張　克，牛國順，鄧　莉，李寅超

(1.河南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450004； 2.鄭州大學(xué)藥學(xué)院，河南 鄭州 450001)

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·實(shí)驗(yàn)研究·

鮮蘆根水提物對小鼠細(xì)胞免疫功能的影響

張克1，牛國順1，鄧?yán)?，李寅超2

(1.河南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450004； 2.鄭州大學(xué)藥學(xué)院，河南 鄭州 450001)

目的：研究鮮蘆根水提物對小鼠細(xì)胞免疫功能的影響。方法：將健康昆明種小鼠隨機(jī)分為溶劑對照組，鮮蘆根水提物高劑量組(22.5 g/1kg)、中劑量組(7.5 g/kg)、低劑量組(3.75 g/kg) 4組，每組12只。灌胃，1 d 1次 ，連續(xù)14 d。采用綿羊紅細(xì)胞誘導(dǎo)小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)實(shí)驗(yàn)法，觀察鮮蘆根水提物對小鼠細(xì)胞免疫功能狀態(tài)的影響；計算淋巴母細(xì)胞和過渡態(tài)細(xì)胞百分率，觀察鮮蘆根水提物對小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)的影響。結(jié)果：①與溶劑對照組對比，鮮蘆根水提物高、中劑量組小鼠24 h足跖腫脹度均增高， 其中高劑量組較之差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。②與溶劑對照組對比，鮮蘆根水提物3個劑量組淋巴母細(xì)胞百分率和過渡態(tài)細(xì)胞百分率均有不同程度的提高，其中鮮蘆根水提物高、中劑量組淋巴母細(xì)胞百分率和高劑量組過渡態(tài)細(xì)胞百分率差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。結(jié)論：鮮蘆根水提物對細(xì)胞免疫功能有明顯的促進(jìn)作用。

鮮蘆根水提取液/作用；細(xì)胞免疫功能；24 h足跖腫脹度；淋巴母細(xì)胞百分率；過渡態(tài)細(xì)胞百分率；動物；小鼠

鮮蘆根為禾本科多年生草本植物蘆葦Phragmitescommunis(L.) Trin的新鮮根莖[1]，甘寒質(zhì)輕，入肺胃經(jīng)，有清熱養(yǎng)陰、除煩、止嘔、利尿的作用，且有清熱而不傷胃、養(yǎng)陰而不留邪、藥性平和的特點(diǎn)。鮮蘆根成分蘆根多糖有一定的免疫促進(jìn)作用，其1 000 g/L水煎劑具有抑制乙型溶血性鏈球菌作用[2]，而有關(guān)鮮蘆根水提物的免疫調(diào)節(jié)作用鮮有報道。本研究以小鼠為實(shí)驗(yàn)對象，從SRBC誘導(dǎo)小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(delayed type hypersensitivity，DTH)和植物血凝素(phytohaemagglutinin，PHA)刺激淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化角度，研究了鮮蘆根水提物對小鼠細(xì)胞免疫的作用。

1　材　料

1.1動物

SPF級昆明種小鼠，雄性，體質(zhì)量18～22 g，由河南省實(shí)驗(yàn)動物中心提供，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(豫)2010-0002。

1.2藥品、試劑與儀器

鮮蘆根采自丹江口水庫庫區(qū)，經(jīng)河南中醫(yī)學(xué)院劉若庸教授鑒定為蘆葦?shù)男迈r根莖，埋于濕沙中待用。除去殘莖、膜質(zhì)狀葉片、須根和雜質(zhì)，洗凈泥土，切段剪碎，放入燒瓶中，加8倍水浸泡30 min，加熱至沸，煎煮30 min，傾出藥液；殘渣加5倍量水，重復(fù)提取1次。合并2次水煎液，80 ℃水浴減壓濃縮至1 mL/g(按生藥計)，臨用前用蒸餾水稀釋成所需質(zhì)量分?jǐn)?shù)。綿羊紅細(xì)胞(SRBC)的制備方法[3]：無菌條件下取綿羊外頸靜脈血，置于內(nèi)盛玻璃珠的滅菌錐形瓶內(nèi)搖動10 min除去纖維蛋白，加入相當(dāng)于羊血體積2倍的Alsever溶液搖勻，置4 ℃冰箱備用。臨用時以生理鹽水洗滌3次(每次2 000 r/min、10 min)，棄上清，用生理鹽水稀釋至所需體積比和紅細(xì)胞質(zhì)量分?jǐn)?shù)[3]。PHA，Sigma 公司產(chǎn)品，批號L8902。JJ200型電子天平，常熟市雙杰測試儀器廠產(chǎn)品；AR1140型電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司產(chǎn)品；DM-BA300型數(shù)碼生物顯微鏡，廈門麥克奧迪有限公司產(chǎn)品； TGL-16H高速離心機(jī)，珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；游標(biāo)卡尺601，哈爾濱量具刃具集團(tuán)有限責(zé)任公司產(chǎn)品。

2　方法與結(jié)果

2.1統(tǒng)計學(xué)方法

2.2對小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)的影響

取健康雄性小鼠48只，按體質(zhì)量隨機(jī)分為溶劑對照組和鮮蘆根水提物低、中、高劑量組4組，每組12只。根據(jù)成人口服劑量(鮮品0.75 g/kg)，設(shè)低、中、高劑量分別為3.75，7.50，22.5 g/kg (分別相當(dāng)于人體推薦量的5，10，30 倍)。按 20 μL/g 體積給小鼠灌胃，對照組灌胃等體積的生理鹽水，1 d 1次，連續(xù) 14 d 后測定免疫指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)所選指標(biāo)和測定方法按照參考文獻(xiàn)[4]。各組小鼠腹腔注射 20 mL/L (V/V，以生理鹽水配制)的SRBC 0.2 mL，致敏后4 d，測量左后足跖厚度，同一部位測量3次，取平均值。在測量部位皮下注射 200 mL/L (V/V，以生理鹽水配制)的SRBC 20 μL，注射后24 h 測量左后足跖部厚度。以攻擊前后足跖厚度的差值(足跖腫脹度)來表示DTH的程度，結(jié)果見表1。結(jié)果顯示：與溶劑對照組對比，鮮蘆根水提物高、中劑量組小鼠24 h足跖腫脹度均增高， 其中高劑量組較之差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。提示蘆根水提取物可增強(qiáng)由SRBC誘導(dǎo)的小鼠DTH，改善細(xì)胞免疫功能狀態(tài)的作用，即可增強(qiáng)小鼠的細(xì)胞免疫功能，以高劑量作用明顯。

組 別劑量/(g·kg-1)動物數(shù)/只24h足跖腫脹度/mm溶劑對照組—120.32±0.15鮮蘆根水提物高劑量組22.5120.79±0.22**鮮蘆根水提物中劑量組7.5120.48±0.24鮮蘆根水提物低劑量組3.75120.30±0.27

注：與溶劑對照組對比，**P<0.01。

2.3對小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化反應(yīng)的影響[5]

取健康雄性小鼠48只，分組、劑量、給藥途徑和給藥周期同2.2。各組小鼠肌注PHA 8 μg/g，1 d 1次，連續(xù) 3 d；同時，鮮蘆根水提物3個劑量組灌胃等體積相應(yīng)藥液，溶劑對照組灌胃等體積蒸餾水，1 d 1次，連續(xù)14 d。第14天給藥40 min后剪尾，采血推片，Giemsa染色，油鏡下計數(shù)100個淋巴細(xì)胞中淋巴母細(xì)胞和過渡態(tài)細(xì)胞數(shù)量，計算淋巴母細(xì)胞百分率和過渡態(tài)細(xì)胞百分率，結(jié)果見表2。結(jié)果顯示：與溶劑對照組對比，鮮蘆根水提物3個劑量組淋巴母細(xì)胞百分率和過渡態(tài)細(xì)胞百分率均有不同程度的提高，其中鮮蘆根水提物高、中劑量組淋巴母細(xì)胞百分率和高劑量組過渡態(tài)細(xì)胞百分率差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。結(jié)果表明：鮮蘆根水提物能提高淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化程度，提高T細(xì)胞的免疫應(yīng)答功能，即提高細(xì)胞免疫功能，高劑量作用較強(qiáng)。

表2　各組淋巴母細(xì)胞百分率、過渡態(tài)細(xì)胞百分率對比　　±s

注：與溶劑對照組對比：*P<0.05，**P<0.01。

3　討　論

蘆根鮮品來源廣泛，資源豐富，藥性平和，毒副作用小，為《中國藥典》和眾多本草著作收載的常用中藥品種。國家衛(wèi)生部2002年規(guī)定鮮蘆根為藥食兩用原料[2]。DTH是一種由特異性致敏效應(yīng)T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫應(yīng)答類型。T淋巴細(xì)胞受抗原刺激后分化為特異性的致敏淋巴細(xì)胞，當(dāng)同種抗原再次攻擊時，局部致敏淋巴細(xì)胞釋放出多種淋巴因子，引起以單核細(xì)胞浸潤為主的炎癥反應(yīng)。炎癥反應(yīng)的程度反映了機(jī)體對該抗原特異性細(xì)胞免疫力的大小。PHA刺激淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)[6]是利用PHA被肌肉注射后，在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)活化T淋巴細(xì)胞并轉(zhuǎn)化為淋巴母細(xì)胞，以淋巴母細(xì)胞轉(zhuǎn)化率為指標(biāo)判斷待試藥對細(xì)胞免疫能力的影響。本研究結(jié)果顯示，蘆根水提取物可增強(qiáng)由SRBC誘導(dǎo)的小鼠DTH，改善細(xì)胞免疫功能狀態(tài)的作用，以高、中劑量作用明顯；鮮蘆根水提物能提高淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化程度，提高T細(xì)胞的免疫應(yīng)答功能，高劑量作用較強(qiáng)。以上均證實(shí)鮮蘆根水提物具有較好的細(xì)胞免疫功能增強(qiáng)作用。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：152.

[2]凌關(guān)庭.保健食品原料手冊[M].2版.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2006：375.

[3]羅新舟，孫江橋.復(fù)方黃芪合劑對小鼠免疫功能影響[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2014，16(1)：21-22.

[4]中華人民共和國衛(wèi)生部.保健食品檢驗(yàn)與評價技術(shù)規(guī)范(2003版)[S].衛(wèi)生部文件,衛(wèi)法監(jiān)發(fā)〔2003〕42號：22-34.

[5]李儀奎，王欽茂.中藥藥理試驗(yàn)方法學(xué)[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1991：164-165.

[6]趙艷玲，肖小河，袁海龍，等.肝得寧片對小鼠免疫功能的影響[J].中草藥，2002，33(2)：147-148.

(編輯陶珠)

1001-6910(2016)10-0068-03

R285.5

B

10.3969/j.issn.1001-6910.2016.10.30

2016-02-17；

2016-05-06