劉 蕾，劉 義，李平蘭*

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，北京 100083）

益生菌生物被膜的研究進(jìn)展

劉 蕾，劉 義，李平蘭*

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，北京 100083）

益生菌是指當(dāng)以足夠數(shù)量存在時可對機(jī)體健康產(chǎn)生有益作用的活的微生物。近年來，由于其對機(jī)體具有保健和治療作用，因而受到越來越多的關(guān)注。生物被膜是細(xì)菌分泌的多糖，纖維蛋白和脂蛋白等物質(zhì)將細(xì)菌自身包裹其中，吸附在生物材料或機(jī)體腔道等表面而形成的膜樣復(fù)合物，是自然狀態(tài)下許多細(xì)菌所選擇的生存方式。但是關(guān)于益生菌生物被膜的研究還比較少，且尚處于起步階段。本綜述圍繞益生菌生物被膜的形成、階段特征、影響因素、優(yōu)勢及調(diào)控機(jī)制等展開分析，并指出益生菌生物被膜的相關(guān)研究將會是益生菌研究領(lǐng)域的一個重要發(fā)展方向。

益生菌；生物被膜；影響因素；調(diào)控機(jī)制

根據(jù)世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）對益生菌的定義，益生菌是指當(dāng)以足夠數(shù)量存在時可對機(jī)體健康產(chǎn)生有益作用的活的微生物，包括細(xì)菌和真菌。長久以來，傳統(tǒng)觀點(diǎn)一直認(rèn)為益生菌是一種食品補(bǔ)充劑。但是近年來的研究結(jié)果表明益生菌還具有許多治療作用，如用于治療皮膚炎、哮喘、節(jié)段性回腸炎、肝源性腦病、鼻炎、結(jié)腸直腸癌以及胃腸道感染等［1-4］。在英國，大約有70%的醫(yī)生利用益生菌作為處方藥物對胃腸道疾病的患者進(jìn)行治療［5］。目前，益生菌不再被簡單的認(rèn)為僅僅是一種食品補(bǔ)充劑，其營養(yǎng)保健及治療作用也得到越來越多的關(guān)注。因此，如何更好地發(fā)揮益生菌的益生作用引起了研究人員的廣泛關(guān)注。

生物被膜是細(xì)菌利用分泌的多糖，纖維蛋白和脂蛋白等物質(zhì)將其自身包裹其中，并吸附在生物材料或機(jī)體腔道等表面而形成的膜樣復(fù)合物［6-7］，是大多數(shù)細(xì)菌在自然狀態(tài)下的生長方式。由于生物被膜的形成與細(xì)菌的毒力、耐藥性及群體性行為密切相關(guān)，所以關(guān)于有害微生物生物被膜的研究非常多，也取得了很大的進(jìn)展［8-11］。但與此同時，關(guān)于有益微生物生物被膜的研究卻相當(dāng)匱乏，尚處于起步階段。有研究報(bào)道稱生物被膜狀態(tài)下的益生菌比浮游狀態(tài)下的益生菌具有更顯著的免疫調(diào)節(jié)作用［12］。也有相關(guān)報(bào)道稱與常規(guī)益生菌微制劑相比，高密度生物被膜狀態(tài)下益生菌制備的微制劑具有更好的抗冷凍干燥能力、耐熱性和耐酸性［13］。因此，對益生菌生物被膜展開相關(guān)的研究，不僅對闡明益生菌益生機(jī)理具有重要意義，而且對研發(fā)、生產(chǎn)高效的益生菌微制劑具有指導(dǎo)作用。本文概括總結(jié)了益生菌生物被膜的形成過程、階段特征和影響因素，益生菌生物被膜狀態(tài)時的優(yōu)勢，以及益生菌生物被膜形成的調(diào)控機(jī)制。

1 益生菌生物被膜的形成過程、階段特征及影響因素

近數(shù)十年來，研究人員發(fā)現(xiàn)生物被膜不是細(xì)菌個體的簡單堆積，而是細(xì)菌菌體及胞外分泌物如多糖、纖維蛋白、脂蛋白等相互作用而形成的具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)的膜樣物質(zhì)［14-16］。生物被膜形成過程中的細(xì)菌會啟動一系列基因的表達(dá)，并且與浮游狀態(tài)時的基因表達(dá)方式顯著不同［17］。在自然環(huán)境中大多數(shù)細(xì)菌都以生物被膜的狀態(tài)生存，以傳統(tǒng)的培養(yǎng)方式培養(yǎng)益生菌并不能模擬其真實(shí)的生長狀態(tài)，故在此基礎(chǔ)上對其益生功能展開研究也具有一定的缺陷。因此，闡明益生菌生物被膜的形成過程、特征及影響因素等有利于進(jìn)一步揭示益生菌的益生功效。

與大多數(shù)細(xì)菌一樣，益生菌的生物被膜形成及發(fā)展過程主要分為以下5 個階段：第一階段是細(xì)菌細(xì)胞對表面基質(zhì)的初始附著；第二階段是附著的細(xì)菌分泌胞外多聚物從而促進(jìn)細(xì)菌對表面基質(zhì)進(jìn)行不可逆地附著；第三階段是生物被膜結(jié)構(gòu)形態(tài)的初步形成和發(fā)展；第四階段是生物被膜結(jié)構(gòu)形態(tài)的成熟；第五階段是生物被膜中個體細(xì)胞的脫落。脫落的個體細(xì)胞可以再次附著，并形成一個新的生物被膜。通過這5 個階段，細(xì)菌生物被膜完成了附著、形成、成熟、老化脫落、再重新附著的循環(huán)過程（圖1）［18］。在生物被膜形成的各個階段，細(xì)菌不同的基因轉(zhuǎn)錄翻譯成不同的蛋白質(zhì)，參與生物被膜的形成。Sauer等［17］發(fā)現(xiàn)在Pseudomonas aeruginosa生物被膜形成的各階段中有35%（大約有525 種蛋白）的蛋白表現(xiàn)出了差異。而且，浮游狀態(tài)下的菌體細(xì)胞與生物被膜脫落期的細(xì)胞更為相似，但是與生物被膜成熟時期的菌體細(xì)胞相比，二者有超過800 個蛋白（占所有蛋白的50%都表現(xiàn)出了6 倍以上的差異）［17］。此外，研究表明益生菌可以抑制或干擾致病菌生物被膜的形成，如益生菌Lactobacillus rhamnosus GR-1和Lactobacillus reueri RC-14可以完全抑制Candida glabrata形成生物被膜［19］。Vuotto等［20］報(bào)道可以利用益生菌來對抗生物被膜相關(guān)的感染性疾病，如蛀齒、牙周病、口臭、泌尿生殖道及傷口感染。然而對于益生菌自身而言，在其生物被膜形成的各階段，哪些基因和蛋白質(zhì)發(fā)揮了關(guān)鍵作用還尚未闡明。

細(xì)菌生物被膜是高度結(jié)構(gòu)化的，在其形成發(fā)展的過程中發(fā)生了一系列形態(tài)學(xué)的變化。在最初的階段，附著在表面基質(zhì)的細(xì)菌個體細(xì)胞被其分泌的胞外多聚物包裹，開啟了生物被膜的形成，其中許多細(xì)菌還可以通過菌毛的運(yùn)動來自由地移動。這些初始附著的細(xì)菌還沒有開始進(jìn)行生物被膜形成過程中的分化階段，因此很多細(xì)菌還可以離開基質(zhì)表面重新回到之前的浮游狀態(tài)。之后細(xì)菌開始啟動一系列基因的表達(dá)，分泌胞外多糖等物質(zhì)，使細(xì)菌不可逆地黏附到基質(zhì)表面。有研究報(bào)道稱Pseudomonas aeruginosa在初始附著的15 min內(nèi)，藻酸鹽基因表達(dá)迅速上調(diào)，產(chǎn)生大量藻酸鹽，促進(jìn)生物被膜的形成。在生物被膜的成熟階段，細(xì)菌生物被膜的復(fù)雜結(jié)構(gòu)及水通道結(jié)構(gòu)逐漸形成，位于底層的細(xì)菌也開始進(jìn)行重新分布。接下來，一些細(xì)菌小菌落可能從基質(zhì)表面脫落，重新回到浮游狀態(tài)，同時留下一些空洞形成水通道。除此之外，小菌落可能在沒有明顯的外界干擾時整體從生物被膜中脫落。在整個生物被膜中，這些現(xiàn)象并不是同步發(fā)生的，因此在同一時間生物被膜中的小區(qū)域常常處在不同的發(fā)展階段（圖2）［21］。益生菌中包含多數(shù)兼性厭氧菌和嚴(yán)格厭氧菌，其生物被膜的結(jié)構(gòu)是怎樣的以及在其形成過程中哪些基因發(fā)揮重要作用還要需要進(jìn)一步研究。

影響益生菌生物被膜形成的因素眾多，除去自身基因調(diào)控的因素外，外界環(huán)境的諸多因素都會影響其生物被膜的形成，例如菌體附著表面的材質(zhì)、水流的沖刷作用、pH值、過高的滲透壓、膽鹽的存在、黏液素的存在以及非消化性多糖的存在等，都會明顯干擾益生菌生物被膜的形成的發(fā)展［23］。有研究報(bào)道稱培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)的缺乏及限制碳源營養(yǎng)物質(zhì)供給都會促進(jìn)Lactobacillus rhamnosus GG生物被膜的形成，黏液素等物質(zhì)可能促進(jìn)Lactobacillus rhamnosus GG附著到基質(zhì)表面，與此同時生物被膜狀態(tài)下的Lactobacillus rhamnosus GG比懸液培養(yǎng)時對低pH值的環(huán)境更為敏感，而且研究結(jié)果表明胞外多糖編碼基因wzb，脂磷壁酸編碼基因dltD，中心代謝參與基因luxS與Lactobacillus rhamnosus GG生物被膜的形成有關(guān)［23］。此外，Brink等［24］發(fā)現(xiàn)當(dāng)表面液體流速降低時，葡萄糖代謝產(chǎn)生的3-羥基-丁酮減少，NADH的消耗量減少，乳酸菌可以產(chǎn)生的更多的胞外聚合物，這有利于生物被膜的形成。Slizova等［25］研究了分離自豬腸道內(nèi)的羅伊氏乳桿菌Lactobacillus reuteri L2/6生物被膜的形成條件和影響因素，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中吐溫-80及糖的含量和種類在生物被膜形成過程中發(fā)揮重要作用。因此，益生菌生物被膜的形成受到多種因素的影響，通過對外界因素的控制，可以提高益生菌的生物形成量，對實(shí)際生產(chǎn)具有指導(dǎo)意義。

2 益生菌生物被膜生長狀態(tài)的優(yōu)勢

自然環(huán)境中大多數(shù)的細(xì)菌都選擇以生物被膜的狀態(tài)生存，這是因?yàn)闊o論是單菌種形成的生物被膜，還是多菌種形成的更為復(fù)雜的生物被膜，對細(xì)菌本身而言都具有浮游狀態(tài)所不可比擬的優(yōu)勢。概括地說，像大多數(shù)細(xì)菌一樣，益生菌生物被膜也具有以下幾個優(yōu)勢。首先，形成生物被膜的細(xì)菌在生理功能上像一個整體般發(fā)揮作用。在牛的瘤胃中，各種環(huán)境和細(xì)菌形成一個獨(dú)特的小生態(tài)系統(tǒng)，多種細(xì)菌共生，它們常常附著在纖維素等表面，形成復(fù)雜的多菌種生物被膜，共同協(xié)調(diào)作用對營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行分解代謝［26］。其次，生物被膜中的細(xì)菌在行為表現(xiàn)上像一個整體起到相互協(xié)調(diào)的作用。研究發(fā)現(xiàn)黏細(xì)菌在營養(yǎng)物質(zhì)充足的條件下常?；瑒又翣I養(yǎng)物質(zhì)濃度高的地區(qū)，而在干燥或營養(yǎng)物質(zhì)匱乏的條件下個體細(xì)胞分化形成包囊，整個生物被膜形成更為復(fù)雜的結(jié)構(gòu)［27］。當(dāng)然，生物被膜高度的結(jié)構(gòu)化也為其中的細(xì)菌個體提供了有利的生存環(huán)境。位于生物被膜不同位置的細(xì)菌個體接觸不同的微環(huán)境，其生長狀態(tài)不同，但是高度的結(jié)構(gòu)化使得不同位置的細(xì)菌都能夠接觸到營養(yǎng)物質(zhì)，并且采取與所處微環(huán)境相適宜的方式生存，從整體上保障整個細(xì)菌群體的生存［21］。此外，研究發(fā)現(xiàn)非致病性細(xì)菌的生物被膜形成對于其在體內(nèi)生態(tài)系統(tǒng)中穩(wěn)定存在發(fā)揮重要作用，而且可以抑制致病菌的生長和黏附［28-29］。

目前有研究報(bào)道發(fā)現(xiàn)，生物被膜的形成有助于乳桿菌發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，Rieu等［12］將Lactobacillus casei ATCC334生物被膜和浮游狀態(tài)下的培養(yǎng)上清處理人巨噬細(xì)胞分化的單核細(xì)胞THP-1細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)只有生物被膜狀態(tài)下的上清可以抑制腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）的產(chǎn)生和核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）通路的激活。此外，Cheow等［30］將形成高密度生物被膜的Lactobacills rhamnosus制備成微膠囊，其抗冷凍干燥的能力提升了40 倍，而且其耐熱性能也顯著提高。因此，生物被膜中的益生菌通過其生理和行為上的共同調(diào)節(jié)，表現(xiàn)出其浮游狀態(tài)下所不具備的優(yōu)勢（圖3）。由于目前對于益生菌生物被膜的研究還處于起步階段，因此相關(guān)研究報(bào)道都還很少。生物被膜狀態(tài)下益生菌所具備的優(yōu)勢還有待進(jìn)一步闡明。

3 益生菌生物被膜形成的調(diào)控

益生菌生物被膜形成的調(diào)控分為兩個方面，一是益生菌菌體初始對表面基質(zhì)的感知機(jī)制，二是形成生物被膜后的調(diào)控機(jī)制。由于不同的培養(yǎng)材料材質(zhì)可以直接影響細(xì)菌生物被膜形成的多少和有無，所以細(xì)菌如何識別表面基質(zhì)并作出生理和行為上的調(diào)控是非常重要的。對于細(xì)菌而言，識別表面基質(zhì)并快速地從浮游生存狀態(tài)轉(zhuǎn)變到生物被膜生存狀態(tài)是一個巨大的挑戰(zhàn)。其中，Guttenplan等［31］發(fā)現(xiàn)在Bacillus subtilis的生物被膜形成過程中，EpsE蛋白在菌體鞭毛上形成簇狀結(jié)構(gòu)，從而阻礙菌體的運(yùn)動。該EpsE蛋白序列與糖基轉(zhuǎn)移酶家族酶類序列相似，而且其保守活性基團(tuán)負(fù)責(zé)胞外多糖（exopolysaccharides，EPS）的合成［31］。本實(shí)驗(yàn)室通過對動物雙歧桿菌RH、植物乳桿菌L31-1和類植物乳桿菌L-ZS9全基因組進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)三者都具有胞外多糖EPS合成基因，其中動物雙歧桿菌RH的EPS基因簇包括42 個基因，其中包括10 個糖基轉(zhuǎn)移酶編碼基因［32］。然而，EPS合成相關(guān)基因在益生菌生物被膜形成過程中的作用還有待進(jìn)一步研究。同時有研究發(fā)現(xiàn)這種對基質(zhì)表面的應(yīng)答反應(yīng)有可能是通過cyclic-di-GMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來實(shí)現(xiàn)的，而且該信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑也參與調(diào)控胞外多糖的產(chǎn)生。胞外多糖不僅僅是生物被膜結(jié)構(gòu)的填充物質(zhì)，同時也具有正反饋調(diào)節(jié)機(jī)制，產(chǎn)生的胞外多糖可以作為信號刺激菌體產(chǎn)生更多的胞外多糖，從而形成適宜厚度的生物被膜［33］。然而，Kolddkin-Gal等［34］報(bào)道稱細(xì)菌的生物被膜也具有一定的生命周期，當(dāng)營養(yǎng)物質(zhì)匱乏和有害代謝產(chǎn)物累積時，細(xì)菌自身產(chǎn)生的D型氨基酸通過引起生物被膜基質(zhì)中蛋白質(zhì)組分的流失從而調(diào)控了生物被膜的脫落。此外，研究人員通過動態(tài)光散射和掃描電子顯微鏡實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)去甲基咪可以直接并特異性地與胞外多糖互作，因此D型氨基酸和去甲基咪共同作用可以破壞成熟的生物被膜［34］。對于益生菌的生物被膜，D型氨基酸和去甲基咪是否發(fā)揮同樣的作用還未闡明。

在生物被膜的逐漸形成和發(fā)展過程中，群體感應(yīng)系統(tǒng)和雙組分調(diào)控系統(tǒng)發(fā)揮著重要的調(diào)控作用［35］。益生菌中的乳桿菌雙歧桿菌等都屬于革蘭氏陽性菌，其種內(nèi)交流的主要信號分子是自誘導(dǎo)肽（autoinducing peptides，AIPs）。在金黃色葡萄球菌中，適宜水平的AIP與ArgC結(jié)合，導(dǎo)致非編碼的小RNA（small RNA，sRNA）即RNA-Ⅲ的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，從而下調(diào)一系列基因的表達(dá)，包括對生物被膜形成所必須的黏附素基因［36］。對于益生菌，本實(shí)驗(yàn)室通過對乳桿菌和雙歧桿菌等全基因組序列的分析發(fā)現(xiàn)，它們的基因組都存在產(chǎn)生種內(nèi)群體感應(yīng)系統(tǒng)的相關(guān)基因，如類植物乳桿菌L-ZS9的基因組序列顯示L-ZS9具有3 個組分群體感應(yīng)調(diào)節(jié)系統(tǒng)基因，包括兩個應(yīng)答調(diào)節(jié)子和一個組氨酸激酶編碼基因。而且，編碼細(xì)菌素的ATP結(jié)合盒式蛋白（ATP-bindingcassette transporter，ABC）、細(xì)菌素免疫蛋白以及細(xì)菌素前體肽PlnE、PlnJ和PlnK等的基因都與群體感應(yīng)調(diào)節(jié)基因相鄰，這提示我們細(xì)菌素的產(chǎn)生可能受到群體感應(yīng)系統(tǒng)的調(diào)控。在自然狀態(tài)或活體腸道中，不同的細(xì)菌總是以生物被膜的形態(tài)共存，而且益生菌常常通過分泌細(xì)菌素來抑制有害病原體的生長，因此群體感應(yīng)系統(tǒng)、細(xì)菌素的產(chǎn)生及生物被膜形成之間的關(guān)系值得研究人員進(jìn)一步研究。此外，本實(shí)驗(yàn)室曾鑒定出維氏氣單胞菌的1型信號分子的種類。為了進(jìn)一步明確益生菌群體感應(yīng)信號分子的種類和作用，需要研究人員更深入的分析。而且AIP如何調(diào)控基因表達(dá)從而調(diào)節(jié)生物被膜的形成還沒有闡明，需要進(jìn)一步的研究。

與此同時，在革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌中都存在種間群體感應(yīng)系統(tǒng)，其產(chǎn)生的信號分子是2型自體誘導(dǎo)物AI-2，其前體物質(zhì)是4，5-羥基-2，3-戊二酮（4，5-dihydroxy-2，3-pentanedion，DPD），DPD是S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine，SAM）代謝的副產(chǎn)物。其中SAM是主要的細(xì)胞甲基化供體，廣泛存在于各種細(xì)菌、真菌及多細(xì)胞生物中，不同的物種具有不同的SAM代謝途徑。SAM將甲基基團(tuán)轉(zhuǎn)移給多種不同的底物，生成了具有毒性的產(chǎn)物S-腺苷同型半胱氨酸（S-adenosylhomocysteine，SAH），通過甲硫腺苷核苷酶MTAN/Pfs和LuxS 2 個蛋白依次轉(zhuǎn)化為S-核糖同型半胱氨酸（S-ribosylhomocysteine，SRH）和同型半胱氨酸，同時生成AI-2的前體物質(zhì)DPD。DPD是一種高活性分子，它經(jīng)過重排及一系列的附加反應(yīng)生成不同的DPD衍生物，可以作為信號分子被不同的細(xì)菌識別，即AI-2。不同的細(xì)菌產(chǎn)生的AI-2結(jié)構(gòu)類似，因此可以實(shí)現(xiàn)不同細(xì)菌之間信號的交流［37-39］。由于在自然環(huán)境中，細(xì)菌常常以多菌種共存的狀態(tài)生存，故自然狀態(tài)下也常常是多菌種共同形成的復(fù)雜的生物被膜，因此種間群體感應(yīng)系統(tǒng)可能發(fā)揮著重要的作用［40-41］。本實(shí)驗(yàn)室通過對多種乳桿菌和雙歧桿菌的全基因組序列分析，發(fā)現(xiàn)它們的基因組中都存在合成AI-2的關(guān)鍵基因luxS和pfs/mtan，其中乳桿菌的luxS基因全長477 bp，pfs/mtan基因全長693 bp，雙歧桿菌luxS基因全長501 bp，pfs/mtan基因全長693 bp，乳桿菌和雙歧桿菌種內(nèi)luxS基因和pfs基因同源性較高，但是二者之間的差異性較大。Sun Zhongke等［42］研究發(fā)現(xiàn)已有的雙歧桿菌基因組序列顯示所有的雙歧桿菌都具有l(wèi)uxS基因，而且其LuxS蛋白的氨基酸序列與哈維氏弧菌的LuxS蛋白相似度很高。但是，研究人員指出傳統(tǒng)培養(yǎng)方法培養(yǎng)與MRS肉湯培養(yǎng)基的雙歧桿菌的上清中并未檢測到AI-2的活性，高濃度的葡萄糖、較低的pH值都會抑制AI-2的活性。同時，過表達(dá)luxS基因的雙歧桿菌重組菌株及外源添加AI-2都使其生物被膜形成能力提高。除了群體感應(yīng)系統(tǒng)，細(xì)菌常常通過雙組份系統(tǒng)對外界信號和刺激進(jìn)行感知和應(yīng)答［43］。益生菌對腸黏膜的黏附能力是其在人體胃腸道內(nèi)定植的先決條件。Uchida等［44］發(fā)現(xiàn)嗜酸乳桿菌利用BIACORE生物傳感器可識別腸黏膜上的A型血抗原從而與其結(jié)合。短乳桿菌ATCC8287的SrtA表面蛋白可參與調(diào)節(jié)菌株對人腸道上皮細(xì)胞系和纖連蛋白的黏附［45］。對于植物乳桿菌而言，其表面有多種蛋白成分，單獨(dú)任何一種蛋白都對菌株體外黏附上皮細(xì)胞的能力有促進(jìn)作用［46］。張莉［47］曾分析過植物乳桿菌C88的黏附機(jī)理，發(fā)現(xiàn)其甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）在黏附過程中發(fā)揮重要作用，GAPDH重組蛋白能夠?qū)崿F(xiàn)黏附在Caco-2單層細(xì)胞的表面、形成占位，從而阻礙了植物乳桿菌C88、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌和福氏志賀氏菌對Caco-2細(xì)胞的黏附。但是對于大多數(shù)益生菌而言，黏附與生物被膜之間的關(guān)系及生物被膜的調(diào)控機(jī)制都還未清楚闡明，本實(shí)驗(yàn)室在該領(lǐng)域進(jìn)行相關(guān)研究，力圖揭示益生菌生物被膜調(diào)控的相關(guān)機(jī)制。

4 結(jié) 語

國內(nèi)外對生物被膜的研究已經(jīng)進(jìn)行了數(shù)十年，并取得了長足的發(fā)展。但是，關(guān)于生物被膜的研究主要集中在致病菌上，這主要是由于目前抗生素耐藥性的問題已迫在眉睫，臨床上生物被膜導(dǎo)致的慢性感染危害人類健康并帶來重大的經(jīng)濟(jì)損失等。然而，對于益生菌生物被膜的相關(guān)研究還處于起步階段。以生物被膜形式生存是大多數(shù)細(xì)菌在自然環(huán)境下的生存狀態(tài)，傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)方法并不能模擬益生菌的自然生存狀態(tài)，因此研究益生菌的生物被膜形成、發(fā)展、調(diào)控以及生物被膜狀態(tài)下益生菌的生理特性，對于闡明益生菌的益生特性和開發(fā)更好的益生菌產(chǎn)品具有非常重大的意義。由于許多乳酸菌和雙歧桿菌都具有產(chǎn)胞外多糖的能力，因此通過控制外界因素可以改變其產(chǎn)糖能力，從而控制益生菌生物被膜的形成能力。此外，利用分子手段改造益生菌，構(gòu)建相關(guān)基因缺失菌株和過表達(dá)菌株，可以進(jìn)一步闡明益生菌生物被膜的形成機(jī)制。目前的研究表明益生菌具有群體感應(yīng)系統(tǒng)，因此通過調(diào)節(jié)群體感應(yīng)信號分子受體蛋白及其調(diào)控通路，闡明益生菌群體感應(yīng)系統(tǒng)與生物被膜形成的關(guān)系，是揭示益生菌生物被膜形成及調(diào)控機(jī)制的突破口之一。

［1］ SANDERS M E， GUARNER F， GUERRANT R， et al. An update on the use and investigation of probiotics in health and disease［J］. Gut，2013， 62（5）： 787-796. DOI：10.1136/gutjnl-2012-302504.

［2］ KAILASAPATHY K， CHIN J. Survival and therapeutic potential of probiotic organisms with reference to Lactobacillus acidophilus and Bifidobacterium spp.［J］. Immunology and Cell Biology， 2000， 78（1）：80-88.

［3］ DELLEY M， BRUTTIN A， RICHARD M， et al. In vitro activity of commercial probiotic Lactobacillus strains against uropathogenic Escherichia coli［J］. FEMS Microbiology Letters， 2015， 362（13）：fnv096. DOI：10.1093/femsle/fnv096.

［4］ CAMPANIELLO D， BEVILACQUA A， SINIGAGLIA M， et al. Screening of Propionibacterium spp. for potential probiotic properties［J］. Anaerobe， 2015， 34： 169-173. DOI：10.1016/ j.anaerobe.2015.06.003.

［5］ CORDINA C， SHAIKH I， SHRESTHA S， et al. Probiotics in the management of gastrointestinal disease： analysis of the attitudes and prescribing practices of gastroenterologists and surgeons［J］. Journal of Digestive Diseases， 2011， 12（6）： 489-496. DOI：10.1111/j.1751-2980.2011.00534.x.

［6］ STOODLEY P， SAUER K， DAVIES D G， et al. Biofilms as complex differentiated communities［J］. Annual Review of Microbiology， 2002，56（1）： 187-209.

［7］ CHAN C， HARDIN T C， SMART J I. A review of telavancin activity in in vitro biofilms and animal models of biofilm-associated infections［J］. Future Microbiology， 2015， 10（8）： 1-14. DOI：10.2217/ fmb.15.53.

［8］ O'LOUGHLIN C T， MILLER L C， SIRYAPORN A， et al. A quorum-sensing inhibitor blocks Pseudomonas aeruginosa virulence and biofilm formation［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences， 2013， 110（44）： 17981-17986. DOI：10.1073/ pnas.1316981110.

［9］ YONEZAWA H， OSAKI T， KAMIYA S. Biofilm formation by Helicobacter pylori and its involvement for antibiotic resistance［J］. Biomed Research International， 2015， 2015： 914791. DOI：10.1155/2015/914791.

［10］ FRANK K L， VERGIDIS P， BRINKMAN C L， et al. Evaluation of the Enterococcus faecalis biofilm-associated virulence factors AhrC and Eep in rat foreign body osteomyelitis and in vitro biofilm-associated antimicrobial resistance［J］. PLoS ONE， 2015， 10（6）： e130187. DOI：10.1371/journal.pone.0130187.

［11］ MACHADO A， CERCA N. The influence of biofilm formation by Gardnerella vaginalis and other anaerobes on bacterial vaginosis［J］. Journal of Infectious Diseases， 2015， 212（12）： 1856-1861. DOI：10.1093/infdis/jiv338.

［12］ RIEU A， AOUDIA N， JEGO G， et al. The biofilm mode of life boosts the anti-inflammatory properties of Lactobacillus［J］. Cellular Microbiology， 2014， 16（12）： 1836-1853. DOI：10.1111/cmi.12331.

［13］ CHEOW W S， KIEW T Y， HADINOTO K. Controlled release of Lactobacillus rhamnosus biofilm probiotics from alginate-locust bean gum microcapsules［J］. Carbohydrate Polymers， 2014， 103（4）： 587-595. DOI：10.1016/j.carbpol.2014.01.036.

［14］ van HOEK M L. Biofilms： an advancement in our understanding of Francisella species［J］. Virulence， 2014， 4（8）： 833-846. DOI：10.4161/ viru.27023.

［15］ HOBLEY L， HARKINS C， MACPHEE C E， et al. Giving structure to the biofilm matrix： an overview of individual strategies and emerging common themes［J］. FEMS Microbiology Reviews， 2015， 39（5）： 649-669. DOI：10.1093/femsre/fuv015.

［16］ CUTLER N A， CHAPUT D L， OLIVER A E， et al. The spatial organization and microbial community structure of an epilithic biofilm［J］. FEMS Microbiology Ecology， 2015， 91（3）： 1-9. DOI：10.1093/femsec/fiu027.

［17］ SAUER K， CAMPER A K， EHRLICH G D， et al. Pseudomonas aeruginosa displays multiple phenotypes during development as a biofilm［J］. Journal of Bacteriology， 2002， 184（4）： 1140-1154.

［18］ BLACKLEDGE M S， WORTHINGTON R J， MELANDER C. Biologically inspired strategies for combating bacterial biofilms［J］. Current Opinion in Pharmacology， 2013， 13（5）： 699-706. DOI：10.1016/j.coph.2013.07.004.

［19］ CHEW S Y， CHEAH Y K， SEOW H F， et al. In vitro modulation of probiotic bacteria on the biofilm of Candida glabrata［J］. Anaerobe，2015， 34： 132-138. DOI：10.1016/j.anaerobe.2015.05.009.

［20］ VUOTTO C， LONGO F， DONELLI G. Probiotics to counteract biofilm-associated infections： promising and conflicting data［J］. International Joutnal of Oral Science， 2014， 6（4）： 189-194. DOI：10.1038/ijos.2014.52.

［21］ GU H， HOU S， YONGYAT C， et al. Patterned biofilm formation reveals a mechanism for structural heterogeneity in bacterial biofilms［J］. Langmuir， 2013， 29（35）： 11145-11153. DOI：10.1021/ la402608z.

［22］ BELAS R. When the swimming gets tough， the tough form a biofilm［J］. Molecular Microbiology， 2013， 90（1）： 1-5. DOI：10.1111/ mmi.12354.

［23］ LEBEER S， VERHOEVEN T L A， PEREA VELEZ M， et al. Impact of environmental and genetic factors on biofilm formation by the probiotic strain Lactobacillus rhamnosus GG［J］. Applied and Environmental Microbiology， 2007， 73（21）： 6768-6775.

［24］ BRINK H G， NICOL W. The influence of shear on the metabolite yield of Lactobacillus rhamnosus biofilms［J］. New Biotechnology，2014， 31（5）： 460-467. DOI：10.1016/j.nbt.2014.06.003.

［25］ SLIZOVA M， NEMCOVA R， MAD'AR M， et al. Analysis of biofilm formation by intestinal lactobacilli［J］. Canadian Journal of Microbiology， 2015， 61（6）： 437-446. DOI：10.1139/cjm-2015-0007.

［26］ CHENG K J， FAY J P， HOWARTH R E， et al. Sequence of events in the digestion of fresh legume leaves by rumen bacteria［J］. Applied and Environmental Microbiology， 1980， 40（3）： 613-625.

［27］ SUN H， ZUSMAN D R， SHI W. Type IV pilus of Myxococcus xanthus is a motility apparatus controlled by the frz chemosensory system［J］. Current Biology， 2000， 10（18）： 1143-1146.

［28］ VENTOLINI G， MITCHELL E， SALAZAR M. Biofilm formation by vaginal Lactobacillus in vivo［J］. Medical Hypotheses， 2015， 84（5）：417-420. DOI：10.1016/j.mehy.2014.12.020.

［29］ LEPARGNEUR J P， ROUSSEAU V. Protective role of the doderlein flora［J］. Journal de Gynecologie， Obstetrique et Biologie de la Reprodroduction （Paris）， 2002， 31（5）： 485-494.

［30］ CHEOW W S， HADINOTO K. Biofilm-like Lactobacillus rhamnosus probiotics encapsulated in alginate and carrageenan microcapsules exhibiting enhanced thermotolerance and freeze-drying resistance［J］. Biomacromolecules， 2013， 14（9）： 3214-3222. DOI：10.1021/ bm400853d.

［31］ GUTTENPLAN S B， KEARNS D B. Regulation of flagellar motility during biofilm formation［J］. FEMS Microbiology Reviews， 2013，37（6）： 849-871. DOI：10.1111/1574-6976.12018.

［32］ LIU L， QIN Y， WANG Y， et al. Complete genome sequence of Bifidobacterium animalis RH， a probiotic bacterium producing exopolysaccharides［J］. Journal of Biotechnology， 2014， 189： 86-87. DOI：10.1016/j.jbiotec.2014.08.041.

［33］ JENAL U M J. Mechanisms of cyclic-di-GMP signaling in bacteria［J］. Annual Review of Genetics， 2006， 40（1）： 385-407.

［34］ KOLODKIN-GAL I， CAO S， CHAI L， et al. A self-produced trigger for biofilm disassembly that targets exopolysaccharide［J］. Cell， 2012，149（3）： 684-692. DOI：10.1016/j.cell.2012.02.055.

［35］ HOLM A， VIKSTR? M E. Quorum sensing communication between bacteria and human cells： signals， targets， and functions［J］. Frontiers in Plant Science， 2014， 5： 309. DOI：10.3389/fpls.2014.00309.

［36］ BORDI C， de BENTZMANN S. Hacking into bacterial biofilms： a new therapeutic challenge［J］. Annals of Intensive Care， 2011， 1： 19. DOI：10.1186/2110-5820-1-19.

［37］ GUO L， HE X， SHI W. Intercellular communications in multispecies oral microbial communities［J］. Frontiers in Microbiology， 2014， 5：328. DOI：10.3389/fmicb.2014.00328.

［38］ di FRANCESCO S， NEGLIA G， VECCHIO D， et al. Influence of season on corpus luteum structure and function and AI outcome in the Italian Mediterranean buffalo （Bubalus bubalis）［J］. Theriogenology，2012， 78（8）： 1839-1845. DOI：10.1016/j.theriogenology.2012.07.022.

［39］ ZHU P， PENG H， NI N， et al. Novel AI-2 quorum sensing inhibitors in Vibrio harveyi identified through structure-based virtual screening［J］. Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters， 2012， 22（20）： 6413-6417. DOI：10.1016/j.bmcl.2012.08.062.

［40］ JAKUBOVICS N S. Talk of the town： interspecies communication in oral biofilms［J］. Molecular Oral Microbiology， 2010， 25（1）： 4-14. DOI：10.1111/j.2041-1014.2009.00563.x.

［41］ ADLER L， ALTER T， SHARBATI S， et al. Phenotypes of Campylobacter jejuni luxS mutants are depending on strain background， kind of mutation and experimental conditions［J］. PLoS ONE， 2014， 9（8）： e104399. DOI：10.1371/journal.pone.0104399.

［42］ SUN Z K， HE X， BRANCACCIO V F， et al. Bifidobacteria exhibit luxS-dependent autoinducer 2 activity and biofilm formation［J］. PLoS ONE， 2014， 9（2）： e88260. DOI：10.1371/journal.pone.0088260.

［43］ TOMARAS A P， FLAGLER M J， DORSEY C W， et al. Characterization of a two-component regulatory system from Acinetobacter baumannii that controls biofilm formation and cellular morphology［J］. Microbiology， 2008， 154（11）： 3398-3409. DOI：10.1099/mic.0.2008/019471-0.

［44］ UCHIDA H， FUJITAN K， KAWAI Y， et al. A new assay using surface plasmon resonance （SPR） to determine binding of the Lactobacillus acidophilus group to hunman colonic mucin［J］. Bioscience，Biotechnology， and Biochemistry， 2004， 68（5）： 1004-1010.

［45］ HYNONEN U， WESTERLUND-WIKSTROM B， PALVA A， et al. Identification by flagellum display of an epithelial cell- and fibronectinbinding function in the SlpA surface protein of Lactobacillus brevis［J］. Journal of Bacteriology， 2002， 184（12）： 3360-3367.

［46］ ADLERBERTH I， AHRNE S， JOHANSSON M L， et al. A mannose-specific adherence mechanism in Lactobacillus plantarum conferring binding to the human colonic cell line HT-29［J］. Applied and Environmental Microbiology， 1996， 62（7）： 2244-2251.

［47］ 張莉. 植物乳桿菌的黏附特性研究及其在益生菌干酪中的應(yīng)用［D］.長春： 吉林大學(xué)， 2013： 61-82.

Progress in Research on Biofilm Formation by Probiotics

LIU Lei， LIU Yi， LI Pinglan*

（Beijing Advanced Innovation Center for Food Nutrition and Human Health， College of Food Science and Nutritional Engineering，China Agricultural University， Beijing 100083， China）

Probiotics are defined as ‘live microorganisms which when administered in adequate amounts confer health benefits to the host'. In recent years， probiotics have gained increasing attention due to their therapeutic effects. Biofilms are formed by multiple bacterial cells attached to a surface that arranges themselves into a complex tertiary structure encased in an extracellular matrix comprised of carbohydrates， proteins， and other macromolecules， which constitute the majority of bacteria in most natural ecosystems. However， little research has been done concerning probiotic biofilms. Therefore， the formation， characteristics， influencing factors， advantages and regulatory pathways of probiotic biofilms are discussed in this paper. In the future， probiotic biofilms will be an important research area.

probiotics； biofilms； influencing factors； regulatory pathway

10.7506/spkx1002-6630-201609040

Q939.99

A

1002-6630（2016）09-0214-06

劉蕾， 劉義， 李平蘭. 益生菌生物被膜的研究進(jìn)展［J］. 食品科學(xué)， 2016， 37（9）： 214-219. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201609040. http：//www.spkx.net.cn

LIU Lei， LIU Yi， LI Pinglan. Progress in research on biofilm formation by probiotics［J］. Food Science， 2016， 37（9）： 214-219.（in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/spkx1002-6630-201609040. http：//www.spkx.net.cn

2015-06-20

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31271827；31471707）；國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863計(jì)劃）項(xiàng)目（2011AA100805-0-1）

劉蕾（1988—），女，博士研究生，研究方向?yàn)槭称肺⑸?。E-mail：liulei0606@gmail.com

*通信作者：李平蘭（1964—），女，教授，博士，研究方向?yàn)槭称肺⑸铩-mail：lipinglan@cau.edu.cn