彭輝，施天穹，聶志奎，郭東升，黃和，紀(jì)曉俊

（1南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，材料化學(xué)工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 211816；2江西新瑞豐生化有限公司，江西 新干 331300）

微生物發(fā)酵產(chǎn)赤霉素的研究進(jìn)展

彭輝1，施天穹1，聶志奎2，郭東升1，黃和1，紀(jì)曉俊1

（1南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，材料化學(xué)工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 211816；2江西新瑞豐生化有限公司，江西 新干 331300）

赤霉素為植物五大激素之一，對(duì)植物生長具有多種生理作用，如調(diào)控植物的莖干延長、種子發(fā)芽、打破種子休眠、誘導(dǎo)開花等。目前赤霉素已經(jīng)廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、林業(yè)、釀造業(yè)等，具有很大經(jīng)濟(jì)效益和市場前景。赤霉素的工業(yè)化生產(chǎn)主要通過藤倉赤霉液體發(fā)酵。盡管赤霉素具有多樣性的應(yīng)用及巨大的經(jīng)濟(jì)效益，但高生產(chǎn)成本嚴(yán)重制約其廣泛的應(yīng)用。本文首先介紹了赤霉素的生物合成途徑以及赤霉素合成基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)制，隨后重點(diǎn)總結(jié)了赤霉素發(fā)酵過程的菌種、營養(yǎng)因素、發(fā)酵參數(shù)、發(fā)酵工藝以及下游分離提純工藝等研究進(jìn)展。同時(shí)指出未來的研究重點(diǎn)在于利用新型的誘變方法與分子生物學(xué)方法選育高產(chǎn)菌株以及發(fā)酵工藝的革新，以提高赤霉素的產(chǎn)量，降低發(fā)酵成本，促進(jìn)赤霉素的大規(guī)模應(yīng)用。

赤霉素；萜類；發(fā)酵；藤倉赤霉

赤霉素（gibberellins，簡稱GAs），是一種天然的植物生長調(diào)節(jié)劑，屬于生物體內(nèi)的一類四環(huán)二萜類化合物，至今已發(fā)現(xiàn)136種，總稱赤霉素類（GAs）。常見具有生物活性的主要有GA1、GA3、GA4、GA7等（化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1所示）［1-3］，它與生長素（auxins）、細(xì)胞分裂素（cytokinins）、脫落酸（abscisic acid）、乙烯（ethylene）稱為植物五大激素［4］。赤霉素對(duì)植物生長具有多種生理功能，例如通過調(diào)節(jié)水解酶活性從而調(diào)控種子發(fā)芽、莖干延長、誘導(dǎo)開花、打破休眠、性別分化等過程［5-6］，因而廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、林業(yè)、釀造業(yè)等。赤霉素不僅分布于綠色植物，在一些細(xì)菌和真菌中也有發(fā)現(xiàn)［7］。目前獲取赤霉素主要方式有3種：植物中提取，化學(xué)合成，微生物發(fā)酵。由于前兩種方法價(jià)格昂貴、效率較低，而微生物發(fā)酵法具有周期短、效率高等優(yōu)點(diǎn)，所以工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)赤霉素主要通過微生物發(fā)酵法。目前用于工業(yè)化生產(chǎn)的微生物主要是是絲狀真菌藤倉赤霉（Fusarium fujikuroi）、無性狀態(tài)為串珠鐮孢（Fusarium moniliforme），下文所描述的發(fā)酵菌種均為藤倉赤霉。但目前價(jià)格高依舊是阻礙赤霉素大規(guī)模應(yīng)用的主要障礙［8］，因而必須通過菌種改良、發(fā)酵工藝優(yōu)化、下游純化工藝優(yōu)化等方法提高赤霉素產(chǎn)量，降低赤霉素的生產(chǎn)成本，以促進(jìn)赤霉素的大規(guī)模應(yīng)用。

圖1　赤霉素GA1、GA3、GA4、GA7的化學(xué)結(jié)構(gòu)

1　赤霉素的合成途徑和調(diào)控機(jī)制

赤霉素作為一種典型的微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物，在發(fā)酵中只有當(dāng)?shù)春谋M時(shí)才開始合成［9］。盡管合成途徑復(fù)雜，但研究者通過研究突變菌株、采用放射性標(biāo)記等方法，已經(jīng)將赤霉素合成途徑闡釋清晰［10-11］。同時(shí)赤霉素的合成除了受氮源調(diào)控，也受Velvet蛋白家族、信號(hào)分子等調(diào)控［12-13］。

1.1合成途徑

作為一種二萜類物質(zhì)，赤霉素生物合成與其他萜類物質(zhì)類似，主要分為3個(gè)階段。第一階段是牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸（GGPP）的合成，在真菌中它由乙酰輔酶A通過甲羥戊酸（MVA）途徑合成甲羥戊酸，再經(jīng)過5-磷酸甲羥戊酸、5-焦磷酸甲羥戊酸、異戊烯焦磷酸（IPP）、3,3-二甲烯丙基焦磷酸、牻牛兒基焦磷酸（GPP）、法尼基焦磷酸（FPP）而得到［14］；而在植物中IPP合成主要是通過甲基赤藻糖磷酸（MEP）途徑，由丙酮酸和3-磷酸甘油醛經(jīng)過多步催化反應(yīng)合成IPP，后續(xù)合成GGPP則與真菌類似。第二階段是GA12-醛的合成，是由GGPP經(jīng)過古巴焦磷酸合成酶（CPS）和內(nèi)根-貝殼杉烯合成酶（KS）催化，第一次環(huán)化合成內(nèi)根-貝殼杉烯，該反應(yīng)為赤霉素合成的限速步驟［15］；內(nèi)根-貝殼杉烯的C-19位的甲基經(jīng)細(xì)胞色素P450-4單氧化酶的一系列催化下合成內(nèi)根-貝殼杉烯酸，內(nèi)根-貝殼杉烯酸再經(jīng)過P450-1單氧化酶兩步催化合成GA12-醛。在此階段中，高等植物和真菌的赤霉素合成途徑是基本相似的［16］。第三階段赤霉素的合成，在真菌中GA12-醛首先經(jīng)過羥基化合成GA14-醛，再經(jīng)過一系列催化步驟合成GA3；而在高等植物中GA12-醛先經(jīng)過19C的氧化合成GA12，再經(jīng)過一系列氧化去飽和合成GA1等［17-19］。具體合成途徑如圖2所示。

1.2調(diào)控機(jī)制

類似于其他微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物，在高濃度氮源條件下赤霉素合成基因表達(dá)受到嚴(yán)格的限制。在藤倉赤霉的發(fā)酵中只有在氮源限制時(shí)赤霉素才被大量合成［20］。研究表明赤霉素是第一個(gè)嚴(yán)格依賴GATA型的轉(zhuǎn)錄因子AreA的次級(jí)代謝產(chǎn)物。轉(zhuǎn)錄因子AreA能夠直接結(jié)合到赤霉素合成基因的啟動(dòng)子上，進(jìn)而調(diào)控赤霉素合成基因的表達(dá)［21］。近年MICHIELSE等［22］發(fā)現(xiàn)第二個(gè)GATA轉(zhuǎn)錄因

子——AreB，也是赤霉素合成基因表達(dá)所必不可少的。在藤倉赤霉中，谷氨酰胺合成酶（glutamine synthetase）是另一個(gè)次級(jí)代謝產(chǎn)物的調(diào)控因子，也是合成谷氨酰胺的唯一酶。谷氨酰胺是最容易利用的氮源，其較高濃度時(shí)強(qiáng)烈抑制所有氮源限制基因的表達(dá)。當(dāng)谷氨酰胺合成酶被移除后，細(xì)胞內(nèi)谷氨酰胺的濃度處于較低水平，赤霉素合成基因則會(huì)大量表達(dá)。然而有學(xué)者發(fā)現(xiàn)當(dāng)編碼谷氨酰胺合成酶的基因GLN1被敲除后，相反所有赤霉素合成基因表達(dá)水平均下降，導(dǎo)致赤霉素的產(chǎn)量降低［23］。在藤倉赤霉中Velvet蛋白家族的全局調(diào)控因子FfVel1、FfVelB也影響赤霉素合成基因的表達(dá)。FfVel1能夠促進(jìn)赤霉素的合成。當(dāng)它被移除后幾乎不合成赤霉素［24］。任何次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成均是應(yīng)對(duì)某種環(huán)境因素的刺激。腺苷酸環(huán)化酶（adenylyl cyclase）能夠刺激合成環(huán)磷酸腺苷（cAMP），隨后激活蛋白激酶A（Pka）。而Pka能對(duì)目的蛋白進(jìn)行磷酸化修飾，從而改變蛋白活性［25］。MICHIELSE等［13］與GARCíA-MARTíNEZ等［26］研究均發(fā)現(xiàn)在藤倉赤霉中，當(dāng)腺苷酸環(huán)化酶編碼基因被敲除后，細(xì)胞內(nèi)赤霉素的積累水平急劇下降。

圖2　赤霉素生物合成途徑

2　菌 種

自1959年日本科學(xué)家首次將赤霉素從水稻病原菌的培養(yǎng)基中分離出來，逐漸發(fā)現(xiàn)赤霉素廣泛存在于植物、微藻以及部分真菌和細(xì)菌中。雖然植物中含有多種赤霉素，但含量較少，僅僅滿足自身需求，不適合工業(yè)化生產(chǎn)。目前用于工業(yè)化生產(chǎn)的是絲狀真菌藤倉赤霉（Fusarium fujikuroi），具有易于培養(yǎng)、產(chǎn)量高等優(yōu)點(diǎn)。在藤倉赤霉菌菌種的研究方面，外國學(xué)者早期主要集中于通過物理誘變或化學(xué)誘變，或通過原生質(zhì)體化及再生作用，得到了大量有關(guān)赤霉素合成途經(jīng)缺失的突變體，以分析赤霉素的合成途徑。例如BEARDER等［27］通過紫外誘變獲得突變菌株B1-41a，其內(nèi)根-貝殼杉烯氧化酶基因缺失無法合成赤霉素。CANDAU等［28］通過亞硝基胍誘變獲得突變菌株SG123、SG133，其C-13羥化酶的基因缺失導(dǎo)致不能合成GA3而是大量積累GA7。LALE等［29］通過紫外誘變獲得菌絲長度較短的突變菌株，有利于提高發(fā)酵過程中的溶氧水平，GA3產(chǎn)量提高近兩倍。而國內(nèi)關(guān)于赤霉素高產(chǎn)菌株研究主要開始于“九二零菌種選育協(xié)作組”所篩選到的高產(chǎn)變種“4303”，該菌成為國內(nèi)工業(yè)化生產(chǎn)上主要菌株。但是該菌為營養(yǎng)繁殖，無法生產(chǎn)孢子且為多核菌絲，給后續(xù)誘變帶來困難。近年來研究者主要通過制備原生質(zhì)體進(jìn)行誘變篩選高產(chǎn)菌株。例如余卿等［30］對(duì)赤霉素生產(chǎn)菌株85104的原生質(zhì)體進(jìn)行紫外誘變獲得高產(chǎn)菌株，產(chǎn)量提高近32%。李武軍等［31］通過對(duì)藤倉赤霉菌207融合重組誘變獲得高產(chǎn)菌株，產(chǎn)量提高近25%。張金兒、王衛(wèi)［32-34］等采用氯霉素、脂肪酶、制菌霉素、萘比特芬等不同的半理性、理性的篩選方法獲取高產(chǎn)菌株。本文作者課題組在菌種選育方面也做了不少工作，已通過常壓常溫等離子體誘變（ARTP）以及采用酮康唑?yàn)楹Y選壓力獲得赤霉素產(chǎn)量較高且遺傳穩(wěn)定的優(yōu)勢菌株。近年來國內(nèi)外主要赤霉素高產(chǎn)菌株研究概況如表1所示。

表1　不同赤霉素高產(chǎn)菌株研究概況

3　發(fā)酵過程

發(fā)酵過程的優(yōu)化與優(yōu)良菌種一樣是提高產(chǎn)物產(chǎn)量必不可少的策略。發(fā)酵過程優(yōu)化主要包括對(duì)最佳營養(yǎng)因素、發(fā)酵條件、發(fā)酵工藝的研究與探索。研究者發(fā)現(xiàn)藤倉赤霉的發(fā)酵過程的參數(shù)以及發(fā)酵工藝對(duì)赤霉素的產(chǎn)量和品質(zhì)影響巨大。

3.1營養(yǎng)因素

3.1.1氮源

氮源的濃度和種類對(duì)發(fā)酵產(chǎn)赤霉素至關(guān)重要，因?yàn)槌嗝顾刂挥性诘聪拗频那闆r下才開始合成［45］。所有的研究都指出高濃度的赤霉素含量均是在低濃度的氮源條件下才能積累［46］。常用的無機(jī)氮源有硫酸銨、氯化銨，有機(jī)氮源有甘氨酸、酒石酸銨、植物粉、玉米漿等［47］。GOHLWAR等［48］發(fā)現(xiàn)在乳清培養(yǎng)基中添加含氮化合物時(shí)，生物量會(huì)急劇增加，但赤霉素的含量卻在降低。而VASS等［49］發(fā)現(xiàn)在低溶度的銨鹽或者硝酸鹽的培養(yǎng)基中添加少量的玉米漿、花生粉、大豆粉等能夠促進(jìn)赤霉素的合成。原因可能是這些復(fù)合物中含有赤霉素合成的前體物質(zhì)或者促進(jìn)劑。CANDAU等［50］發(fā)現(xiàn)無論是發(fā)酵開始存在或者中途添加硝酸根離子、銨根離子和谷氨酰胺都會(huì)抑制赤霉素的合成。SANCHEZ-FERNANDEZ等［51］同樣發(fā)現(xiàn)包括尿素和氨基酸都是赤霉素合成的抑制劑。LALE等［52］研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)用小麥蛋白代替脫脂豆粕作為氮源時(shí)，GA3的含量大大降低，而GA4的含量卻增加了兩倍多。本文作者課題組通過對(duì)十余種氮源進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)脫脂豆粕為最優(yōu)氮源。這說明氮源的種類還會(huì)影響赤霉素合成途徑中酶的活性。

3.1.2碳源

不同的研究者嘗試過不同種類的碳源用來生產(chǎn)赤霉素。主要可以分為速效碳源和遲效碳源，兩者也經(jīng)常以不同的比例混合使用。葡萄糖和蔗糖是經(jīng)常使用的兩種碳源，但葡萄糖的初始濃度不能超過20%，否則會(huì)引起代謝抑制阻斷赤霉素的合成［46］。GONZáLLEZ等［53］發(fā)現(xiàn)蔗糖和淀粉的混合物是發(fā)酵產(chǎn)赤霉素的最優(yōu)碳源。GANCHEVA等［54］發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵中添加油脂，例如葵花籽油、大豆油，有利于提高赤霉素的產(chǎn)量。主要原因可能是由于赤霉素合成中需要乙酰輔酶A的提供，而油脂代謝過程能夠提供大量乙酰輔酶A；另外油脂作為碳源也不會(huì)引起碳代謝抑制。一些廉價(jià)的工業(yè)廢料如牛奶乳清、甜菜渣、糖蜜也常作為碳源使用。而國內(nèi)赤霉素的工業(yè)化生產(chǎn)大多使用經(jīng)過淀粉酶液化的淀粉作為碳源，這樣不僅可以降低成本，而且還可同時(shí)提供速效碳源（如葡萄糖）和遲效碳源（如糊精、淀粉），供細(xì)胞生長和赤霉素積累的需要。

3.1.3無機(jī)鹽與微量物質(zhì)

除了碳源、氮源，鎂、鉀、鋅等無機(jī)鹽也是

赤霉素積累的必須營養(yǎng)因素。JEFFERYS［55］發(fā)現(xiàn)，添加單種金屬離子時(shí)，微量鋅能有效促進(jìn)藤倉赤霉產(chǎn)赤霉素；添加多種金屬離子時(shí)，鋅、鉬、銅的共同作用能有效促進(jìn)藤倉赤霉產(chǎn)赤霉素。而其他微量物質(zhì)作為前體或者促進(jìn)劑的添加對(duì)赤霉素的合成也有一定的促進(jìn)作用，例如，維生素B1、谷氨酸等。CIHANGIR［56］發(fā)現(xiàn)在黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)赤霉素時(shí)添加少量的甲羥戊酸時(shí)，赤霉素的產(chǎn)量可以提高近50mg/L。

3.2發(fā)酵參數(shù)

3.2.1pH

pH是對(duì)發(fā)酵產(chǎn)赤霉素影響最大的因素之一，它主要影響赤霉素的含量以及赤霉素的種類。對(duì)于GA3的生產(chǎn)，pH值主要在3.5～5.8之間，過高（＞6.0）則偏向于生產(chǎn)GA4和GA7，過低（＜3.5）則偏向于生產(chǎn)GA1［6］。主要原因可能是過高pH促進(jìn)中間代謝物GA4和GA7等分泌到胞外而不能再轉(zhuǎn)運(yùn)回胞內(nèi)繼續(xù)合成終產(chǎn)物GA3，另外的原因可能pH影響赤霉素合成途徑中的酶的活性［57］。MELEIGY等［43］在串珠鐮孢發(fā)酵產(chǎn)赤霉素時(shí)發(fā)現(xiàn)在pH為5時(shí)，總赤霉素產(chǎn)量為2.25g/L；當(dāng)pH為3和7時(shí)，總赤霉素的產(chǎn)量分別為0.36g/L和0.21g/L。在固體發(fā)酵中，pH測定比較復(fù)雜。因而固體發(fā)酵產(chǎn)赤霉素時(shí)，一般很少考慮pH。ESCAMILLA等［41］在固定化發(fā)酵中發(fā)現(xiàn)初始pH為5時(shí)赤霉素產(chǎn)量最高。

3.2.2溫度

溫度對(duì)赤霉素產(chǎn)量的影響與菌株的種類相關(guān)。利用藤倉赤霉或者串珠鐮孢發(fā)酵產(chǎn)赤霉素時(shí)，提出過的最適溫度分別有25℃、27℃、28℃、29℃、30℃［58-61］。JEFFERYS［55］發(fā)現(xiàn)在藤倉赤霉中31～32℃利于菌體生長，而29℃更利于產(chǎn)物赤霉素的合成，高于29℃赤霉素的產(chǎn)量則急劇下降。MELEIGY等［43］發(fā)現(xiàn)在串珠鐮孢培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，在30℃時(shí)赤霉素的產(chǎn)量最高可達(dá)1.84g/L。隨著溫度的升高赤霉素的產(chǎn)量開始下降，直到40℃時(shí)赤霉素的合成受到抑制。ESCAMILLA等［41］發(fā)現(xiàn)在流化床中培養(yǎng)固定化藤倉赤霉產(chǎn)赤霉素時(shí)，在30℃時(shí)赤霉素的產(chǎn)量最高。

3.2.3溶氧

赤霉素發(fā)酵過程是需氧過程，整個(gè)發(fā)酵過程都需要充足氧氣的供應(yīng)。除了菌體正常生長所需的氧氣，赤霉素的合成也需要大量氧氣的參與。因?yàn)樵诔嗝顾睾铣赏緩街猩婕暗皆S多氧化步驟，如細(xì)胞色素P450單加氧酶、雙加氧酶、脫氫酶所催化的反應(yīng)都需要氧氣的參與，所以在赤霉素生產(chǎn)過程合適的溶氧供給至關(guān)重要［62］。當(dāng)發(fā)酵過程中溶氧供應(yīng)過低時(shí)會(huì)導(dǎo)致菌絲體內(nèi)的代謝發(fā)生改變，厭氧呼吸產(chǎn)生大量對(duì)細(xì)胞有毒害作用的乙醇、乙酸等；同時(shí)赤霉素的合成受到抑制并產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物；造成pH急劇下降，菌絲體自溶，發(fā)酵終止，從而產(chǎn)量偏低。在實(shí)際生產(chǎn)中，可以通過提高轉(zhuǎn)速、通氣量，添加氧載體、表面活性劑以及改變發(fā)酵方式等保證氧氣的供應(yīng)。但是發(fā)酵過程中并不是溶氧越高越好，當(dāng)溶氧過高時(shí)，不但會(huì)造成溶氧過剩提高生產(chǎn)成本，而且也會(huì)造成一些副產(chǎn)物的大量合成如脂肪酸等，赤霉素的產(chǎn)量反而降低。BORROW等［63］發(fā)現(xiàn)在通氣中加入少量的二氧化碳能夠大大減少延滯期，GA3的最終產(chǎn)量達(dá)0.62g/L，而不添加二氧化碳赤霉素的產(chǎn)量僅僅0.42g/L。MACHADO等［64］在固體發(fā)酵期間發(fā)現(xiàn)在發(fā)酵72h之前提供較低的溶氧［0.24L/（h·kg）］，而在其后提供高供氧［0.72L/（h·kg）］，GA3的產(chǎn)量可達(dá)到最高。莊木坤［65］通過基因工程手段將透明顫菌血紅蛋白基因（vgb）整合到藤倉赤霉菌染色體中，得到轉(zhuǎn)化菌株，該工程菌對(duì)發(fā)酵過程中溶氧的需求降低，從而降低發(fā)酵成本，在低溶氧條件下也能獲得較高赤霉素的產(chǎn)量。

3.3發(fā)酵工藝

赤霉素的發(fā)酵工藝有著長足的發(fā)展歷史。最早由日本學(xué)者通過表面培養(yǎng)方式產(chǎn)赤霉素，但產(chǎn)量極低［66］。隨著固體發(fā)酵技術(shù)的成熟以及固體發(fā)酵法生產(chǎn)具有設(shè)備簡單、操作容易等優(yōu)點(diǎn)，赤霉素的固體發(fā)酵在20世紀(jì)五六十年代已成功應(yīng)用。FOCKE等［67］第一次利用玉米廢棄物作為固體培養(yǎng)基生產(chǎn)赤霉素。后來研究者發(fā)現(xiàn)利用麥麩替換玉米廢棄物赤霉素的產(chǎn)量能夠提高1.6倍［68］。KUMAR等［69］指出在同等含量的碳水化合物的培養(yǎng)基中，在固體發(fā)酵中赤霉素的產(chǎn)量可以達(dá)到液體發(fā)酵的1.6倍。RODRIGUES等［42］發(fā)現(xiàn)利用檸檬果肉作為底物時(shí)赤霉素的產(chǎn)量可達(dá)5.9g/kg。但固體發(fā)酵也存在一些明顯的缺點(diǎn)，如固體發(fā)酵過程穩(wěn)定性差，各項(xiàng)參數(shù)（pH、溶氧、溫度等）不易檢測與控制，無法實(shí)現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)?，F(xiàn)在赤霉素工業(yè)化生產(chǎn)多采用液體深層發(fā)酵。人們對(duì)赤霉素液體發(fā)酵的研究，除了對(duì)營養(yǎng)因素、發(fā)酵參數(shù)、前體的添加等研究之外，也對(duì)不同的液體發(fā)酵工藝進(jìn)行嘗試。SHUKLA等［44］采用反復(fù)分批發(fā)酵方式，赤霉素的產(chǎn)量為1.31g/L，大大縮短了發(fā)酵周期，降低了發(fā)酵成本。連續(xù)發(fā)酵也成功應(yīng)用于赤霉素的生產(chǎn)，不過由于生產(chǎn)成本過高，并沒有在大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用［70］。近年來由于固定化發(fā)酵技術(shù)的成熟以及該技術(shù)的經(jīng)濟(jì)性，很多學(xué)者都對(duì)赤霉素生產(chǎn)菌的固定化發(fā)酵進(jìn)行研究［71-74］。常用的固定化材料有聚氨酯、卡拉膠、海藻酸鈣、硅藻土等。ESCAMILLA等［41］在流化床中培養(yǎng)固定化的藤倉赤霉產(chǎn)GA3，通過優(yōu)化pH、碳氮比、米粉濃度和溫度后，產(chǎn)物的濃度是之前懸浮和固體發(fā)酵濃度的3倍以上。但固定化大規(guī)模生產(chǎn)赤霉素也存在很多問題，例如菌種的退化、無菌環(huán)境的維持、發(fā)酵過程的控制等。隨著固定化材料、生物反應(yīng)器、發(fā)酵過程控制的發(fā)展，大規(guī)模固定化生產(chǎn)赤霉素將會(huì)實(shí)現(xiàn)。由于赤霉素發(fā)酵中存在產(chǎn)物反饋抑制和赤霉素在水溶液中易于降解失去生物活性的問題導(dǎo)致產(chǎn)量降低，研究者通過采取萃取發(fā)酵工藝解決以上問題。例如HOLLMANN等［75］發(fā)現(xiàn)通過萃取發(fā)酵赤霉素的產(chǎn)量提高了近2倍。但是該工藝存在價(jià)格昂貴等問題，難以大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。

4　分離純化

赤霉素的分離純化過程中主要關(guān)鍵問題在于保持赤霉素的活性、高得率和高純度。最早用于赤霉素分離的方法是活性炭吸附法。該法先利用活性炭吸附赤霉素，然后再通過甲醇或者丙酮萃取獲取產(chǎn)量。該方法價(jià)格昂貴，效率低下，不宜大規(guī)模生產(chǎn)使用［76］。20世紀(jì)60年代后主要的分離方法為有機(jī)溶劑的液液萃取。常用的有機(jī)溶劑有乙酸乙酯、乙酸丁酯、丁醇等。該法的純化效率可達(dá)40%以上。但是該方法需要大量的有機(jī)溶劑，回收成本昂貴，同時(shí)萃取過程中不可避免的會(huì)帶來一些色素、有機(jī)酸等副產(chǎn)物。第三種常用的分離純化方法為吸附法，主要分為吸附樹脂分離法和離子交換分離法。吸附樹脂分離法主要通過樹脂對(duì)赤霉素的選擇性吸附富集，再用有機(jī)溶劑洗脫下來。常用的樹脂是大孔吸附樹脂。王瑞芳等［77］通過大孔樹脂吸附法提純赤霉素，最終收率高達(dá)95%。由于赤霉素為一種弱酸，常采用強(qiáng)堿性陰離子交換樹脂，對(duì)赤霉素離子交換提純。萬金保等［78］利用強(qiáng)堿性苯乙烯系陰離子交換樹脂提純赤霉素，總收率達(dá)到80%。目前工業(yè)化生產(chǎn)逐漸采用膜分離法。因?yàn)槟し蛛x法具有分離條件溫和、分離效率高、能耗低等優(yōu)點(diǎn)。但是也存在膜的使用周期短以及價(jià)格昂貴的缺點(diǎn)。因此研究新型廉價(jià)、耐用的分離膜是進(jìn)一步促進(jìn)膜分離法大規(guī)模應(yīng)用的關(guān)鍵問題。

5　展 望

赤霉素作為一種植物激素主要對(duì)植物生長具有多種生理功能，已廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、林業(yè)、釀造業(yè)等行業(yè)。目前赤霉素的生產(chǎn)主要通過液體深層發(fā)酵方式，產(chǎn)量維持在2g/L左右。但是由于發(fā)酵產(chǎn)量一直無法提升，生產(chǎn)成本居高不下，導(dǎo)致赤霉素?zé)o法大規(guī)模應(yīng)用。今后的研究應(yīng)該集中于以下兩個(gè)方面。

（1）優(yōu)良的菌種是提高發(fā)酵水平最關(guān)鍵的因素之一。菌株的選育應(yīng)該從兩方面研究，一是采取新型的誘變方法（常溫常壓等離子體誘變、γ射線誘變等）以及高通量的篩選方法，以一種理性誘變方式獲取高產(chǎn)菌株；二則通過合成生物學(xué)方法在大腸桿菌或者釀酒酵母等模式生物中構(gòu)建赤霉素合成途徑，獲得高產(chǎn)赤霉素工程菌。

（2）進(jìn)一步對(duì)藤倉赤霉發(fā)酵過程進(jìn)行優(yōu)化。首先根據(jù)藤倉赤霉內(nèi)赤霉素合成的調(diào)控機(jī)制來優(yōu)化宏觀的發(fā)酵條件，以微觀指導(dǎo)宏觀，其次改變傳統(tǒng)的發(fā)酵方式，如采用新型的生物反應(yīng)器，達(dá)到提高赤霉素產(chǎn)量的目的。

（3）開發(fā)高效低耗的赤霉素分離純化工藝，以較低成本獲取高品質(zhì)的赤霉素產(chǎn)品。

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Fermentative production of gibberellins：a review

PENG Hui1，SHI Tianqiong1，NIE Zhikui2，GUO Dongsheng1，HUANG He1，JI Xiaojun1
（1State Key Laboratory of Materials-Oriented Chemical Engineering，College of Biotechogy and Pharmaceutical Engineering，Nanjing Tech University，Nanjing 211816，Jiangsu，China；2Jiangxi New Reyphon Biochemical Co.，Ltd.，Xingan 331300，Jiangxi，China）

Gibberellins（GAs）are one of the five plant hormones which play an important role in plant growth and development. They affect stem elongation，seed germination，elimination of dormancy，flowering and so on. Gibberellins have been widely used in the agriculture，forestry and brewing industries，and have brought great economic benefits. The industrial production of gibberellins is based on submerged fermentation by Fusarium fujikuroi. Although gibberellins have a diversity of applications and huge economic benefits，high production costs severely restrict their widespread application. This review summarizes the metabolic pathway and the regulatory mechanism for gibberellins biosynthesis. Also，the strains，nutritional factors，fermentation conditions，fermentation techniques and separation and purification process are discussed in detail. Meanwhile，it is pointed out that the focus of future research should be placed on screening high-yield strains as well as improving fermentation technology，in order to reduce the production cost and achieve large-scale application of gibberellins.

gibberellins；terpene；fermentation；Fusarium fujikuroi

Q 939.97

A

1000-6613（2016）11-3611-08

10.16085/j.issn.1000-6613.2016.11.034

2016-04-12；修改稿日期：2016-07-15。

國家自然科學(xué)基金（21376002，21476111）、江蘇省自然科學(xué)基金（BK20131405）及江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程項(xiàng)目。

彭輝（1992—），男，碩士研究生。聯(lián)系人：紀(jì)曉俊，副教授，研究方向?yàn)槲⑸锎x工程。E-mail xiaojunji@njtech.edu.cn。