朱成華　杜強(qiáng)

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黃芪甲苷對(duì)A549細(xì)胞胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素表達(dá)的影響

朱成華杜強(qiáng)

目的觀察黃芪甲苷對(duì)胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素(TSLP)基因表達(dá)的影響，并探討此作用是否與核因子-κB(NF-κB)有關(guān)。方法腫瘤壞死因子-α(TNF-α)+白介素-4(IL-4)刺激A549細(xì)胞4 h、10 h和18 h后,使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)方法觀察A549細(xì)胞TSLP mRNA表達(dá)的變化;同時(shí)使用RT-PCR方法觀察黃芪甲苷以及NF-κB抑制劑PDTC對(duì)TSLP mRNA表達(dá)的影響,使用免疫熒光觀察NF-κB P65核轉(zhuǎn)錄的變化,并用western blot方法檢測(cè)IκBα表達(dá)的變化。結(jié)果TNF-α+IL-4刺激A549細(xì)胞后TSLP mRNA表達(dá)明顯增加,4 h時(shí)增加最明顯,10 h逐漸下降,18 h后基本降到正常;PDTC能夠顯著抑制TSLP mRNA表達(dá),而黃芪甲苷抑制作用不明顯;黃芪甲苷能夠顯著抑制A549細(xì)胞NF-κB P65的核轉(zhuǎn)錄,升高胞漿IκBα的蛋白水平。結(jié)論氣道上皮細(xì)胞A549細(xì)胞中NF-κB對(duì)TSLP基因具有重要的調(diào)控作用,黃芪甲苷能夠升高胞漿IκB-α的蛋白水平,抑制NF-κB的核轉(zhuǎn)錄,但黃芪甲苷對(duì)TSLP的基因表達(dá)沒有抑制作用。

核因子-κB; 胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素; 黃芪甲苷

氣道上皮細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子,參與哮喘氣道炎癥和氣道重塑的形成[1]。胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素(TSLP)是由氣道上皮細(xì)胞分泌的一種細(xì)胞因子,在TSLP的表達(dá)調(diào)控中,核因子-κB(NF-κB)通路具有重要的作用[2-4]。黃芪甲苷具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)等特性,其體外抗炎機(jī)制之一來源于對(duì)NF-κB通路的抑制[5]。我們既往研究表明:黃芪甲苷能降低哮喘小鼠肺組織TSLP的表達(dá)[6],本實(shí)驗(yàn)旨在探討在Th2微環(huán)境下,黃芪甲苷是否影響支氣管上皮細(xì)胞TSLP的表達(dá),并探討此抑制作用是否與NF-κB通路有關(guān)。

1　材料與方法

1.1材料人類肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞A549(美國(guó)ATCC公司),Trizol (Invivogen公司),重組人白介素-4(IL-4)細(xì)胞因子(PeproTech公司),重組人腫瘤壞死因子-α(TNF-α)細(xì)胞因子(PeproTech公司),黃芪甲苷 (南京青澤有限公司),Anti-β-actin Ab(Abcam公司), IκBα抗體(Cell Signaling Technology 公司),NF-κB P65抗體(Abcam 公司)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及細(xì)胞因子刺激及藥物干預(yù): A549細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板內(nèi)培養(yǎng),初始細(xì)胞接種密度為(2～5)×105/ml;當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、細(xì)胞融合達(dá)80%～90%時(shí),細(xì)胞分組: (1)正常對(duì)照組(Control組):不加任何細(xì)胞因子和藥物;(2)IL-4+TNF-α組:IL-4(10 ng/ml)聯(lián)合TNF-α(20 ng/ml)孵育0.5 h、1 h、4 h、10 h、18 h;(3)黃芪甲苷組(astragaloside Ⅳ):A549細(xì)胞與黃芪甲苷(100 μg/ml)單獨(dú)孵育0.5 h、1 h、4 h;(4)IL-4+TNF-α+黃芪甲苷組:A549細(xì)胞與黃芪甲苷(100μg/ml)預(yù)先孵育0.5 h后,再與IL-4和TNF-α共同孵育0.5 h、1 h、4 h;(5)PDTC組:A549細(xì)胞+PDTC(20μg/ml)預(yù)先孵育0.5 h后,再與IL-4和TNF-α共同孵育4 h。

1.2.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)方法測(cè)A549細(xì)胞TSLP mRNA表達(dá): 在4 h、10 h、18 h時(shí)間點(diǎn),收集細(xì)胞檢測(cè)TSLP mRNA表達(dá)情況。用紫外分光光度計(jì)分別測(cè)定樣品在260 nm/280 nm比值及濃度,TSLP引物序列:sense:5’-TATGAGTGGGACCAAAAGTACCG-3’; antisense: 5’-TATGAGTGGGACCAAAAGTACCG-3’。作為內(nèi)參照的β-actin引物序列,sense:5’-CTTAGTTGCGTTACACCCTTTC-3’;antisense:5’-TCACCTTCACCGTTCCAGTTT-3’。結(jié)果分析使用相對(duì)的△CT表示;差別倍數(shù)=2-△△CT。

1.2.3western blot方法測(cè)定A549細(xì)胞 IκBα的蛋白表達(dá):在0.5 h棄去培養(yǎng)液后,貼壁的細(xì)胞用PBS液洗2次,加入胰酶消化細(xì)胞后離心收集細(xì)胞提取胞漿和胞核蛋白, 按試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.2.4免疫熒光檢測(cè)NF-κB P65核轉(zhuǎn)錄情況:參照相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道方法進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光染色[8];在1 h時(shí)間點(diǎn)收集A549細(xì)胞,用含4%多聚甲醛及0.03%TritonX-100室溫固定30 min。固定后,10%羊血清PBS中37 ℃孵育1 h。用鼠抗人TSLP抗體或兔抗人p65抗體4 ℃孵育過夜。用FITC標(biāo)記羊抗鼠IgG或Cy3標(biāo)記羊抗兔IgG室溫孵育2 h。置于DAPI染液中室溫下復(fù)染8 min。漂洗過后自動(dòng)熒光顯微鏡下觀察并拍照,結(jié)果以NF-κB核陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)與總細(xì)胞的相對(duì)百分比表示(每張切片計(jì)算100～200個(gè)總細(xì)胞)。

2　結(jié)果

2.1TNF-α聯(lián)合IL-4對(duì)A549細(xì)胞TSLP mRNA表達(dá)的影響使用TNF-α聯(lián)合IL-4刺激A549細(xì)胞,分別觀察4 h、10 h和18 h時(shí) TSLP mRNA的表達(dá)。在刺激4 h后,TSLP mRNA表達(dá)明顯升高(P<0.05),在刺激10 h時(shí),TSLP mRNA表達(dá)下降,到18 h基本下降至正常水平。見圖1。

注:與其他時(shí)間點(diǎn)比較,*P<0.05圖1　不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞因子刺激對(duì)A549細(xì)胞TSLP mRNA表達(dá)的影響

2.2NF-κB抑制劑PDTC對(duì)A549細(xì)胞TSLP mRNA的表達(dá)影響孵育4 h時(shí)點(diǎn)，PDTC能夠顯著抑制TSLP mRNA的表達(dá),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

注:與TNF-α+IL-4組比較,*P<0.05圖2　NF-κB特異性抑制劑PDTC對(duì)A549細(xì)胞TSLP mRNA表達(dá)的影響

2.3黃芪甲苷對(duì)A549細(xì)胞TSLP mRNA的表達(dá)影響孵育4 h時(shí)點(diǎn),黃芪甲苷不能抑制TSLP mRNA的表達(dá)(P>0.05)。見圖3。

注:與對(duì)照組比較,*P<0.05;AST:黃芪甲苷?qǐng)D3　黃芪甲苷對(duì)A549細(xì)胞TSLP mRNA的表達(dá)影響

2.4黃芪甲苷對(duì)A549細(xì)胞胞漿IκBα蛋白和NF-κB核轉(zhuǎn)錄的影響A549細(xì)胞經(jīng)TNF-α聯(lián)合IL-4刺激0.5 h,IκBα蛋白表達(dá)降低,與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。黃芪甲苷干預(yù)后可以顯著提高胞漿IκBα蛋白表達(dá),與刺激組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),黃芪甲苷單獨(dú)干預(yù)組與對(duì)照組比較，IκBα蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖4。A549細(xì)胞經(jīng)TNF-α聯(lián)合IL-4刺激1 h后,細(xì)胞核內(nèi)NF-κB P65陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的百分比與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),黃芪甲苷干預(yù)后,NF-κB P65陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的百分比顯著降低,兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);見圖5。

注:與TNF-α+IL-4組比較,*P<0.05;AST:黃芪甲苷?qǐng)D4　黃芪甲苷對(duì)A549細(xì)胞胞漿IκBα表達(dá)的影響

注:與TNF-α+IL-4+AST組比較,*P<0.05;AST:黃芪甲苷?qǐng)D5　黃芪甲苷對(duì)A549細(xì)胞NF-κB P65核轉(zhuǎn)錄的影響

3　討論

支氣管哮喘是多種炎癥細(xì)胞及炎癥因子參加的慢性氣道炎癥[9];長(zhǎng)期以來一直認(rèn)為氣道上皮的功能僅限于通過纖毛擺動(dòng)和黏液運(yùn)輸發(fā)揮防御作用,然而氣道上皮細(xì)胞作為一種炎性細(xì)胞,可分泌多種炎性介質(zhì)和細(xì)胞因子參與哮喘氣道炎癥和免疫反應(yīng),它和間質(zhì)細(xì)胞相互作用參與哮喘氣道重塑過程[1]。

TSLP的產(chǎn)生主要來源于氣道上皮細(xì)胞,TSLP激活DCs促使機(jī)體Th2炎癥的啟動(dòng)和發(fā)展,同時(shí)激活肥大細(xì)胞分泌IL-4、IL-5、IL-13等Th2型細(xì)胞因子,TSLP對(duì)于哮喘Th2氣道炎癥的形成具有關(guān)鍵性的作用[2-3, 7];而另一方面,Th2細(xì)胞因子IL-4、IL-13等可進(jìn)一步促進(jìn)氣道上皮細(xì)胞分泌TSLP[4],該正反饋加重和擴(kuò)大了哮喘氣道炎癥反應(yīng),因此打破該反饋，抑制氣道上皮細(xì)胞TSLP的分泌對(duì)于哮喘的治療具有重要的意義。在本實(shí)驗(yàn)中,使用TNF-α聯(lián)合IL-4模擬哮喘Th2型微環(huán)境刺激A549細(xì)胞后,發(fā)現(xiàn)TSLP mRNA表達(dá)明顯升高,尤其在4 h比較明顯,使用NF-κB特異性抑制劑PDTC后，TSLP mRNA表達(dá)顯著降低,說明在A549細(xì)胞,NF-κB通路對(duì)TSLP的表達(dá)具有重要的調(diào)控作用。

黃芪甲苷作為中藥黃芪的主要標(biāo)志成分,具有重要的抗炎、免疫調(diào)節(jié)等作用。既往研究表明在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)黃芪甲苷能夠抑制TNF-α誘導(dǎo)的NF-κB P65的核轉(zhuǎn)錄和DNA結(jié)合力[5]。本實(shí)驗(yàn)中使用TNF-α聯(lián)合IL-4激活A(yù)549細(xì)胞0.5 h后,胞漿IκBα的蛋白表達(dá)明顯降低,在刺激1 h后胞核NF-κB p65免疫熒光陽(yáng)性百分比增加,說明細(xì)胞因子刺激A549細(xì)胞后,胞漿IκBα降解,NF-κB P65核轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)。黃芪甲苷干預(yù)0.5 h后IκBα的蛋白表達(dá)水平升高,細(xì)胞核內(nèi)NF-κB P65陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)百分比減少,說明黃芪甲苷能夠阻止胞漿IκBα的降解,抑制NF-κB P65核轉(zhuǎn)錄,提示黃芪甲苷具有抑制NF-κB通路的作用。

既往研究表明,糖皮質(zhì)激素可以抑制TNF-α誘導(dǎo)的氣道上皮細(xì)胞TSLP的表達(dá)[4],然而糖皮質(zhì)激素并不能有效抑制TNF-α誘導(dǎo)的氣道上皮細(xì)胞NF-κB P65核轉(zhuǎn)錄[8],其抑制TSLP的具體機(jī)制不明。在本實(shí)驗(yàn)中,我們觀察黃芪甲苷對(duì)NF-κB調(diào)控的TSLP基因表達(dá)的影響,黃芪甲苷雖然能夠抑制NF-κB P65核轉(zhuǎn)錄,但并不能降低TSLP mRNA的表達(dá)。推測(cè)其可能原因?yàn)?由于TSLP的調(diào)控涉及多種信號(hào)通路,如P38MAPK、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)、JAK-STAT等信號(hào)通路[10-11],黃芪甲苷可能作用于這些通路進(jìn)而影響了TSLP mRNA的表達(dá)。黃芪甲苷對(duì)調(diào)控TSLP的其他通路的影響有待進(jìn)一步研究。

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Effect of astragaloside Ⅳ on the expression of thymic stromal lymphopoietin in A549 cells

ZHUCheng-hua,DUQiang.

DepartmentofRespiratoryMedicine,theSecondAffiliatedHospitalofNanjingMedicalUniversity,Nanjing210011,China

ObjectiveTo investigate the effect of astragaloside Ⅳ on the expression of TSLP mRNA in A549 cells, and to explore whether nuclear factor κB (NF-κB) is involved. MethodsA549 cells were cultured with TNF-α and IL-4, and the expression of TSLP mRNA at 4 h,10 h and 18 h was detected by real time-PCR. The effects of astragaloside Ⅳand PDTC (NF-κB inhibitor) on the expression of TSLP mRNA were also quantified by real time-PCR. The cytoplasm protein expression of IκBα was evaluated by western blot, and the nuclear translocation of NF-κB P65 was detected by immunofluorescence assays. ResultsCompared with the control group, the expression of TSLP mRNA was significantly increased in A549 cells stimulated with TNF-α and IL-4 at 4 h, and decreased at 10 h, almost reduced to the baseline at 18 h. PDTC greatly inhibited the level of TSLP mRNA. Astragaloside Ⅳ had little inhibitory effects on the expression of TSLP mRNA. However, Astragaloside Ⅳ suppressed the nuclear translocation of NF-κB P65, and enhanced the protein level of IκBα in the cytoplasm.ConclusionsNF-κB pathway may play an important role in regulating TNF-α and IL-4 stimulating TSLP mRNA expression. AstragalosideⅣ may suppress the nuclear translocation of NF-κB P65, enhancing the protein level of IκB-α in the cytoplasm. But, Astragaloside Ⅳ has little inhibitory effects on the expression of TSLP mRNA.

nuclear factor κB; thymic stromal lymphopoietin; astragaloside Ⅳ

南京醫(yī)科大學(xué)科學(xué)發(fā)展基金(2013NJMU049)

210011江蘇省南京市,南京醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院呼吸科

杜強(qiáng)，Email:Jingshuyue@163.com

R 446.63

A

10.3969/j.issn.1003-9198.2016.10.019

2015-10-19)