楊婷，陳璐璐，胡偉，朱熙，劉麗萍，楊雅茹

（安徽醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院藥劑科，安徽 合肥 230601）

超高效液相色譜法測定人體血清中伏立康唑藥物濃度*

楊婷，陳璐璐，胡偉，朱熙，劉麗萍，楊雅茹

（安徽醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院藥劑科，安徽 合肥 230601）

目的采用超高效液相色譜法測定人血清中伏立康唑（VR C）濃度，并用于臨床上該藥的血藥濃度監(jiān)測。方法以地西泮為內(nèi)標，色譜柱為Agilent Poroshell 120 EC-C18（4.6×100mm，2.7μm），流速1ml/min，流動相為乙腈-0.2%甲酸水溶液（45∶55），檢測波長254nm，進樣量10μl，柱溫40℃。結(jié)果VR C及地西泮的保留時間分別為2.52和4.06min；血清中VR C線性范圍為0.12～12.0μg/ml（r=0.9999），定量下限為0.12μg/ml，日內(nèi)精密度相對標準偏差（R SD）均<1.9%，日間精密度R SD均<2.1%，低、中、高3個濃度方法回收率為98.39%、101.16%和96.63%。結(jié)論該方法用于VR C的血藥濃度檢測，具有操作簡便、穩(wěn)定性良好，節(jié)約時間等優(yōu)點。

伏立康唑；超高效液相色譜法；血藥濃度監(jiān)測

近年來，隨著廣譜抗生素的廣泛使用、器官移植手術和侵入性診療手段的開展，侵襲性真菌感染的發(fā)病率正迅速增長，尤其是曲霉菌和念珠菌是最常見的致病菌。伏立康唑（Voriconazole，VRC）作為一種三唑類廣譜抗真菌藥，對于曲霉菌及念珠菌均有良好的抗菌作用，臨床使用較為廣泛[1]。但有研究發(fā)現(xiàn)，患者在給予相同劑量的伏立康唑時，體內(nèi)血藥濃度差異較大[2]。這可能與伏立康唑的藥動學特點、藥物間相互作用，以及藥物代謝酶基因多態(tài)性等因素相關[3]。而血藥濃度的巨大差異往往會影響療效，引發(fā)不良反應。有文獻報道，伏立康唑的安全濃度范圍為1.0～5.5mg/L。當血藥濃度>5.5mg/L時，不良反應如肝功能損害、視覺變化的發(fā)生率將大大增加。而血藥濃度<1 mg/L時，可能出現(xiàn)治療失敗[4]。為提高伏立康唑臨床應用的安全性及有效性，實現(xiàn)個體化給藥，本實驗建立超高效液相色譜法（ultra performance liquid chromatography，UPLC）檢測伏立康唑的血清藥物濃度，為臨床用藥提供參考。

1 資料與方法

1.1實驗儀器與試劑

Waters UPLC H-CLASS超高效液相色譜儀，雙量程電子天平，超純水器，高速離心機，振蕩器。伏立康唑?qū)φ掌罚ㄖ袊幤肥称窓z定研究院，批號：100862-201402，含量約99.7%），地西泮對照品（批號：171225-200903，含量為99.9%），甲醇、乙腈、甲酸均為色譜純。

1.2色譜條件

色譜柱：Agilent Poroshell 120 EC-C18（4.6× 100mm，2.7μm），流速1ml/min，流動相為乙腈，0.2%甲酸水溶液（45∶55），進樣量10μl，檢測波長254nm，柱溫40℃。

1.3溶液的配制

精密稱取伏立康唑?qū)φ掌?.4 mg，用50%甲醇水溶液定容到10 ml容量瓶中，制成240.0μg/ml伏立康唑儲備液。然后依次稀釋成伏立康唑標準曲線濃度點的儲備液，濃度分別為120.0、60.0、24.0、12.0、6.0、2.4和1.2μg/ml。再取一定量的伏立康唑儲備液稀釋為質(zhì)控樣品的儲備液，濃度分別為80.0、40.0和3.0μg/ml。

精密稱取地西泮標準品1.0mg，用50%甲醇水溶液定容于1 ml容量瓶中，制成1 000μg/ml地西泮儲備液，吸取該儲備液150μl，加入50%甲醇水至10ml，得到15μg/ml內(nèi)標溶液，備用。

1.4血清樣品的處理

精密量取血清220μl，加入20μl內(nèi)標地西泮溶液（15μg/ml），渦旋30 s，加入3 ml乙酸乙酯，震蕩渦旋1 min，4 000 r/min離心10 min。精密吸取上層清液2.7 ml，40℃氮氣吹干，加入50%甲醇水溶液250μl復溶，過0.22μm濾膜，10μl進樣。

2 結(jié)果

2.1標準曲線和定量下限

取空白血清200μl，分別加入伏立康唑各標準曲線的儲備液20μl及內(nèi)標儲備溶液20μl，配制成伏立康唑濃度分別為0.12、0.24、0.60、1.20、2.40、6.00和12.00μg/ml的系列標準血清樣品，按1.4的方法操作，以色譜圖中伏立康唑峰面積與內(nèi)標峰面積的比值作為縱坐標（Y），伏立康唑濃度為橫坐標（X），得到線性回歸方程：Y=0.1553X+0.0116，r2= 0.99997，線性范圍為0.12～12.0μg/ml，定量下限為0.12μg/ml。

2.2方法專屬性

分別取不同來源的空白血清、對照品血清及患者服藥后血清樣本各6份，按1.4方法操作。色譜峰分離良好，不受血清內(nèi)源性雜質(zhì)峰干擾，伏立康唑和地西泮的保留時間分別為2.52和4.06min。見附圖。

2.3精密度試驗

配制伏立康唑低、中、高3個濃度的血清樣品，濃度分別為0.3、4.0和8.0μg/ml，每個濃度配制6份，按1.4方法操作，得到該方法的日內(nèi)精密度。連續(xù)檢測3d，得到該方法的日間精密度。見表1。

附圖　UPLC圖譜

表1　UPLC法檢測伏立康唑血藥濃度的精密度

2.4回收率試驗

配制伏立康唑低、中、高3個濃度的血清樣品，濃度分別為0.3、4.0和8.0μg/ml，每個濃度配制6份，按1.4方法操作。另外取同等量的3個不同濃度的伏立康唑?qū)φ掌啡芤褐苯舆M樣，將前者與后者的峰面積比較，計算提取回收率。根據(jù)當日標準曲線求得實測濃度，并與理論濃度進行比較作為方法回收率。見表2。

2.5穩(wěn)定性試驗

2.5.1室溫穩(wěn)定性配制伏立康唑為0.3、4.0和 8.0μg/ml的低、中、高3個濃度的血清樣品，室溫放置6h后按1.4方法操作。將測得結(jié)果與0h進行比較，結(jié)果表明血清樣品室溫放置6h保持穩(wěn)定。

2.5.2進樣室放置穩(wěn)定性方法同2.5.1，配制伏立康唑3個濃度的血清樣品，按1.4方法處理，進樣室放置20 h后檢測，結(jié)果表明血清樣品處理后進樣室放置20h保持穩(wěn)定。

2.5.3凍融條件下血清樣品的穩(wěn)定性方法同2.5.1，配制伏立康唑3個濃度的血清樣品，置于-80℃冰箱冷凍后，取出在室溫下解凍，反復凍融3次，然后按1.4方法操作，將測得結(jié)果與未凍融樣品進行比較，結(jié)果表明，血清樣品反復凍融3次仍保持穩(wěn)定。

表2　伏立康唑濃度分析方法的提取回收率和方法回收率（n=6，%s）

表2　伏立康唑濃度分析方法的提取回收率和方法回收率（n=6，%s）

理論濃度提取回收率方法回收率0.3μg/ml94.32±0.0198.39±0.02 4.0μg/ml83.07±0.01101.16±0.02 8.0μg/ml100.12±0.0196.63±0.02

2.5.4長期穩(wěn)定性配制伏立康唑濃度為0.3、4.0和8.0μg/ml的低、中、高3個濃度的血清樣品，在-80℃冰箱冷凍20 d后，取出在室溫下解凍，按1.4方法操作，測得結(jié)果表明血清樣品長期冰箱中放置仍保持穩(wěn)定。見表3。

表3　伏立康唑濃度分析方法的穩(wěn)定性（n=6）

2.6方法學應用

應用該方法對本院10例患者進行伏立康唑血藥濃度測定，具體過程為患者連續(xù)使用伏立康唑，達穩(wěn)態(tài)血藥濃度時，于次日早晨用藥前采血，4000r/min離心10 min，精密量取血清220μl，根據(jù)1.4方法處理，依據(jù)標準曲線定量。從監(jiān)測結(jié)果來看，除7號外，其他血藥濃度均在有效治療濃度范圍內(nèi)（0.25～6.00mg/L）。7號和9號為同一患者血樣，7號給予常規(guī)劑量藥物，血藥濃度超出有效濃度范圍，9號為給藥劑量較前一次減半后測得的血樣，測得濃度降低至有效濃度范圍。見表4。

表4　患者臨床資料及伏立康唑血藥濃度

3 討論

多項研究結(jié)果表明，伏立康唑的血藥濃度與其療效及安全性相關[4-5]。有文獻報道，伏立康唑的代謝呈非線性藥動學特性[6]，且在不同人體內(nèi)的代謝快慢有明顯差異，與本研究結(jié)果相符。由于患者血藥濃度個體差異大，因此對伏立康唑進行血藥濃度監(jiān)測，可以更好地指導臨床用藥，對實現(xiàn)個體化給藥意義重大。目前，測定伏立康唑的血藥濃度常用方法有高效液相紫外檢測法[7-9]、高效液相熒光檢測法[10]和液質(zhì)聯(lián)用法[11-13]。本研究采用的是超高效液相色譜法，與高效液相檢測方法比較，其檢測速度快，每個樣本僅需5 min即可得出結(jié)果，大大節(jié)省時間，滿足臨床檢測需求；與液質(zhì)聯(lián)用法比較，其具有操作簡便、成本低、重復性好的優(yōu)點。BOEIRA等[14]也曾報道，使用超高效液相色譜法檢測伏立康唑的血藥濃度，相比較而言，該法優(yōu)化液相條件，流動相中不含有緩沖鹽溶液，延長色譜柱的壽命。同時，該法內(nèi)標為地西泮，簡單易得，便于實際操作。本實驗中分別應用0.05%、0.10%、0.30%和0.20%甲酸水溶液作為水相，前3種溶液導致色譜圖基線漂移，并且連續(xù)進樣穩(wěn)定性差，0.20%甲酸水溶液作為水相避免上述情況的出現(xiàn)。在選擇血清樣品處理方法時，分別使用甲醇、乙腈、高氯酸、三氯乙酸等試劑沉淀蛋白，離心后吸取上清液過濾直接進樣的方法，回收率較低且雜質(zhì)干擾較大。嘗試使用乙酸乙酯提取的方法，實驗結(jié)果表明，該方法樣品回收率高且雜質(zhì)干擾小，待測物峰形良好，適用于臨床伏立康唑血藥濃度測定。

本研究建立的方法實用性強，操作簡便、數(shù)據(jù)準確、靈敏度高、重復性好，可以作為伏立康唑血藥濃度日常監(jiān)測方法，為臨床合理安全用藥提供有力的依據(jù)。

[1]SAN DHERRM,MASCHMEYERG.Pharmacologyand metabolism of voriconazole and posaconazole in the treatment of invasive aspergillosis:review of the literature[J].Eur J Med Res, 2011,16(4):139-144.

[2]何高麗,張菁.伏立康唑治療藥物濃度監(jiān)測的探討[J].中國感染與化療雜志,2014,14(1):77-81.

[3]SUAN D,O’CONNOR K,BOOTH D R,et al.Voriconazole toxicity related to polymorphisms in CYP2C19[J].Intern Med J, 2011,41(4):364-365.

[4]PASCUAL A,CALANDRA T,BOLAYS,et al.Voriconazole therapeutic drug monitoringin patients with invasive mycoses improves efficacy and safety outcomes[J].Clin Infect Dis,2008, 46(2):201-211.

[5]DOLTON MJ,RAY J E,CHEN S C,et al.Multicenter study of voriconazole pharmacokinetics and therapeutic drug monitoring[J]. Antimicrob Agents Chemother,2012,56(9):4793-4799.

[6]武曉捷,董曉易.伏立康唑治療藥物濃度監(jiān)測方法的建立[J].中國感染與化療雜志,2009,9(2):118-122.

[7]王超,張弋.RP-HPLC法測定腎移植術后患者血漿中伏立康唑的濃度[J].中國藥房,2014,25(18):1668-1669.

[8]黃娟,馮仕銀,杜曉琳,等.HPLC法測定人血漿中伏立康唑濃度[J].解放軍藥學學報,2013,29(1):32-34.

[9]張燕青,林雪玉,朱金平.高效液相色譜法測定人血清中伏立康唑的質(zhì)量濃度[J].中國藥業(yè),2014,23(23):6-8.

[10]肖翔林,銀雪艷,孟冬梅.伏立康唑血藥濃度的測定與方法學考察[J].抗感染藥學,2014,11(4):292-294.

[11]付雙雙,熊歆,段京莉.伏立康唑患者血藥濃度的監(jiān)測[J].中國臨床藥理學雜志,2013,29(8):622-624.

[12]曲彩紅,周鳳麗,黃建華.高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定侵襲性真菌感染患者伏立康唑的血藥濃度[J].中國醫(yī)院藥學雜志, 2013,33(1):19-23.

[13]馮仕銀,雍小蘭,杜曉琳.LC-MS/MS法測定人血漿及唾液中伏立康唑濃度[J].中國新藥雜志,2012,21(16):1908-1911.

[14]BOEIRA P,ANTUNES MV,ANDREOLLA H F,et al.Ultraperformance liquid chromatographic method for measurement of voriconazole in human plasma and oral fluid[J].Journal of the Brazilian Chemical Society,2012,23(1):148-155.

（童穎丹編輯）

Determination of serum Voriconazole concentration by ultra performance liquid chromatography*

Ting Yang，Lu-lu Chen，Wei Hu，Xi Zhu，Li-ping Liu，Ya-ru Yang
（Department of Pharmacy，the Second Hospital of Auhui Medical University，Hefei，Anhui 230601，China）

ObjectiveTodeterminatetheconcentrationofVoriconazoleinhumanserumbyultra performance liquid chromatography（UPLC）.Methods Chromatography was performed on Agilent Poroshell 120 EC-C18（4.6×100 mm，2.7 μm），the internal standard was Diazepam.The flow rate was 1 ml/min，the mobile phase was acetonitrile-water（0.2%formic acid）（45：55），and the detection wavelength was 254 nm.Injection volume was 10 μl and the column temperature was 40℃.Results The retention time of Voriconazole and the internal standard Diazepam was 2.52 min and 4.06 min，respectively.The calibration curve was linear over the concentration range of 0.12-12.0 μg/ml（r=0.9999）with the lower limit of quantitation（LLOQ）at 0.12 μg/ml. Intra-and inter-day RSD was below 1.9%and 2.1%，respectively.The extraction recovery rate of the low，medium and high concentrations was 98.39%，101.16%and 96.63%，respectively.Conclusions The UPLC is a simple，highly selective and sensitive method for determining serum level of Voriconazole.

Voriconazole；ultra performance liquid chromatography；therapeutic drug monitoring

R 969.1

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2016.19.008

1005-8982（2016）19-0037-05

2016-05-11

安徽醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院博士科研啟動基金（No：2012BKJ022）；安徽醫(yī)科大學科學研究基金（No：2015xkj020）

胡偉，E-mail：ay2fyhuwei@qq.com；Tel：13856086475