曼　瓊,鄧　毅,楊志軍,趙　妮,杜進(jìn)娥,付艷春

(甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，甘肅 蘭州 730000)

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·實驗研究·

甘草內(nèi)生菌有效菌株與宿主水煎液、總黃酮、總皂苷止咳作用的對比研究*

曼瓊1,鄧毅1,楊志軍1,趙妮1,杜進(jìn)娥1,付艷春1

(甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，甘肅 蘭州 730000)

目的：研究甘肅烏拉爾甘草內(nèi)生菌有效菌株與宿主水煎液、總皂苷、總黃酮止咳作用的差異。方法：采用小鼠氨水和SO2引咳法，以小鼠半數(shù)引咳時間(EDT50)、R值、咳嗽潛伏期、2 min內(nèi)咳嗽次數(shù)、延長率、止咳率為指標(biāo)，觀察甘草有效菌株及宿主水煎液、總皂苷、總黃酮的止咳作用。結(jié)果：各有效菌株對氨水引咳所致小鼠EDT50均有所延長，JTZB005、JTZB006、JTZB014、JTZB020、JTZB043、JTZB060、JTZB063均具有顯著止咳作用(R>150%)，JTZB058有止咳作用(R>130%)。對SO2所致咳嗽，JTZB005、JTZB006、JTZB043、JTZB060、JTZB063均能延長小鼠咳嗽潛伏期，減少2 min內(nèi)咳嗽次數(shù)，具有止咳作用(P<0.01或P<0.05)，與宿主作用相似。結(jié)論：甘草有效菌株JTZB005、JTZB006、JTZB043、JTZB060、JTZB063與宿主有著相同的生理活性，并具有較好的止咳作用。

甘草；內(nèi)生菌；有效菌株/藥效學(xué)；總皂苷；總黃酮；止咳

甘草有祛痰止咳之效。研究表明，甘草具有緩和炎癥對咽喉的刺激而達(dá)到中樞性鎮(zhèn)咳作用[1]，其主要成分總皂苷、總黃酮有明顯的止咳作用[2-3]。甘草內(nèi)生菌可產(chǎn)生與其宿主甘草及有效成分總黃酮、總皂苷相同或相似的生理活性[4-6]。本實驗選取栽培烏拉爾甘草(GlycyrrhizauralensisFisch.) 分離培養(yǎng)內(nèi)生菌，經(jīng)體內(nèi)、外抑菌實驗篩選9株有效菌株進(jìn)行體內(nèi)止咳試驗，比較其與宿主水煎液、總皂苷、總黃酮止咳作用的差異，為評價甘草內(nèi)生菌止咳的藥用活性提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1動物

健康昆明種小鼠370只，SPF級，雌性各半，體質(zhì)量18～22 g，由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供，動物許可證號：SCXK(甘)2011-0001。

1.2藥品、試劑與儀器

栽培烏拉爾甘草購于甘肅省酒泉市金塔縣，經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)生藥實驗中心高級實驗師林麗老師鑒定為正品，將新鮮栽培甘草的根部泥沙清理掉，用保鮮膜分開包裝，4 ℃保存。磷酸可待因，青海制藥廠有限公司，批號20150124；生理鹽水，西安京西雙鶴藥業(yè)有限公司，批號1503217B；無水乙醇(批號20160103)、無水亞硫酸鈉(批號20151006)，天津市大茂化學(xué)試劑廠產(chǎn)品；乙酸乙酯，天津市富寧精細(xì)化工有限公司產(chǎn)品，批號20140701；氨水，天津市百世化工有限公司產(chǎn)品，批號20151011E；NA營養(yǎng)瓊脂(批號20150122)、營養(yǎng)肉湯(批號20140826)，青島高科園海博生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。LDZX-30FB立體壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠產(chǎn)品；DHP-927電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；HJ-CJ-2D雙人凈化工作臺，上海蘇靜實業(yè)有限公司產(chǎn)品；BS-110S型電子分析天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司產(chǎn)品；空氣JLN-2302AS型壓縮霧化器，深圳市新鴻鎂醫(yī)療器械有限公司產(chǎn)品。

1.3甘草內(nèi)生菌有效菌株[7-8]

甘草內(nèi)生菌有效菌株的制備參照文獻(xiàn)[7-8]。本實驗所用的9株有效菌株為JTZB002，005，006，014，020，043，058，060，063，均為前期將甘草分離、培養(yǎng)、純化得到的內(nèi)生菌，再采用體外菌餅法、體內(nèi)小鼠腹腔感染造模，篩選出的對金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、大腸桿菌均具有抑菌作用的菌株。

1.4甘草水煎液的制備

甘草破碎至1～3 mm長度，取30 g，加水300 mL，浸泡30 min，武火加熱，文火煎煮60 min，紗布濾過，濾液水浴濃縮至50 mL(含生藥量0.6 g/mL)，冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5總皂苷與總黃酮的提取分離

取適量栽培烏拉爾甘草粉末，精密稱定，加入10倍量800 mL/L乙醇，超聲提取40 min，浸提溫度40 ℃，過濾，濃縮，加25 g/100 g氨水調(diào)pH值至11～12，乙酸乙酯萃取4次，合并乙酸乙酯層，濃縮至固體，即得粗總黃酮，純度為70%。合并水層，加鹽酸調(diào)pH值至1～2，于4 ℃冰箱靜置，離心，取沉淀，干燥至恒重，即得粗總皂苷，純度為41%。

1.6有效菌株發(fā)酵液的制備

營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基按每瓶300 mL分裝于500 mL錐形瓶中，121 ℃滅菌20 min。將已活化的內(nèi)生細(xì)菌有效菌株于無菌操作臺上用接種環(huán)挑取5環(huán)菌種，接種于已滅菌的液體培養(yǎng)基中，于搖床28 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)4 d，將發(fā)酵液于4 ℃、3 000 r/min離心15 min，取上清液過濾，60 ℃烘干。

1.7分組與給藥

將小鼠按數(shù)字隨機(jī)表法分為14組，其中氨水引咳法試驗每組14只、SO2引咳法試驗每組12只，即空白組、陽性組、水煎液組、總皂苷組、總黃酮組和有效菌株JTZB002、JTZB005、JTZB006、JTZB014、JTZB020、JTZB043、JTZB058、JTZB060、JTZB063?？瞻捉M給予生理鹽水20 μL/g；陽性組給予磷酸可待因0.03 g/kg；水煎液組給予甘草水煎液1.3 g/kg(相當(dāng)于甘草臨床日等效用量);總皂苷組給予稀釋液0.03 g/kg;總黃酮組給予稀釋液0.006 g/kg；各有效菌株組分別給予發(fā)酵液，給藥劑量同水煎液組。各組藥物蒸餾水稀釋后等容積灌胃，1次/d，連續(xù)7 d。

1.8引咳方法

1.8.1小鼠氨水引咳法

末次給藥1 h后，小鼠放入250 mL的廣口瓶中，用25 g/100 g氨水噴霧刺激，按序貫法改變氨水噴霧時間[9]，觀察小鼠1 min內(nèi)的咳嗽次數(shù)。計算小鼠半數(shù)引咳時間(EDT50)，并根據(jù)公式計算R值(R值>130%，認(rèn)為有止咳作用；R值>150%，認(rèn)為有顯著止咳作用)。

n為每組動物數(shù)，c為rx的總和，r為每刺激時間下的動物數(shù)，x為刺激時間的對數(shù)。

序貫法測小鼠半數(shù)引咳時間，即預(yù)先設(shè)定一個噴霧時間20 s，相鄰各時間對數(shù)差為0.1，其余各刺激時間分別為10.0，12.6，15.9，20.0，25.1，31.6，39.8，50.1，60.6 s 9個等級時間，刺激完成后觀察小鼠1 min內(nèi)典型咳嗽次數(shù)(以小鼠腹肌收縮或縮胸，同時張大嘴為典型咳嗽)。若≥3次，記為有咳嗽(+)；若<3，記為無咳嗽(-)。若前一只“有咳嗽”，后一只用低一級時間刺激；反之，用高一級時間刺激。每組第一只小鼠刺激時間為20 s。

1.8.2小鼠SO2引咳法[10]

動物分組、給藥同1.7。末次給藥1 h后，取0.5 g 無水亞硫酸鈉放入25 mL蒸發(fā)皿，迅速滴入體積分?jǐn)?shù)500 mL/L硫酸溶液5 mL，立即用500 mL的玻璃燒杯扣住蒸發(fā)皿，計時1 min，此時燒杯內(nèi)充滿恒定濃度(1∶50 000)的SO2氣體。迅速將小鼠放入，觀察咳嗽情況，記錄小鼠咳嗽潛伏期(從小鼠放入燒杯到出現(xiàn)第一聲咳嗽的時間)及2 min內(nèi)典型咳嗽次數(shù)，計算延長率及止咳率[11]。

1.9統(tǒng)計學(xué)方法

2　結(jié)　果

2.1氨水引咳法測定結(jié)果

與空白組對比，各實驗組小鼠氨水引咳所致EDT50均有所延長。根據(jù)R1值，JTZB058有止咳作用(R>130%)；陽性組、水煎液組、總皂苷組、總黃酮組、JTZB005、JTZB006、JTZB014、JTZB020、JTZB043、JTZB060、JTZB063均具有顯著止咳作用(R>150%)；JTZB002無止咳作用(R<130%)。根據(jù)R2值，JTZB005、JTZB006、JTZB043止咳作用優(yōu)于水煎液組(R>130%)；JTZB060、JTZB063止咳作用顯著優(yōu)于水煎液組(R>150%)。根據(jù)R3、R4值，JTZB005、JTZB006、JTZB043止咳作用優(yōu)于總皂苷(R>130%)，JTZB060、JTZB063止咳作用顯著優(yōu)于總皂苷與總黃酮(R>150%)。見表1,2。

表1　小鼠氨水引咳法的測定結(jié)果記錄

續(xù)表1　小鼠氨水引咳法的測定結(jié)果記錄

續(xù)表1　小鼠氨水引咳法的測定結(jié)果記錄

表2　小鼠氨水引咳法半數(shù)引咳時間(EDT50)及R值結(jié)果對比

注：R1值，與空白組對比；R2值，與磷酸可待因組對比；R3值，與總皂苷組比較；R4值，與總黃酮組對比。*R>130%，有效；**R>150%，顯效。

2.2SO2引咳法測定結(jié)果

與空白組對比，陽性組、水煎液組、總皂苷組、總黃酮組、JTZB005、JTZB006、JTZB043、JTZB060、JTZB063組小鼠咳嗽潛伏期顯著延長，2 min內(nèi)咳嗽次數(shù)顯著減少(P<0.01或P<0.05)；JTZB014組咳嗽次數(shù)顯著減少(P<0.05)，但咳嗽潛伏期無顯著延長(P>0.05)。JTZB005、JTZB006、JTZB043、JTZB060、JTZB063組咳嗽潛伏期、2 min內(nèi)咳嗽次數(shù)和止咳率，與水煎液組、總皂苷組及總黃酮組對比，差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3　小鼠SO2引咳法結(jié)果

注：與空白組對比，*P<0.05，**P<0.01；與水煎液組對比，#P<0.05，##P<0.01；與總皂苷組對比，△P<0.05，△△P<0.01；與總黃酮組對比，＊P<0.05，＊＊P<0.01。

3　討　論

內(nèi)生菌是生活在健康植物組織和器官內(nèi)部的真菌或細(xì)菌，與宿主在長期進(jìn)化過程中發(fā)生基因重組并獲得宿主植物的基因，能夠產(chǎn)生與宿主相同或相似的藥用活性成分。利用微生物對傳統(tǒng)中藥進(jìn)行研究與開發(fā)，既可以尋找天然植物藥的新藥源，又可以解決瀕危藥材資源匱乏問題。止咳作用的實驗研究多采用機(jī)械刺激、化學(xué)刺激和電刺激。本實驗采用接近病理效應(yīng)的化學(xué)刺激方式，以氨水及SO2刺激引咳法，觀察甘草有效菌株與其宿主水煎液、總黃酮、總皂苷對引咳模型小鼠止咳作用的差別。綜合比較，有效菌株JTZB005、JTZB006、JTZB043、JTZB060、JTZB063對氨水和SO2刺激均有明顯止咳作用；其中，JTZB060、JTZB063止咳作用顯著優(yōu)于宿主水煎液、總黃酮、總皂苷；JTZB005、JTZB006、JTZB043與宿主水煎液、總黃酮、總皂苷作用相似；JTZB014、JTZB020、JTZB058對氨水刺激有止咳作用，對SO2刺激無明顯止咳作用；JTZB002對氨水和SO2刺激均無明顯止咳作用。提示甘草有效菌株JTZB005、JTZB006、JTZB043、JTZB060、JTZB063與宿主有著相同的生理活性，并具有較好的止咳作用。

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(編輯陶珠)

1001-6910(2016)10-0064-05

R285.5

B

10.3969/j.issn.1001-6910.2016.10.29

鄧毅，博士生導(dǎo)師，dengyi@gszy.edu.cn

國家自然基金地區(qū)科學(xué)基金(81360633)

2016-05-09；

2016-07-11