石 慧，陳卓逐，闞建全*

（西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715）

大腸桿菌在食品加工貯藏中脅迫響應(yīng)機(jī)制的研究進(jìn)展

石 慧，陳卓逐，闞建全*

（西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715）

大腸桿菌能夠感受環(huán)境信號(hào)并對(duì)環(huán)境的變化迅速做出反應(yīng)。因此，在食品加工貯藏中，大腸桿菌在面對(duì)物理、化學(xué)因子脅迫時(shí)會(huì)產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，使其仍然能夠生存和保持毒力，給食品安全帶來極大的威脅。本文總結(jié)了在常見的食品加工貯藏脅迫因子下，包括熱激、冷激、干燥、高滲透壓、抗菌肽和酸，大腸桿菌的分子及生理響應(yīng)機(jī)制及其在食品工業(yè)中的應(yīng)用，并對(duì)大腸桿菌脅迫響應(yīng)的未來研究做出展望。

大腸桿菌；食品加工貯藏；脅迫因子；響應(yīng)機(jī)制

大腸埃希氏菌（Escherichia coli）簡稱大腸桿菌，廣泛分布于自然界和動(dòng)物腸道，是一種極易造成食品污染的細(xì)菌。尤其是致病性大腸桿菌可通過污染飲水及食品引起疾病的暴發(fā)，例如引起嚴(yán)重腹瀉和敗血癥，病情嚴(yán)重者，可危及生命，其對(duì)兒童和老人的危害更為嚴(yán)重［1-3］。此外，大腸桿菌還能通過人與人之間的接觸進(jìn)行傳播［2，4］。1982年，美國首次披露大腸桿菌O157：H7引起了疾病暴發(fā)［3］。2006年，美國又大面積暴發(fā)毒菠菜事件，2 周內(nèi)有199 人確診中毒，其中3 人死亡，調(diào)查發(fā)現(xiàn)病人都是因食用了被大腸桿菌O157：H7污染的菠菜而中毒［5-6］。

微生物是通過與不斷變化的外界環(huán)境發(fā)生相互作用而進(jìn)行生長繁殖。在外界環(huán)境條件適宜時(shí)，如豐富的營養(yǎng)，合適的溫度、溶氧水平、pH值、水分含量，微生物會(huì)以較快的生長速率生長。一旦環(huán)境發(fā)生改變，就會(huì)造成對(duì)微生物的脅迫，抑制其生長，甚至死亡。實(shí)際上，除了在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)條件下，微生物都長期處于環(huán)境脅迫中。因此，微生物對(duì)環(huán)境變化的感受和迅速做出反應(yīng)的能力對(duì)其生存尤為重要，大多數(shù)微生物都具有這樣的能力［7］。

在食品加工貯藏過程中，加熱、冷藏、干燥、高滲透壓、酸處理、發(fā)酵、加抗菌藥物等處理方法均使大腸桿菌處于脅迫環(huán)境下。大量研究表明，大腸桿菌能對(duì)這些物理和化學(xué)脅迫因素做出迅速的應(yīng)激反應(yīng)，使其在不良環(huán)境下仍能夠維持生存，并且保持一定的代謝活性和致病能力。一旦環(huán)境適宜其生長，會(huì)迅速修復(fù)并且繁殖［8-12］。在食品加工貯藏過程中，如果食品中有脅迫應(yīng)激后仍存活的大腸桿菌，會(huì)造成安全隱患。尤其是致病性大腸桿菌，極少含量也會(huì)對(duì)人類健康造成極大的危害。同時(shí)，由于多數(shù)脅迫應(yīng)激后的大腸桿菌以特殊的生理狀態(tài)存活，如亞致死性損傷狀態(tài)或者存活但不可培養(yǎng)狀態(tài)（viable but not culturable，VBNC），導(dǎo)致對(duì)其檢測較為困難，極易發(fā)生漏檢［13］。因此，深入開展大腸桿菌在食品加工貯藏過程中的脅迫響應(yīng)機(jī)制的研究，對(duì)于保障食品加工貯藏安全，建立健全食品質(zhì)量安全控制體系方面具有重要意義。在理論上，可以深入理解大腸桿菌在不同的加工與貯藏條件下的脅迫響應(yīng)機(jī)制，及其重要響應(yīng)基因及信號(hào)傳導(dǎo)過程；在實(shí)踐上，理解大腸桿菌在哪些加工貯藏條件下會(huì)發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)，對(duì)確定加工貯藏條件，加強(qiáng)安全預(yù)防措施提供重要借鑒?，F(xiàn)在人們對(duì)食品新鮮度和營養(yǎng)要求越來越高，在降低滅菌對(duì)食品營養(yǎng)和口感造成影響的同時(shí)，又能盡量避免大腸桿菌脅迫應(yīng)激反應(yīng)，也成為了一個(gè)重要問題。而深入了解脅迫相應(yīng)基因，對(duì)研究協(xié)同滅菌方法，開發(fā)新型的抗微生物制劑方面都有重要的意義。本文對(duì)大腸桿菌在食品加工貯藏過程中的脅迫耐受機(jī)制的研究進(jìn)行綜述，并對(duì)未來的發(fā)展方向做出展望。

1 大腸桿菌熱應(yīng)激機(jī)制

熱處理是目前食品工業(yè)中經(jīng)常使用的重要滅菌方法，為了降低高溫對(duì)食品營養(yǎng)及風(fēng)味的影響，很多食品熱加工中需要采取低溫滅菌，如水果、蔬菜的漂燙，罐頭的殺菌，牛乳、啤酒、果汁的巴氏殺菌［11，17-18］。微生物如果突然面對(duì)環(huán)境溫度的變化，其生理也要發(fā)生變化。例如，當(dāng)溫度突然由30 ℃上升到42 ℃時(shí)，大腸桿菌會(huì)迅速做出熱激應(yīng)答，如誘導(dǎo)相關(guān)基因的表達(dá)，大量合成熱休克蛋白（heat shock proteins，HSPs）［14-15］。熱休克蛋白大多數(shù)是分子伴侶和蛋白酶，具有以下功能：協(xié)助蛋白質(zhì)的折疊、降解未準(zhǔn)確折疊的蛋白質(zhì)、在高溫下保持蛋白質(zhì)和膜的穩(wěn)態(tài)、在高溫下保持核酸的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)、與σ32翻譯過程有關(guān)［15-17］。許多熱休克蛋白是提高大腸桿菌的耐熱性所必需的，其中包括DnaK、DnaJ、GrpE、GroES、GroEL［18］。

在大腸桿菌中，熱應(yīng)激反應(yīng)受到σ32調(diào)控。σ32是由rpoH（htpR）基因編碼的次級(jí)σ因子，大小為32 000 D。它可以指導(dǎo)核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）聚合酶與特定的啟動(dòng)子結(jié)合，調(diào)控相關(guān)熱休克基因的表達(dá)。當(dāng)環(huán)境溫度由30 ℃迅速上升到42 ℃時(shí)，σ32的含量由大約為10～30 拷貝/細(xì)胞在4～6 min內(nèi)增加到原來的17 倍，合成超過20 種熱休克蛋白，這些熱休克蛋白可以幫助大腸桿菌獲得對(duì)熱的抗性［18］。

大腸桿菌能夠在不同水平（σ32的轉(zhuǎn)錄、翻譯及降解）對(duì)σ32進(jìn)行調(diào)控［19］。首先，在σ32的轉(zhuǎn)錄水平，rpoH至少有4 個(gè)啟動(dòng)子，3 個(gè)啟動(dòng)子可被σ70-RNA聚合酶所識(shí)別，另一個(gè)啟動(dòng)子（P3）可被σ24-RNA聚合酶所識(shí)別（圖1）。σ70是一個(gè)由σ32誘導(dǎo)產(chǎn)生的熱休克蛋白，因此，σ32含量的增多導(dǎo)致σ70的增多，反過來又增加σ32的合成［20］。其次，外界脅迫特別是熱激誘導(dǎo)會(huì)影響rpoH mRNA的翻譯，σ32的合成在42 ℃要比30 ℃提高約12 倍［20］。rpoH mRNA開放閱讀框（open-reading frames，ORFs）5'端的220nt序列可以形成對(duì)溫度敏感的次級(jí)結(jié)構(gòu)。在正常溫度下，這些次級(jí)結(jié)構(gòu)是閉合的，而在較高溫度下，次級(jí)結(jié)構(gòu)打開，使得rpoH mRNA能夠更有效的翻譯成σ32，進(jìn)而迅速地誘導(dǎo)熱休克蛋白的表達(dá)［20］。最后，σ32的降解也受到調(diào)控。σ32在大腸桿菌穩(wěn)態(tài)生長時(shí)是一個(gè)極其不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)，其半衰期少于1 min。然而，當(dāng)溫度由30 ℃上升到42 ℃時(shí)，σ32的半衰期時(shí)間延長了8 倍，變得具有暫時(shí)的穩(wěn)定性［20］。σ32可被細(xì)胞內(nèi)膜上的ATP依賴型蛋白酶FtsH所降解，其降解機(jī)制在于這些游離的σ32是否與RNA聚合酶核心酶（RNA polymerase core）相結(jié)合，如果它們緊密結(jié)合，σ32則免遭FtsH降解［20-21］。DnaK、DnaJ、GrpE等熱休克蛋白（都是由σ32調(diào)控合成）也調(diào)控σ32降解，抑制rpoH mRNA的翻譯（圖1）。在30 ℃或更低溫度，DnaK、DnaJ、GrpE等熱休克蛋白可與σ32相互作用，使之不能與RNA聚合酶核心酶結(jié)合，加速σ32被FtsH降解；在42 ℃或更高的溫度下，細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量非折疊或變性蛋白，DnaK、DnaJ、GrpE優(yōu)先與變性蛋白作用，因此能與σ32結(jié)合的游離分子伴侶減少，保證σ32能充分和RNA聚合酶核心酶結(jié)合（圖1）［22］。σ32的大量合成調(diào)控?zé)嵝菘说鞍椎谋磉_(dá)，然而熱休克蛋白含量的增加會(huì)反饋調(diào)節(jié)σ32的含量，σ32與熱休克蛋白之間的相互制約關(guān)系，使它們的含量能在熱激響應(yīng)過程中保持相對(duì)穩(wěn)定的高水平。σ32調(diào)控成員除了合成分子伴侶保護(hù)蛋白質(zhì)免遭降解，還涉及保護(hù)其他大分子和細(xì)胞過程免受危害，如有些蛋白質(zhì)可以保護(hù)細(xì)胞內(nèi)脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）和RNA［7］。

在理解了大腸桿菌的熱脅迫應(yīng)激的基礎(chǔ)上，近年來一些研究者開始進(jìn)一步研究如何在低溫滅菌中使其快速失活，避免大腸桿菌由于脅迫應(yīng)激而維持生存。如Sung等［23］研究了在25、45、50、55 ℃下，使用3.0 L/min流速及質(zhì)量濃度為2.0～3.0 g/m3的氣體臭氧聯(lián)合對(duì)蘋果汁中的大腸桿菌O157：H7進(jìn)行滅菌處理。結(jié)果顯示，在這些溫度下加入臭氧聯(lián)合滅菌，都會(huì)顯著提高大腸桿菌滅活效率。在50 ℃條件下，臭氧和熱處理產(chǎn)生了協(xié)同滅菌效果。另外，也有研究證實(shí)大腸桿菌在雞胸肉等固體食品中，比其在液體中的熱抗性更強(qiáng)［24］。這些為食品加工提供了借鑒，但是其中涉及的機(jī)制，如不同的殺菌方式是如何產(chǎn)生協(xié)同作用，大腸桿菌脅迫應(yīng)激基因如何對(duì)協(xié)同作用做出響應(yīng)，食品介質(zhì)對(duì)大腸桿菌的脅迫響應(yīng)產(chǎn)生怎樣的影響，還沒有清楚的解釋，需要進(jìn)一步探索。

2 大腸桿菌冷應(yīng)激機(jī)制

冷凍貯藏或冷鏈運(yùn)輸是食品產(chǎn)業(yè)鏈中經(jīng)常使用的保藏或運(yùn)輸方式，如肉類、果蔬、速凍食品等食品的保鮮。在冷凍貯藏過程中，大腸桿菌會(huì)遭受低溫的脅迫，溫度降低會(huì)造成細(xì)胞內(nèi)酶活性降低（影響胞內(nèi)新陳代謝），膜的流動(dòng)性降低（影響營養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸），RNA結(jié)構(gòu)趨于穩(wěn)定（影響翻譯過程）［25-26］。當(dāng)溫度突然降低時(shí)，細(xì)胞中會(huì)產(chǎn)生一種冷休克反應(yīng)，通過一些特殊基因的表達(dá)產(chǎn)生一大類特殊的蛋白質(zhì)（冷休克蛋白）使細(xì)胞適應(yīng)這一急劇降低的低溫環(huán)境，冷休克蛋白（cold shock proteins，CSPs）可以保持細(xì)胞膜的完整性和促進(jìn)有效轉(zhuǎn)錄和翻譯［25-27］。

研究表明，將大腸桿菌從37 ℃突然轉(zhuǎn)移至10 ℃時(shí)，很多蛋白質(zhì)立即被誘導(dǎo)表達(dá)。這些蛋白質(zhì)大多數(shù)直接或間接與轉(zhuǎn)錄和翻譯過程有關(guān)，如典型的冷休克蛋白、RNA解旋酶（DeaD）、DNA旋轉(zhuǎn)酶（GyrA）、轉(zhuǎn)錄因子NusA和翻譯因子InfBD等［27-28］。冷休克蛋白是高度保守的核苷酸結(jié)合蛋白，一般由68～74 個(gè)氨基酸構(gòu)成，都存在5 個(gè)反平行B折疊的B桶狀片層結(jié)構(gòu)。冷休克蛋白分子質(zhì)量大約為7.4 kD，含有典型的冷休克區(qū)域（cold shock domain，CSD），通過RNP1和RNP2基元（motif）與單鏈RNA或單鏈DNA結(jié)合，但不能與DNA結(jié)合［27-30］。在大腸桿菌中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)9 種同源冷休克蛋白，分別命名為CspA～CspI。其中，CspA、CspB、CspE、CspG、CspI只在冷激條件下誘導(dǎo)產(chǎn)生， CspC升溫或降溫條件下都會(huì)誘導(dǎo)其表達(dá)，而 CspD在穩(wěn)定期，營養(yǎng)饑餓，氧化應(yīng)激時(shí)產(chǎn)生［30-31］。

CspA是大腸桿菌主要的冷休克蛋白，是分子質(zhì)量為7.4 kD的細(xì)胞質(zhì)蛋白。正常情況，CspA幾乎不存在，而且半衰期只有10～47 s，但是當(dāng)大腸桿菌所處溫度驟然降低時(shí)，它被大量誘導(dǎo)合成，可占細(xì)胞蛋白質(zhì)總量的13%，其穩(wěn)定期提高，半衰期大大延長（＞10 min）。CspA能結(jié)合冷誘導(dǎo)基因，如染色體結(jié)合蛋白基因h-ns的110 bp的啟動(dòng)子區(qū)域，可以對(duì)h-ns基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄激活。CspA還可以結(jié)合到DNA旋轉(zhuǎn)酶A亞基基因（gyrA）的啟動(dòng)子上激活其轉(zhuǎn)錄。一般認(rèn)為，DNA旋轉(zhuǎn)酶含量的增加有助于細(xì)胞對(duì)低溫的適應(yīng)［29-31］。

冷休克蛋白除了可以結(jié)合冷誘導(dǎo)基因的啟動(dòng)子區(qū)域激活這些基因的轉(zhuǎn)錄外，還能清除不必要的二級(jí)結(jié)構(gòu)來促進(jìn)這些基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯。例如，冷誘導(dǎo)的RNA解旋酶CsdA能與CspA相互作用并清除mRNA上的二級(jí)結(jié)構(gòu)，使其免受RNase E的切除從而穩(wěn)定mRNA；另外，mRNA上的二級(jí)結(jié)構(gòu)的清除有利于夏因-達(dá)爾加諾序列（Shine-Dalgarno sequence，SD）序列的暴露，翻譯得以順利進(jìn)行［27-30］。

研究證實(shí)，將大腸桿菌污染的雞胸肉過夜4 ℃冷藏，會(huì)提高大腸桿菌在沸水加熱中的熱抗性［24］。近年來的研究證實(shí)，致病菌大腸桿菌O157比模式菌株大腸桿菌K12的耐低溫能力更強(qiáng)［32］。由于低溫冷藏是一種常見的保藏方式，我國的研究者也開始研究冷凍脅迫下，其他致病菌如金黃色葡萄球菌的亞致死性損傷及失活規(guī)律［33］。

3 大腸桿菌干燥及高滲透壓應(yīng)激機(jī)制

為了延長食品的保質(zhì)期和貨架期，干燥以及高鹽高糖的高滲透壓處理，是非常常見的食品加工方法，它們都能夠盡可能降低食品的含水量，抑制微生物的生長。一方面，各種微生物都有其生長最適宜的水分活度（water activity，aw）下降，微生物的生長率也隨之下降。而研究表明，大腸桿菌能夠在低水分活度食品中長期存活［34］。在食品干燥過程中，水分活度未下降到大腸桿菌致死的水平前，其對(duì)水含量的減少會(huì)做出應(yīng)激響應(yīng)，誘導(dǎo)相關(guān)基因的表達(dá)，合成一些特殊的物質(zhì)，降低由于水分活度下降對(duì)其生長造成的影響，并且進(jìn)入休眠期長時(shí)間存活。另一方面，高滲透壓環(huán)境會(huì)導(dǎo)致水分子單方向地從細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞內(nèi)膜外移動(dòng)，和干燥過程類似，都會(huì)造成細(xì)胞失水。據(jù)報(bào)道［35-40］，大腸桿菌有以下2 套相似的調(diào)節(jié)機(jī)制應(yīng)對(duì)干燥及高滲透壓脅迫。

第一是胞外抵抗機(jī)制，糖被（glycocalyx）起著關(guān)鍵作用。在干燥和高滲透壓環(huán)境下，大腸桿菌都會(huì)調(diào)節(jié)產(chǎn)生糖被來應(yīng)對(duì)脅迫［35-36］。糖被是包被于大腸桿菌細(xì)胞壁外的一層厚度不定的透明膠狀物質(zhì)，主要由胞外多糖和蛋白質(zhì)構(gòu)成。糖被的有無、厚薄除與大腸桿菌的遺傳性相關(guān)外，還與環(huán)境尤其是營養(yǎng)條件密切相關(guān)。糖被的成分一般是多糖，少數(shù)是蛋白質(zhì)或多肽，也有多糖與多肽復(fù)合型的。糖被除了貯藏養(yǎng)料和給大腸桿菌提供表面附著力外，還起著保護(hù)作用，其上大量極性基團(tuán)可保護(hù)大腸桿菌菌體減少水分流失造成的損傷［36］。Alpert［37］認(rèn)為糖被由于其膠凝結(jié)構(gòu)，能夠與大量的水分緊密結(jié)合，降低細(xì)胞水分在干燥或高滲環(huán)境中流失的速率，對(duì)大腸桿菌在干燥脅迫下維持生存起著重要作用。

第二是胞內(nèi)調(diào)節(jié)機(jī)制，海藻糖（trehalose）起主要作用。海藻糖是由2 個(gè)葡萄糖分子以α，α，1，1-糖苷鍵構(gòu)成非還原性糖，是一種親和性溶質(zhì)，自身性質(zhì)非常穩(wěn)定。海藻糖對(duì)包括大腸桿菌在內(nèi)的多種生物體具有高效的保護(hù)作用，因?yàn)楹Ｔ逄窃诟邼B透壓及干燥失水等惡劣環(huán)境條件下在細(xì)胞表面能形成獨(dú)特的保護(hù)膜，有效地穩(wěn)定細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能［38-39］。在大腸桿菌中，海藻糖由OtsAB操縱子的編碼產(chǎn)物合成：OtsA是海藻糖-6-磷酸合成酶，OtsB是海藻糖-6-磷酸酶。調(diào)節(jié)海藻糖合成的蛋白OtsAB受到σs的調(diào)控，因此在其他多種環(huán)境脅迫下諸如高溫、氧化等，大腸桿菌也會(huì)合成大量海藻糖［40］。

大腸桿菌除了上述兩方面應(yīng)對(duì)干燥及高滲透壓脅迫的相似機(jī)制，研究者還發(fā)現(xiàn)其在高滲透壓環(huán)境下，雙組分系統(tǒng)EnvZ/OmpR會(huì)感應(yīng)外界環(huán)境的變化，并且調(diào)高外膜蛋白OmpC的表達(dá)量，從而為糖、多元醇、甜菜堿、氨基酸等相容性溶質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)提供通道，維持菌體內(nèi)外滲透壓平衡；同時(shí)，ProP和ProU膜轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)也會(huì)幫助這類相容性溶質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞［41］。但是相對(duì)而言，對(duì)大腸桿菌的干燥響應(yīng)機(jī)制了解甚少，這也是近年來研究的熱點(diǎn)。如有研究證實(shí)大腸桿菌胞內(nèi)合成海藻糖的濃度與其干燥抵抗能力成正相關(guān)［42］，這也直接進(jìn)一步證實(shí)了海藻糖在大腸桿菌應(yīng)對(duì)干燥中的重要作用。Koseki等［34］研究了在嬰兒配方奶粉中，大腸桿菌O157：H7干燥抗性的規(guī)律，并分別在5、22、35 ℃條件下建立了數(shù)學(xué)模型，證實(shí)了在干燥環(huán)境下，隨著溫度的升高，大腸桿菌O157：H7對(duì)干燥的抗性越高。這些研究為采取有效的食品加工與貯藏方法提供了借鑒。另外，高通量測序技術(shù)的發(fā)展，為研究者深入研究微生物在干燥環(huán)境下分子響應(yīng)提供了契機(jī)。如近年來有報(bào)道沙門氏菌處于不銹鋼、塑料、紙片這些不同的材質(zhì)表面時(shí)，其主要脅迫響應(yīng)基因是不同的［43-45］。對(duì)于大腸桿菌，暫沒有類似報(bào)道，但相信在不遠(yuǎn)的將來會(huì)有更深入的認(rèn)識(shí)。

4 抗菌肽及大腸桿菌應(yīng)激機(jī)制

當(dāng)前，由于抗生素的濫用、食品防腐劑的過量添加，食品安全事件屢有發(fā)生。因此，人們對(duì)天然防腐劑的關(guān)注與日俱增?？咕模╝ntimicrobial peptide，AP）抑制微生物的生長，對(duì)食品中的多種革蘭氏陰性細(xì)菌和革蘭氏陽性細(xì)菌都有很強(qiáng)的殺滅作用［46-47］?？咕脑谌恕⑿篌w內(nèi)易被消化水解且無毒副作用，在酸性條件下活性強(qiáng)，有良好的溶解性和穩(wěn)定性，是一種新型的食品防腐劑，與傳統(tǒng)的抗生素相比具有分子質(zhì)量小、抗菌譜廣、熱穩(wěn)定性好、抗菌機(jī)理獨(dú)特等優(yōu)點(diǎn)［46］?？咕母鶕?jù)其來源的不同通常可以分為四大類：來源于動(dòng)物、昆蟲、微生物基因工程菌的抗菌肽以及人工合成的抗菌肽，還可以根據(jù)是否帶電荷分為陽離子抗菌肽和非陽離子抗菌肽［46，48］。目前，大多數(shù)研究者認(rèn)為抗菌肽抑制微生物的機(jī)理在于抗菌肽能夠與細(xì)胞膜表面相互作用，使膜的通透性發(fā)生改變。陽離子抗菌肽的正電荷區(qū)域與細(xì)胞膜上的負(fù)電荷區(qū)域相互作用，使抗菌肽分子的疏水端插入細(xì)胞膜的脂質(zhì)膜中，形成跨膜電位，打破細(xì)胞內(nèi)酸堿平衡，導(dǎo)致物質(zhì)滲透，影響滲透壓平衡，抑制微生物的呼吸作用［46］。總之抗菌肽與膜的相互作用直接關(guān)系到抗菌肽的抗菌效果［46］。

當(dāng)大腸桿菌處于含有抗菌肽的環(huán)境時(shí)，細(xì)胞會(huì)發(fā)生相應(yīng)的生理生化變化，并誘導(dǎo)一批新蛋白質(zhì)或者已存在的蛋白質(zhì)的合成，構(gòu)建防御體系，抵抗抗菌肽與細(xì)胞膜作用。這種反應(yīng)即為抗菌肽脅迫反應(yīng)（antimicrobial peptide-stress response，APSR）。大腸桿菌對(duì)抗菌肽的脅迫響應(yīng)主要包括兩方面：膜表面物質(zhì)被修飾，減少膜整體所帶的負(fù)電荷；外膜的一些相關(guān)蛋白酶水解抗菌肽［48-49］。首先，膜表面物質(zhì)特別是脂多糖被修飾，減少其整體負(fù)電荷，細(xì)胞膜結(jié)合位點(diǎn)隨之減少，影響抗菌肽與細(xì)胞膜的結(jié)合作用。脂多糖有3 個(gè)部分（圖2）：O-抗原，含有重復(fù)的碳水化合物單位，微生物抵抗不利因素的重要部分，也是微生物的毒力因子；核心區(qū)域，由一個(gè)內(nèi)核心和外核心組成；脂質(zhì)A（lipid A），是D-葡萄胺二糖單位鏈組成的鏈，其中所有的羥基都被取代，取代物可以是多糖，也可以是脂肪酸［50］。當(dāng)面對(duì)抗菌肽脅迫時(shí)，大腸桿菌的一些基因被激活，如pmrE、pmrC，它們直接或間接地受到PhoPQ、PmrAB等雙組份系統(tǒng)的調(diào)控。pmrE調(diào)控合成4-氨基-阿拉伯糖（4-amino-arabinose，Ara4N），pmrC調(diào)控合成磷酸乙醇胺（phosphoenthanolamine，pEtN）。然后，4-氨基-阿拉伯糖或磷酸乙醇胺添加到脂多糖的脂質(zhì)A部分上，使之磷酸化，中和負(fù)電荷（圖2）［49］。

其次，外膜的一些相關(guān)蛋白酶能夠降解抗菌肽［50］。大腸桿菌外膜蛋白酶T（outer-membrane protease T，OmpT）由10 條反向平行的β片層折疊而成中空的桶狀結(jié)構(gòu)，屬于革蘭氏陰性菌omptin外膜蛋白家族［51］。大腸桿菌外膜蛋白酶T由編碼基因ompT合成，可水解抗菌肽，促纖溶等［51-53］。大腸桿菌外膜蛋白酶T在細(xì)胞質(zhì)產(chǎn)生并被運(yùn)輸?shù)絻?nèi)膜，再通過外周胞質(zhì)到達(dá)外膜，定位于大腸桿菌外膜，鑲嵌在脂質(zhì)雙層中，形成孔道［51］。大腸桿菌外膜蛋白酶T 的活性受到其結(jié)構(gòu)頂端天冬氨酸的極大影響，同時(shí)，也受到脂多糖的影響，外膜蛋白酶T與脂多糖結(jié)合后，才能恢復(fù)酶活性。屈婭榮等［53］證明人防御素（human β-defensin-4，HBD-4）對(duì)大腸桿菌野生菌株和OmpT突變體的最小抑菌濃度有顯著差異，野生株為10 μg/mL，敲除株為6 μg/mL。劉小露等［51］通過體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，重組蛋白OmpT能水解抗菌肽魚精蛋白和兔肌肉肌酸激酶，而OmpT突變體則無上述功能。

5 大腸桿菌酸脅迫應(yīng)激機(jī)制

酸脅迫發(fā)生在發(fā)酵食品或添加如有機(jī)酸等作防腐劑的食品中。食品酸處理過程中，微生物也面臨著酸脅迫，國外常用1%～2.5%的乳酸洗滌牛肉，但是Dickson等［54］發(fā)現(xiàn)用1%的乳酸或醋酸洗滌牛肉，并不能殺死全部微生物，存在亞致死沙門氏菌和大腸桿菌。酸性食品檢測出大腸桿菌O157：H7的報(bào)道屢見不鮮。大腸桿菌具有較強(qiáng)的耐酸能力，特別是其處于穩(wěn)定期的細(xì)胞能夠耐受pH≤2.5的酸性環(huán)境數(shù)小時(shí)，這主要是由于其具有葡萄糖-阻礙耐酸系統(tǒng)、氨基酸依賴型耐酸系統(tǒng)、伴侶蛋白抗酸作用以及保持膜電荷穩(wěn)定等耐酸機(jī)制（圖3）［55-56］。大腸桿菌對(duì)酸的應(yīng)激響應(yīng)非常復(fù)雜和多變，在不同成分或不同pH值的食品里，大腸桿菌發(fā)揮主要抗酸作用的機(jī)制會(huì)不同。例如葡萄糖-阻礙耐酸系統(tǒng)受到葡萄糖的抑制，氨基酸依賴型耐酸系統(tǒng)需要特定的氨基酸存在時(shí)才能產(chǎn)生耐酸作用。

葡萄糖-阻礙耐酸系統(tǒng)（acid resistance system 1，AR1）需要選擇性信號(hào)因子σ38、總調(diào)控蛋白CRP（cAMP receptor protein）和F0F1-ATP酶（F0/F1proton-translocating ATPase）參與［57-58］。選擇性信號(hào)因子σ38又稱σs，由RpoS編碼，RpoS是細(xì)菌一般脅迫反應(yīng)的主要調(diào)控因子。碳源和氮源饑餓、滲透壓升高、低pH值、溫度升高等一些脅迫條件可以誘導(dǎo)RpoS表達(dá)，另外，一些細(xì)胞內(nèi)信號(hào)如ppGpp含量的變化會(huì)誘導(dǎo)RpoS表達(dá)。AR1的結(jié)構(gòu)組分和保護(hù)機(jī)制仍不明確，但是研究者發(fā)現(xiàn)酸性環(huán)境可以直接作用RpoS，誘導(dǎo)RpoS的翻譯、抑制RpoS的降解，從而增加RpoS的含量，PhoP/PhoQ、ArcB/RssB等雙組分系統(tǒng)也將影響RpoS的含量和活性［59］。因此，在酸性環(huán)境下RpoS的量將明顯提高并產(chǎn)生一定量的酸休克蛋白（acid shock proteins，ASPs），酸休克蛋白與熱休克蛋白功能類似，能保護(hù)和修復(fù)大分子［14］。

氨基酸依賴型耐酸系統(tǒng)包括谷氨酸依賴型耐酸系統(tǒng)（acid resistance system 2，AR2）、精氨酸依賴型耐酸系統(tǒng)（AR3）、谷氨酰胺依賴型耐酸系統(tǒng)（AR4）［55-56］。谷氨酸依賴型耐酸系統(tǒng)是在谷氨酸存在的情況下，依賴于2 個(gè)谷氨酸脫羧酶（GadA和GadB）的異構(gòu)體和谷氨酸-γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）反轉(zhuǎn)運(yùn)體（GadC）共同發(fā)揮耐酸作用。谷氨酸在谷氨酸脫羧酶的作用下脫羧生成γ-氨基丁酸并消耗細(xì)胞內(nèi)的一分子H+，轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GadC將γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外并交換新的底物谷氨酸（glutamate，Glu）（圖3）。精氨酸依賴型耐酸系統(tǒng)則需要精氨酸存在，由精氨酸脫羧酶（AdiA）參與脫酸反應(yīng)，使精氨酸脫羧生成胍丁胺（agmatine），反轉(zhuǎn)運(yùn)體（AdiC）參與轉(zhuǎn)運(yùn)，泵出胍丁胺并交換精氨酸（圖3）［55-56］。谷氨酰胺依賴型耐酸系統(tǒng)（AR4）是2013年由我國施一公教授等［56］發(fā)現(xiàn)的新型大腸桿菌氨基酸依賴耐酸系統(tǒng)，其與谷氨酸依賴型耐酸系統(tǒng)、精氨酸依賴型耐酸系統(tǒng)調(diào)控機(jī)制略有不同，其在谷氨酰胺（glutamine，Gln）存在的條件下，依賴于谷氨酰胺酶（YbaS）和氨基酸反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（GadC）共同發(fā)揮對(duì)酸的抵抗能力（圖3）大腸桿菌利用谷氨酰胺酶將L-谷氨酰胺（L-Gln）轉(zhuǎn)化為L-谷氨酸（L-Glu）并釋放氣態(tài)氨，游離氨中和質(zhì)子，使細(xì)胞內(nèi)的pH值不至于降低到致死的水平［56］。另外，研究者也發(fā)現(xiàn)一些起輔助作用的耐酸機(jī)制，如在酸性條件下，大腸桿菌周質(zhì)空間分子伴侶HdeA和HdeB可與蛋白質(zhì)結(jié)合并防止其聚集沉淀對(duì)細(xì)胞造成毒害作用［60］。HdeA和HdeB發(fā)揮抗酸作用的pH值不同，HdeA在pH 2.0～3.0都具有抗酸能力，然而HdeB只有在pH 3.0左右才能發(fā)揮抗酸性；而通過改變細(xì)胞膜成分和保持膜電荷穩(wěn)定也會(huì)增強(qiáng)大腸桿菌的耐酸能力［61］。

6 結(jié) 語

大腸桿菌是一種極易感染肉類、乳制品、果汁、發(fā)酵食品等食品的腸道致病菌。在食品加工及感染宿主等過程中，需要相應(yīng)的應(yīng)激調(diào)控因子調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，啟動(dòng)脅迫反應(yīng)，以適應(yīng)各種脅迫條件。因此，了解脅迫反應(yīng)有助于全面了解微生物生理，有助于開發(fā)新的抗微生物制劑以及制定新的食品安全措施。然而，隨著對(duì)脅迫反應(yīng)逐漸深入了解，發(fā)現(xiàn)脅迫反應(yīng)的復(fù)雜性和關(guān)聯(lián)性，尚有很多未知機(jī)制有待于揭示。

回顧以往的研究并結(jié)合當(dāng)前研究中所遇到的問題，未來可以從以下幾個(gè)方面開展工作：1）目前對(duì)于大腸桿菌的一些脅迫響應(yīng)機(jī)制和信號(hào)傳導(dǎo)過程還了解甚少，如其在干燥脅迫下的應(yīng)激機(jī)制、在酸脅迫下的葡萄糖-阻礙耐酸系統(tǒng)，都需要進(jìn)一步研究。另外，在大腸桿菌長期應(yīng)對(duì)不同環(huán)境的過程中，會(huì)發(fā)生進(jìn)化并增強(qiáng)其抗性，需要在不斷研究中發(fā)現(xiàn)并應(yīng)對(duì)。2）在食品加工流通中，大腸桿菌常常受到多種逆境的共同脅迫，這些不利環(huán)境的種類和作用方式不同。對(duì)大腸桿菌產(chǎn)生的脅迫耐受性也各不相同。因此，僅研究大腸桿菌對(duì)某一種脅迫條件的抗性，已經(jīng)不能真實(shí)地反映其在食品加工環(huán)境中所處狀態(tài)。而需要采取有效的柵欄技術(shù)對(duì)它們的控制加以系統(tǒng)研究，充分研究各種脅迫在時(shí)空上綜合效應(yīng)，揭示和理解大腸桿菌在多種復(fù)合環(huán)境脅迫下的應(yīng)激反應(yīng)。3）通過構(gòu)建基因缺陷株，并比較野生株與缺陷株之間生物學(xué)特性的差異，是目前研究闡明大腸桿菌在抵抗加工環(huán)境脅迫的分子機(jī)制常用技術(shù)，這種技術(shù)有很大的局限性。隨著基因組、蛋白質(zhì)組及代謝組學(xué)的飛速發(fā)展，基因芯片全基因組表達(dá)譜、雙向蛋白質(zhì)組表達(dá)譜等分析技術(shù)可應(yīng)用于環(huán)境脅迫下大腸桿菌脅迫耐受分子機(jī)制的研究中。4）在自然界中有一些微生物嗜好極端點(diǎn)的pH值、溫度、滲透壓等生存條件，處于這種環(huán)境中的極端微生物的反應(yīng)與大多數(shù)微生物的脅迫反應(yīng)不同。比較極端微生物和普通微生物在脅迫條件下的生存機(jī)制的差異性、特殊性，對(duì)全面了解微生物生理功能有重要意義。相信在接下來幾十年里，對(duì)大腸桿菌脅迫響應(yīng)的研究將繼續(xù)成為一個(gè)令人振奮的基礎(chǔ)性和應(yīng)用型的研究領(lǐng)域。

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Progress in Research on Stress Response in Escherichia coli during Food Processing and Storage

SHI Hui， CHEN Zhuozhu， KAN Jianquan*
（College of Food Science， Southwest University， Chongqing 400715， China）

Escherichia coli can sense environmental signals and respond quickly to the changing environment. Therefore，during food processing and storage， the response of E. coli to physical and chemical stress enables them to survive and maintain virulence， which poses a great threat to food safety. This paper is focused on summarizing the molecular and physiological response of E. coli to common stress factors during food processing and storage and its application in the food industry， including heat shock， cold shock， desiccation， hyperosmotic stress， antimicrobial peptides and acid stress. The future research direction in this area is also discussed.

Escherichia coli； food processing and storage； stress factors； response mechanism

10.7506/spkx1002-6630-201609046

TS201.3

A

1002-6630（2016）09-0250-08

石慧， 陳卓逐， 闞建全. 大腸桿菌在食品加工貯藏中脅迫響應(yīng)機(jī)制的研究進(jìn)展［J］. 食品科學(xué)， 2016， 37（9）： 250-257. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201609046. http：//www.spkx.net.cn

SHI Hui， CHEN Zhuozhu， KAN Jianquan. Progress in research on stress response in Escherichia coli during food processing and storage［J］. Food Science， 2016， 37（9）： 250-257. （in Chinese with English abstract） DOI：10.7506/spkx1002-6630-201609046. http：//www.spkx.net.cn

2015-05-17

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31401567）；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目（XDJK2014B020）；西南大學(xué)博士啟動(dòng)基金項(xiàng)目（SWU113041）

石慧（1986—），女，講師，博士，研究方向?yàn)槭称焚|(zhì)量與安全。E-mail：shi_hui_1986@163.com

*通信作者：闞建全（1965—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称焚|(zhì)量與安全、食品化學(xué)。E-mail：ganjq1965@163.com