第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院腫瘤科(西安710038)

尤向輝 蘭 飛 宋 揚(yáng) 賀 新 蘇海川▲

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▲通訊作者

Raf-1對人血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期的影響

第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院腫瘤科(西安710038)

尤向輝 蘭 飛 宋 揚(yáng) 賀 新 蘇海川▲

目的：探討Raf-1蛋白激酶在血管內(nèi)皮細(xì)胞生長增殖中的作用。方法：分別應(yīng)用Raf-1蛋白激酶的真核表達(dá)載體pCDNA3-raf-1及干涉核苷酸片段Raf-1-siRNA轉(zhuǎn)染人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)，進(jìn)而應(yīng)用MTT法繪制HUVECs生長曲線，應(yīng)用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期。結(jié)果：HUVECs轉(zhuǎn)染真核表達(dá)載體后，細(xì)胞內(nèi)Raf-1明顯增高，與對照組比較，細(xì)胞增殖速度明顯加快；而轉(zhuǎn)染Raf-1-siRNA后，HUVECs細(xì)胞中Raf-1表達(dá)水平降低，與對照組比較，細(xì)胞增殖速度明顯減慢，阻滯于G1期。結(jié)論：Raf-1蛋白激酶在血管內(nèi)皮細(xì)胞生長增殖中發(fā)揮重要作用。

腫瘤新生血管的生成在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中扮演著重要角色,其一方面為腫瘤生長提供必要的營養(yǎng),另一方面與腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[1]。因此以新生血管為靶向的腫瘤生物治療近年來得到了快速發(fā)展[2]。絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與了多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展,其中Raf-1蛋白作為該通路中的一個分子發(fā)揮著重要作用[3]。研究顯示,在多種惡性腫瘤中,Raf-1表達(dá)明顯上調(diào),并與患者的預(yù)后密切相關(guān)[4]。因此針對Raf-1的抗腫瘤靶向藥物研究一直是腫瘤生物治療的熱點(diǎn)之一[5]。但當(dāng)前研究主要集中于通過抑制腫瘤細(xì)胞RAF-MEK-ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,達(dá)到靶向治療腫瘤的目的,而關(guān)于Raf-1與腫瘤血管形成、增殖之間的關(guān)系還不十分明確。在本研究中,我們通過探討血管內(nèi)皮細(xì)胞Raf-1對人血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期的影響,為Raf-1在腫瘤血管形成、增殖中作用研究打下基礎(chǔ)。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)材料 Raf-1真核表達(dá)載體pCDNA3-raf-1由本室保存；針對Raf-1的siRNA核苷酸片段Raf-1-siRNA：5’-CCU CAC GCC UUC ACC UUU Adtdt及不相關(guān)對照均由上海吉瑪公司合成；人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)取自新鮮臍帶,原代培養(yǎng)。抗兔抗人Raf-1抗體、兔抗人phosph-c-Raf(ser388)抗體均購自Cell signaling公司；流式細(xì)胞儀(FACSCalibur)購自BD公司；脂質(zhì)體LipofectamineTM2000購自Invitrogen公司。

2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及鑒定 依據(jù)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒說明書,分別將真核表達(dá)載體pCDNA3-raf-1及小分子干擾RNA(Raf-1-siRNA)轉(zhuǎn)染HUVECs,同時設(shè)置空載體(pCDNA3)及空白對照；48 h后,收集HUVECs細(xì)胞并進(jìn)行細(xì)胞裂解，Western Blot檢測HUVECs細(xì)胞中Raf-1及磷酸化Raf-1蛋白表達(dá)水平,一抗分別為兔抗人Raf-1抗體、兔抗人phosph-c-Raf(ser388)抗體，二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG,同時設(shè)置β-Actin對照。

3 MTT檢測細(xì)胞增殖 調(diào)整細(xì)胞濃度,以5×105/孔接種于96孔板,培養(yǎng)24 h后,連續(xù)7 d進(jìn)行MTT檢測并繪制生長曲線,簡述步驟如下：每天測定8孔,每孔中加入20 μl四甲基偶氮唑鹽(MTT)液(5 mg/ml),繼續(xù)培養(yǎng)4 h；吸棄上清，每孔加入150 μl二甲基亞砜(DMSO),充分震蕩后,490 nm波長測定吸光值,計(jì)算吸光度平均值,以時間為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo),繪制細(xì)胞生長曲線。

4 細(xì)胞周期檢測 胰酶消化細(xì)胞后,應(yīng)用預(yù)冷PBS洗滌2次,加入預(yù)冷70%乙醇溶液重懸細(xì)胞,于4 ℃過夜,應(yīng)用預(yù)冷PBS洗滌2次后,加入含有50 μg/ml溴化乙錠(PI)、0.2% Triton X-100及100 μg/ml RNase A的PBS 500 μl 4 ℃避光孵育30 min,流式細(xì)胞分析儀進(jìn)行細(xì)胞周期檢測。

結(jié) 果

1 HUVECs細(xì)胞Raf-1蛋白水平測定 見圖1。HUVECs分別轉(zhuǎn)染pCDNA3-raf-1、Raf-1-siRNA后,Western-blot檢測結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染真核表達(dá)載體pCDNA3-raf-1的HUVECs細(xì)胞中Raf-1蛋白水平及磷酸化水平較空載體對照組(pCDNA3)、脂質(zhì)體對照組(lipofectin control)均明顯增高(P<0.05)；而HUVECs在轉(zhuǎn)染干涉小分子RNA(Raf-1-siRNA)后，Raf-1蛋白水平及磷酸化水平均明顯降低(P<0.05)。

圖1 Western-blot檢測蛋白水平

2 細(xì)胞增殖曲線 見圖2。應(yīng)用MTT法分析HUVECs細(xì)胞轉(zhuǎn)染pCDNA3-raf-1、Raf-1-siRNA后,細(xì)胞生長增殖情況并繪制曲線。轉(zhuǎn)染真核表達(dá)載體pCDNA3-raf-1后,HUVECs細(xì)胞生長增殖速度與對照組相比較明顯增加(P<0.05)；而轉(zhuǎn)染干涉RNA小分子Raf-1-siRNA后,細(xì)胞增殖速度降低(P<0.05)。

3 細(xì)胞周期變化 見附表。應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)分析細(xì)胞周期分布情況：HUVECs細(xì)胞轉(zhuǎn)染真核表達(dá)載體pCDNA3-raf-1后,S期細(xì)胞比例與空載體對照組相比較明顯增加；相反,轉(zhuǎn)染干涉RNA小分子Raf-1-siRNA后,G1期的HUVECs細(xì)胞比例明顯增加(P<0.05)。

圖2 HUVECs細(xì)胞增殖曲線

附表 流式細(xì)胞技術(shù)分析HUVECs細(xì)胞周期

討 論

惡性腫瘤的有效治療仍舊是人類面臨的巨大挑戰(zhàn)之一，傳統(tǒng)的化療具有治療效果差、副作用大、特異性低等缺點(diǎn)。腫瘤微血管的生成在惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移中扮演著重要角色，因此針對腫瘤血管的生物治療研究越來越受到人們重視[6]。腫瘤微血管的生成是由多種因素、多種步驟參與的過程,多種細(xì)胞如腫瘤細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞均參與了腫瘤微血管的生成。我們在本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用HUVECs細(xì)胞作為研究對象，HUVECs細(xì)胞在體外培養(yǎng)后,可以建立體外人造血管模型,形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，為以后抗腫瘤血管藥物篩選、血管形成機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)[7]。

腫瘤血管生成受到腫瘤微環(huán)境中多種信號分子和通路的影響。目前已經(jīng)有多種靶向腫瘤血管生成的藥物進(jìn)入臨床，這些治療靶標(biāo)包括：抗血管生成因子、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、表皮生長因子受體(EGFR)等[8]。Ras/Raf-1/ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡中發(fā)揮重要作用，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[9]。在本實(shí)驗(yàn)中,為了驗(yàn)證Raf-1在血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖中的作用,我們構(gòu)建了Raf-1真核表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染HUVECs細(xì)胞，結(jié)果顯示，隨著細(xì)胞內(nèi)Raf-1表達(dá)增加，其磷酸化水平也明顯增加,細(xì)胞增殖速度加快；同時,我們設(shè)計(jì)了針對Raf-1的干涉小RNA,轉(zhuǎn)染HUVECs細(xì)胞后,細(xì)胞總Raf-1及磷酸化Raf-1水平均明顯降低,細(xì)胞增殖速度也明顯減慢。這些結(jié)果進(jìn)一步明確了Raf-1在血管內(nèi)皮增殖中具有重要作用,和其在腫瘤細(xì)胞中的作用相似，可以促進(jìn)細(xì)胞增殖，為以后腫瘤治療中以Raf-1為靶點(diǎn)的研究提供了新的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。因此，抗Raf-1靶向藥物一方面可通過抑制(降低)腫瘤細(xì)胞內(nèi)Raf-1表達(dá)抑制腫瘤細(xì)胞生長，另一方面，也可抑制(降低)腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)Raf-1表達(dá)，抑制腫瘤血管的生成,進(jìn)而抑制腫瘤的增殖、侵潤、轉(zhuǎn)移等。

綜上所述,本研究通過研究Raf-1對HUVECs細(xì)胞周期及增殖速度的影響,初步證實(shí)了其在新生血管內(nèi)皮細(xì)胞中的作用,為進(jìn)一步研究Raf-1在血管生成、腫瘤微循環(huán)中發(fā)揮的作用研究奠定了基礎(chǔ)，也為腫瘤治療靶點(diǎn)Raf-1在抗腫瘤血管治療中的應(yīng)用提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

[1] 張?zhí)煲? 劉 丹, 李航宇, 等. Endoglin與腫瘤血管生成、浸潤及轉(zhuǎn)移之問的關(guān)系[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué), 2014, 22(9)：2225-2228.

[2] 楊麗樺,何融泉,張昌文,等.表皮生長因子受體靶向治療鼻咽癌的研究進(jìn)展[J].廣東醫(yī)學(xué),2015,36(18)：2929-2931.

[3] Zhang K, Chen H, Zhang B,etal. Overexpression of Raf-1 and ERK1/2 in sacral chordoma and association with tumor recurrence[J]. Int J Clin Exp Pathol,2015,8(1):608-614.

[4] Chen L, Shi Y, Jiang CY,etal. Expression and prognostic role of pan-Ras, Raf-1, pMEK1 and pERK1/2 in patients with hepatocellular carcinoma[J]. Eur J Surg Oncol,2011, 37(6)：513-520.

[5] 祝 宇,華濤濤,趙硯瑾,等.新型?；孱怰af激酶抑制劑的合成及其抗腫瘤活性[J].化學(xué)合成,2015,23(9): 844-848.

[6] Li X, Wu M, Pan L,etal. Tumor vascular-targeted co-delivery of anti-angiogenesis and for synergetic therapy of tumor[J]. Int J Nanomedicine,2015,11: 93-105.

[7] 肖 輝,闞 軒,金德均,等.內(nèi)皮抑素對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)及體外微血管模型的作用及其可能的機(jī)制[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2006, 6(7)：24-26.

[8] 張百紅,岳紅云.腫瘤新治療靶標(biāo)的研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué), 2015, 23(7): 1012-1016.

[9] Jokinen E, Koivunen JP. MEK and PI3K inhibition in solid tumors: rationale and evidence to date[J]. Ther Adv Med Oncol, 2015, 7(3):170-180.

(收稿：2016-01-27)

The function of raf-1 in proliferation，cell cycle of human vascular endothelial cells

Department of Oncology,Tangdu Hospital of FMMU(Xi’an 710038)

You Xianghui Lan Fei Song Yang et al

Objective: To investigate the function of Raf-1 in cell proliferation and cell cycles in vascular endothelial cells. Methods: The Human Umbilical Vein Endothelial Cells(HUVECs) were transfected with the eukaryotic expression vector pCDNA3-raf-1 or Small interference RNA Raf-1-siRNA.Then, the cells growth curves were draw according of MTT, and cell cycles were detected by FACs. Results: After the HUVECs were transfected with the eukaryotic expression vector pCDNA3-raf-1,the proliferation of HUVECs increased significantly than the control. Vice versa, after the HUVECs were transfected with Raf-1-siRNA, the Raf-1 expression decreased, and the amplification of HUVECs was slower down than the control, the cell cycles were arrested at G1phase. Conclusion: The raf-1 plays an important role in the growth of vascular endothelial cells.

Mitogen-activated protein kinase kinases Human umbilical vein endothelial cells Neoplasm metastasis @Vascular endothelial cells

絲裂原活化蛋白激酶磷酸酶 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞 腫瘤轉(zhuǎn)移 @腫瘤血管生成

R73-37

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2016.10.004