礎(chǔ)，將干細胞誘導(dǎo)成為軟骨細胞樣的細胞是構(gòu)建組織工程軟骨的重要因素。干細胞根據(jù)其發(fā)育階段，可分為胚胎干細胞（embryonic stem cells，ESCs）和成體干細胞（adult stem cells，ASCs）。胚胎干細胞的優(yōu)勢在于無限制的自我更新能力和多能性，通過對其成軟骨誘導(dǎo)可以產(chǎn)生足量的軟骨細胞。未經(jīng)處理的胚胎干細胞存在致瘤性和較高發(fā)生畸胎瘤的風險，因此應(yīng)用穩(wěn)定和有效的培養(yǎng)條件來擴增和誘導(dǎo)其向特定的軟骨系分化至關(guān)重要。許多不同的策略被單一或聯(lián)合應(yīng)用于誘導(dǎo)胚胎干細胞向軟骨系分化：①通過胚胎小體的形成。這種策略模仿胚胎發(fā)育的早期，即上胚層、中胚層和下胚層的形成；②通過胚胎干細胞生成間充質(zhì)干細胞?；陂g充質(zhì)干細胞所具有的免疫豁免特性和更高的安全性考慮，有學(xué)者已經(jīng)研究出了從胚胎干細胞派生出間充質(zhì)干細胞，并向軟骨分化和應(yīng)用到軟骨組織工程修復(fù)的技術(shù)；③生長因子和細胞活素。應(yīng)用最多的是 TGFβ 家族，主要是 TGFβ-1 和 TGFβ-2。另外還有 BMP 家族，主要是BMP-2、BMP-4 和 BMP-6。其他的還有 PDGF-bb、IGF-1和 SHH（Sonic Hedgehog Protein）；④與成體干細胞類似的策略，如與軟骨細胞或纖維細胞共培養(yǎng)以及改變細胞微環(huán)境的 3D 培養(yǎng)、低氧誘導(dǎo)、力學(xué)刺激等［12］。

iPSs 可以通過基因改造任何體細胞而獲得。iPSs 與ESCs 相比較，其優(yōu)勢在于兼具無限自我復(fù)制和多能性，且不存在倫理學(xué)問題。iPSs 最早是通過改變小鼠成纖維細胞4 個相關(guān)因子（Oct3/4、Klf-4、c-Myc、Sox-2）獲得［13］。這是一項在干細胞領(lǐng)域中具有突破性的研究成果，也為基因治療和組織工程相關(guān)的研究提供了新的工具。體細胞、成纖維細胞和軟骨細胞都已經(jīng)被改造重新編程為 iPSs 且能夠誘導(dǎo)分化成軟骨系。通過皮膚成纖維細胞產(chǎn)生的 iPSs 誘導(dǎo)成為軟骨細胞，同時根據(jù) HLA 表型，建立一個 iPSs 庫，該細胞庫能夠提供同種異體 iPSs 應(yīng)用于軟骨組織再生研究。該細胞庫的應(yīng)用和傳統(tǒng)組織工程軟骨再生相比，能夠減少花費同時也能夠覆蓋大量患病人群［14］。已有相關(guān)研究表明軟骨細胞來源的 iPSs 系與其他細胞來源的 iPSs 系相比能夠更高地表達蛋白多糖基因，同時軟骨細胞來源 iPSs 系的軟骨相關(guān)基因的表達與軟骨形成相關(guān)基因無差別。通過進一步探究其生物學(xué)特性，建立分化策略，優(yōu)化生產(chǎn)程序，最終實現(xiàn)生產(chǎn)足夠的、有功能的 iPSs 源性軟骨細胞樣細胞種群。未來，iPSs 有希望成為一種新穎的、較安全的組織工程軟骨種子細胞［14］。

MSCs 目前被認為是最有希望實現(xiàn)軟骨再生的細胞，已經(jīng)被應(yīng)用到臨床中并取得良好的效果。MSCs 向軟骨細胞分化是通過某些分子和細胞活素（其中起主要作用的是生長因子）、細胞所處的微環(huán)境所誘導(dǎo)。不同的生長因子在 MSCs向軟骨分化的不同階段起到了不同的作用［15-16］：①起始階段，起作用的因子包括 TGFβ、FGF-2、FGF-4、FGF-8、FGF-10、Wnt-3a、Wnt-4a、Wnt-7a、SHH、BMP-2、BMP-4、BMP-7。所起的作用主要是募集和凝聚 MSCs 以及促進MSCs 的增殖。②早期成軟骨階段，起作用的因子包括IGF-1、BMP-2、BMP-4、BMP-7、FGF-2/FGFR-2、GDF-5。所起作用是成軟骨細胞到軟骨細胞的分化過程以及軟骨祖細胞的增殖。③中后期成軟骨階段，起作用的因子包括FGF-18、FGFR-3、BMP-2、BMP-7、Ihh、PTHrP-R。所起的作用是向成熟的軟骨細胞分化。MSCs 最先是從骨髓組織中分離出來，也可以從其他組織中提取，包括脂肪組織、胎盤組織、臍帶組織、臍帶血、外周血、羊膜等。這些細胞的成軟骨特性均已研究證實。通過 MSCs 黏附和大規(guī)模培養(yǎng)的特性，可以將其分離出來，盡管沒有特定的表面標記來分選該群細胞，國際細胞治療協(xié)會（International Society of Cellular Therapy）定義了 MSCs 需陽性表達 CD105、CD73、CD90，陰性表達 CD45、CD34、CD14、CD19、CD11b 和HLA-DR。由于缺乏特定的標志物來識別 MSCs 細胞群，因此想要明確地比較不同組織來源的 MSCs 在成軟骨的相似性和區(qū)別性較為困難［17］。成熟的軟骨細胞定居于軟骨組織中，軟骨細胞之所以能夠維持其細胞表型與定居的微環(huán)境密切相關(guān)［18］，包括特殊的細胞外基質(zhì)、低氧的環(huán)境［19］、力學(xué)刺激［15］以及特殊的形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)。因此，MSCs 所處的微環(huán)境對其向軟骨分化起到了特定的作用，包括“3D”培養(yǎng)模式、ECM 支架培養(yǎng)、低氧環(huán)境、力學(xué)刺激等。另外共培養(yǎng)［20］作為一種較為新穎的培養(yǎng)模式，目的在于利用軟骨細胞和 MSCs 各自優(yōu)勢，實現(xiàn)軟骨細胞對 MSCs 的誘導(dǎo)作用，同時實現(xiàn) MSCs 促進軟骨細胞增殖作用。

MSCs 一直被認為是軟骨修復(fù)的“萬能藥”，但許多結(jié)果卻不及預(yù)期。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，MSCs 自身存在著軟骨內(nèi)成骨的分化程序，軟骨內(nèi)成骨伴隨著軟骨細胞的肥大，肥大的軟骨細胞不適合作為組織工程軟骨的種子細胞［21］，因此，MSCs 向軟骨細胞誘導(dǎo)分化成軟骨過程中，軟骨細胞肥大問題是影響誘導(dǎo)效果的關(guān)鍵因素之一，同時也是制約誘導(dǎo)后的干細胞在臨床應(yīng)用的限制性因素之一。許多用來抑制軟骨細胞肥大策略都被證明是有效的，例如蛋白或基因水平的干預(yù)（PTHrP、TGFβ、Sox-9），細胞共培養(yǎng)（軟骨細胞和干細胞），培養(yǎng)膜的應(yīng)用（硫酸軟骨素和軟骨細胞外基質(zhì)），低氧環(huán)境，生物力學(xué)刺激等［22］。然而，通過干細胞的誘導(dǎo)還不能產(chǎn)生像透明軟骨一樣的完全正常的軟骨組織。因此，應(yīng)用基于干細胞的組織工程軟骨修復(fù)技術(shù)達到完美的軟骨修復(fù)還將面臨著巨大的挑戰(zhàn)。

3 干細胞軟骨修復(fù)的臨床應(yīng)用

成體干細胞（ASCs）最先應(yīng)用于臨床治療，與 ESCs和 iPSs 細胞相比具有更高的安全性。MSCs 作為 ASCs中最具代表性的干細胞被廣泛應(yīng)用于臨床軟骨再生之中。MSCs 可來源于各種組織，如骨髓、脂肪、胎盤、臍帶血、滑膜、外周血、肌腱、軟骨等。如表 1 所示，到目前為止，用于軟骨損傷臨床治療的干細胞有 BMSCs、脂肪間充質(zhì)干細胞（ADSCs）、SMSCs、外周血干細胞（PBMSCs）和hCDPCs 等，均取得了較為滿意的修復(fù)效果。BMSCs 修復(fù)軟骨損傷的臨床應(yīng)用較早，且取得了滿意的修復(fù)效果。近年來也有應(yīng)用同種異體的 BMSCs 來治療骨性關(guān)節(jié)炎的相關(guān)研究。ADSCs 相比較 BMSCs 在治療軟骨損傷方面有一定的優(yōu)勢，如避免骨質(zhì)疏松所導(dǎo)致的 BMSCs 數(shù)量和質(zhì)量的下降，血管基質(zhì)片段細胞（stromal vascular fraction，SVF）不經(jīng)體外培養(yǎng)治療軟骨傷安全性更高，吸脂術(shù)后的脂肪組織作為醫(yī)療廢棄物得到重新利用等。PBMSCs 易于獲取，且可以通過一次手術(shù)完成修復(fù)，這也是該細胞應(yīng)用于臨床的一大優(yōu)勢所在。應(yīng)用 SMSCs 和 CDPCs 修復(fù)軟骨損傷的報道較少，與其他 MSCs 相比較，其優(yōu)勢和劣勢需要更多的臨床試驗來驗證。但由于 CDPCs 起源于軟骨組織本身，具有更好的向軟骨分化的能力，可能是一種比較有潛力的細胞。用干細胞修復(fù)軟骨損傷，修復(fù)的部位主要包括膝關(guān)節(jié)的軟骨、半月板以及踝關(guān)節(jié)距骨的軟骨。損傷的類型主要是單純局限性的軟骨損傷或者骨性關(guān)節(jié)炎的早期。細胞到達損傷部位的方式主要有單純干細胞的直接注射、細胞混合透明質(zhì)酸（HA）、細胞混合富集血小板（PRP）、細胞混合纖維蛋白膠和細胞復(fù)合膠原支架材料。目前應(yīng)用各種干細胞治療軟骨損傷還僅僅局限于應(yīng)用未經(jīng)處理或單純體外擴增培養(yǎng)的干細胞，雖然實驗室中已經(jīng)證實了干細胞誘導(dǎo)成軟骨的可行性和安全性，但尚未有體外誘導(dǎo)干細胞成軟骨應(yīng)用于臨床的報道。其中最主要的限制在于誘導(dǎo)后細胞的不穩(wěn)定性［49］（易退變和成瘤），以及更進一步的安全性得不到有效的證明。因此，需要更多的研究證據(jù)來證明誘導(dǎo)干細胞成軟骨后的安全性。

表 1 近年來干細胞在軟骨再生方面的臨床試驗研究

續(xù)表 1

4 結(jié)論與展望

干細胞的相關(guān)研究是軟骨再生中的重要基礎(chǔ)性研究之一。盡管目前干細胞在軟骨修復(fù)過程中所起到的作用以及具體起作用的機制并不是很清楚，且不同種類的干細胞在臨床上得到應(yīng)用的可能性和限制性尚存在很大爭議，但干細胞在該領(lǐng)域的許多優(yōu)勢是顯而易見的。MSCs 作為干細胞軟骨再生領(lǐng)域應(yīng)用最為廣泛的種子細胞，其安全性和有效性在基礎(chǔ)研究和臨床研究中都得到了較可靠的證據(jù)。雖然許多應(yīng)用干細胞修復(fù)軟骨損傷臨床試驗的相關(guān)研究取得了令人滿意的療效，但仍需更大樣本量和更長隨訪時間的臨床研究來進一步證明干細胞在軟骨修復(fù)中的安全性和有效性。

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10.3969/j.issn.1673-713X.2016.05.013

國家自然科學(xué)基金重點項目（2113404）；國家自然科學(xué)基金面上項目（81472092）

100853 北京，解放軍總醫(yī)院骨科研究所北京市再生醫(yī)學(xué)重點實驗室/全軍戰(zhàn)創(chuàng)傷重點實驗室

郭全義，Email：doctorguo_301@163.com

2016-07-27

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