孫 靜,范春芝,竇健萍,溫朝陽

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超聲引導(dǎo)下急性缺血性左室舒張功能障礙并二尖瓣反流犬模型的構(gòu)建

孫 靜1,范春芝2,竇健萍3,溫朝陽4

目的 探討超聲引導(dǎo)下急性缺血性左室舒張功能障礙并二尖瓣反流犬模型的構(gòu)建。方法 (1)二尖瓣反流模型的建立：比格犬15條，經(jīng)左頸動脈穿刺并送入動脈鞘。在超聲引導(dǎo)下，將動脈鞘送入左室，鞘前端置于二尖瓣前葉邊緣，經(jīng)動脈鞘將內(nèi)鏡活體取樣鉗置于二尖瓣尖下，鉗斷二尖瓣腱索。經(jīng)胸心臟超聲證實存在二尖瓣反流。(2)急性缺血性左室舒張功能障礙模型的建立：在超聲引導(dǎo)下，外撤動脈鞘使其前端置于左冠狀動脈竇內(nèi)，間歇多次注射塑料微球于左冠狀動脈竇內(nèi)，微栓塞冠狀動脈，左室舒張末壓升高≥5 mmHg定義為建模成功，形成急性缺血性舒張功能不全。結(jié)果 (1)15條比格犬制作二尖瓣反流模型全部成功；14條犬形成中度二尖瓣反流，1條比格犬造成重度二尖瓣反流。多普勒頻譜測量二尖瓣反流，V max為(483.0 ±1.1) m/s，PG max為(162.7± 1.8) mmHg。(2)15條二尖瓣反流比格犬進行急性缺血左室舒張功能障礙模型構(gòu)建，成功12條，3條未成功。12條成功模型的左室舒張末壓升高、最大左室壓力下降速率(-dP/dtmax)降低、左室松弛時間常數(shù)(Tau)延長。結(jié)論 超聲引導(dǎo)下，經(jīng)頸動脈鞘管送入活檢鉗鉗夾二尖瓣腱索制造二尖瓣反流(MR)、間歇多次注射微球入左冠狀動脈竇構(gòu)建急性缺血性舒張功能障礙比格犬模型，具有操作簡便、方法可靠、成功率高等優(yōu)點。

超聲引導(dǎo)；二尖瓣反流；急性心肌缺血；左室舒張功能障礙；比格犬動物模型

既往報道的急性缺血性左室舒張功能受損模型主要有冠脈結(jié)扎法，這種方法創(chuàng)傷大，動物死亡率較高。傳統(tǒng)的二尖瓣反流動物模型分為開胸法和導(dǎo)管法[1,2]。開胸法為開胸后經(jīng)肺靜脈或左房頂部送入尖刀切斷二尖瓣腱索造成二尖瓣反流。導(dǎo)管法是經(jīng)X線引導(dǎo)，經(jīng)股動脈鞘管將帶切割頭的器械送至左心室造成二尖瓣腱索的損傷，導(dǎo)致二尖瓣反流，由于X線不能顯示二尖瓣、瓣下結(jié)構(gòu)及它們隨心動周期而運動的狀態(tài)，可能需反復(fù)操作才能成功。開胸法和導(dǎo)管法構(gòu)建二尖瓣反流操作煩瑣，具有一定盲目性，使應(yīng)用受到一定限制。

超聲可實時觀察、引導(dǎo)微創(chuàng)操作，精準、高效、無輻射，在文獻[1-6]報道的二尖瓣反流及左室舒張功能障礙模型構(gòu)建方法的基礎(chǔ)上，探索在超聲引導(dǎo)下構(gòu)建二尖瓣反流并急性缺血導(dǎo)致的左室舒張功能障礙的比格犬模型。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康成年比格犬15只，雌性6只，雄性9只，體重12～16 kg，平均(13.4±1.2)kg；犬齡2.2～3.5歲，平均犬齡(2.9±0.5)歲。解放軍總醫(yī)院實驗動物中心采購。動物購入后適應(yīng)一周后再行手術(shù)造模。

1.2 實驗儀器與試劑

1.2.1 主要試劑及配制 注射用血凝酶(立芷雪，深圳健安醫(yī)藥有限公司，1000 U/2 ml)。凝血酶凍干粉(長春國奧藥業(yè)有限公司, 1000 U/2 ml)用滅菌氯化鈉注射液溶解成每1 ml中含100 U的溶液。肝素鈉(上海第一生化藥業(yè)有限公司，1000 U/2 ml)用0.9%氯化鈉注射液配置成每500 ml含1000 U的肝素水，沖洗鞘管及各種導(dǎo)管。三聚氰胺甲醛樹脂微球(武漢華科微科科技有限責任公司，1000 U/2 ml)。200 mg微球溶于100 ml右旋糖酐40氯化鈉注射液中，置入聲波震蕩儀中搖勻，備用。

1.2.2 主要儀器 超聲儀：DC-7型彩色多普勒超聲儀，相控陣心臟探頭，頻率2.5 MHz(邁瑞醫(yī)療國際股份有限公司，中國深圳)。多導(dǎo)生理記錄儀：ML866 PowerLab 4(Adinstruments公司，澳大利亞，Chart7分析軟件)。橋式放大器：ML221(Adinstruments公司，澳大利亞)。Millar測壓導(dǎo)管：SPR-320(Millar 公司，美國)。呼吸機：SERIES7200(中農(nóng)同創(chuàng)生物科技有限公司，北京)。除顫儀：CJ-2(Philips公司，荷蘭)。動脈鞘：5F、6F、7F(泰爾茂醫(yī)療產(chǎn)品有限公司，日本)。指引導(dǎo)絲：GA35153、GA35183(泰爾茂醫(yī)療產(chǎn)品有限公司，日本)。內(nèi)鏡活體取樣鉗：MTN-BF-18/12-A(南京微創(chuàng)醫(yī)學科技有限公司，中國)。

1.3 方法

1.3.1 二尖瓣反流犬模型建立 犬術(shù)前禁食12 h，禁水4 h，頸部、前胸、腹股溝處備皮。首先用地西泮(50 mg/kg，肌內(nèi)注射)鎮(zhèn)靜，司可林(50 mg/kg)、3%戊巴比妥那(l ml/kg)靜脈麻醉，3%戊巴比妥那 30 mg/(kg·h)維持，直至實驗結(jié)束。采用仰臥位，氣管插管，呼吸機輔助呼吸。心電圖連接于超聲儀及生理記錄儀，實時顯示并可同步記錄Ⅱ?qū)?lián)心電圖。術(shù)前15 min肌注立芷雪0.5 U。

分離左側(cè)頸總動脈，局部滴利多卡因注射液0.5 ml防止血管痙攣。開胸，暴露心臟，切開心包。并用適量凝血酶凍干粉溶液噴灑創(chuàng)面防止傷口處滲血過多。將左頸動脈遠端結(jié)扎，16 G套管針左側(cè)頸動脈穿刺，穿入指引導(dǎo)絲，超聲引導(dǎo)下觀察導(dǎo)絲進入左心室，沿導(dǎo)絲送入5 F長動脈鞘至左心室，撤出指引導(dǎo)絲。將心臟超聲探頭放于心臟表面，選擇左心室長軸、心尖四腔心等切面，實時指導(dǎo)動脈鞘前端放置于二尖瓣前葉近瓣尖處，送入內(nèi)鏡活體取樣鉗，超聲觀察活檢鉗頭端置于二尖瓣前葉邊緣下方處，張開活檢鉗待瓣葉開放時鉗夾腱索，以造成腱索斷裂(圖1)，超聲觀察有中量或大量反流出現(xiàn)，定義為造膜成功。撤出活檢鉗，將左側(cè)頸動脈導(dǎo)管鞘外撤入升主動脈。超聲測量二尖瓣反流速度及壓差。用心耳鉗將心耳提起，插入壓力導(dǎo)管，多導(dǎo)生理儀顯示并記錄左心房壓力曲線?？p制心包吊床，將心包吊起、固定。

自心尖處將Millar導(dǎo)管插入左心室，多導(dǎo)生理儀顯示并記錄左室壓力曲線及dP/dt曲線。

二尖瓣反流程度判定標準，以多普勒彩色反流面積估計：輕度，<20%左房面積；中度，20%～40%左房面積；重度，>40%左房面積。

多導(dǎo)生理記錄儀顯示并記錄心電圖、左室舒張末壓、最大左室壓力下降速率(-dP/dtmax)及左室松弛時間常數(shù)(Tau)，作為構(gòu)建急性缺血性左室舒張功能受損模型的基礎(chǔ)數(shù)值。

圖1 二尖瓣反流犬模型建立中鉗夾后二尖瓣腱索斷裂箭頭所指為斷裂腱索的斷端

1.3.2 急性缺血性左室舒張功能障礙模型建立 在左室長軸切面及大動脈短軸切面，超聲引導(dǎo)下將左側(cè)頸動脈內(nèi)動脈鞘前端置于左冠狀動脈竇內(nèi)。然后將三聚氰胺微球溶液間歇多次注入左冠狀動脈竇(圖2)，首次2 ml，以后每次0.5～2 ml，間隔5～10 min，微栓塞2～9次/犬。觀察LVEDP升高≥5 mmHg，定義為誘發(fā)急性缺血性左室舒張功能障礙成功。

超聲引導(dǎo)下，將動脈鞘后撤至其前端位于升主動脈，動脈鞘連接于測壓導(dǎo)管，多導(dǎo)生理儀記錄主動脈壓力曲線。

圖2 急性缺血性左室舒張功能障礙犬模型超聲經(jīng)動脈鞘向左冠竇注入微球溶液，箭頭所示的左冠竇呈煙霧狀回聲

2 結(jié) 果

比格犬15只全部成功制作二尖瓣反流模型。13只鉗夾致腱索斷裂造成二尖瓣脫垂，1只鉗夾造成二尖瓣前葉裂孔，上述14只犬形成中度二尖瓣反流(1只犬存在自然二尖瓣輕度反流，鉗夾腱索斷裂后形成中度反流)，另1只鉗夾形成瓣葉裂孔并腱索斷裂，造成重度二尖瓣反流。連續(xù)多普勒頻譜測定，Vmax為(483.0±1.1) cm/s；PGmax為(162.7±1.8) mmHg。

12只構(gòu)建急性缺血左室舒張功能障礙模型成功，有2只犬栓塞4次，5只栓塞5～6次，4只栓塞8次，1只栓塞9次。平均耗時1.5 h。3只未成功，其中有1只死于室顫，1只死于心電機械分離，1只死于嚴重心梗、血流動力學不穩(wěn)定。成功模型的LVEDP升高、-dP/dtmax下降、Tau延長，均提示左室舒張功能明顯受損(表1)。

表1 比格犬注射微球前及模型成功后血流動力學參數(shù)比較 (n=12；±s)

注：與基礎(chǔ)狀態(tài)比較，①P<0.05

3 討 論

本研究采用超聲引導(dǎo)下，經(jīng)頸動脈鞘送活檢鉗至左心室，活檢鉗對二尖瓣前葉腱索進行鉗夾，切斷腱索造成二尖瓣反流，具有精準、高效的優(yōu)勢。實驗結(jié)果顯示15只模型全部制作成功，1只超聲探查發(fā)現(xiàn)術(shù)前存在輕度自然反流，鉗夾腱索斷形成中度二尖瓣反流。手術(shù)成功率高，無一只因制造二尖瓣反流模型而死亡。主要體會：首先，在入路上我們選擇左頸動脈通路，導(dǎo)管所經(jīng)途徑較股動脈短，更易到達左心室，便于術(shù)者操作；其次，超聲能夠?qū)崟r、清晰地顯示瓣膜及瓣下結(jié)構(gòu)、二尖瓣開閉狀態(tài)，能夠準確指導(dǎo)調(diào)整活檢鉗放置位置，達到“靶向損傷”；第三，超聲能實時觀察有無反流及反流程度，活檢鉗操作簡便可多次重復(fù)，以達到不同反流程度需求。

既往報道的急性缺血性左室舒張功能受損模型主要有冠脈結(jié)扎法和經(jīng)導(dǎo)管注射微球法[7，8]。開胸后結(jié)扎冠狀動脈的分支導(dǎo)致心肌梗死構(gòu)建左室舒張功能受損模型[5，9，10]有其缺陷性。結(jié)扎大動脈，容易因急性心肌缺血而造成室速、室顫、房室傳導(dǎo)阻滯、電機械分離等惡性心律失常，導(dǎo)致動物猝死；或因大面積心梗而造成急性左心衰竭、室壁瘤、心臟破裂等嚴重并發(fā)癥，導(dǎo)致動物無法耐受下一步實驗。而常規(guī)微球栓塞冠狀動脈制作方法，則需借助介入技術(shù)[11]，而開展這一技術(shù)需要大型X光造影機，需要操作人員具有一定的介入操作能力，且對人體具有一定量的輻射損害。相對動物而言，非大型動物使用常規(guī)型號的造影導(dǎo)管難以推送入主動脈竇部，更難以實行對某支冠脈的超選擇微栓塞。對于介入技術(shù)的過分依賴，造成該方法難以廣泛應(yīng)用。

本研究通過超聲引導(dǎo)下，經(jīng)頸動脈穿刺插置入動脈鞘至左冠狀動脈竇口，注射微球反復(fù)微栓塞冠狀動脈。冠脈微血管為直徑小于200 μm的血管，毛細血管平均直徑7 μm，本研究使用微球平均直徑為51.7 μm，說明微球可充分彌漫于小的冠狀動脈末端，造成微栓塞，建立動物模型。

文獻[12,13]報道，LVEDP升高≥5 mmHg即為舒張功能受損，導(dǎo)管法測量Tau指數(shù)正常應(yīng)<40 ms。以上實驗動物經(jīng)過反復(fù)冠脈微栓塞后，出現(xiàn)不同程度的LVEDP升高，-dP/dtmax下降、Tau延長，均提示左室舒張功能障礙模型成功[14-17]。穩(wěn)定的模型建立大約需要耗時1.5 h。由于室顫、血流動力學不穩(wěn)造成死亡的3只犬，均發(fā)生于實驗初期，主要由于初對微球注射間隔時間的把握經(jīng)驗不足，注射間隔較短所致。

總之，超聲引導(dǎo)下，經(jīng)頸動脈鞘管送入活檢鉗鉗夾二尖瓣腱索制造二尖瓣反流(MR)、間歇多次注射微球入左冠狀動脈竇構(gòu)建急性缺血性舒張功能障礙比格犬模型，具有操作簡便、方法可靠、成功率高等優(yōu)點。

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(2016-05-20收稿 2016-07-10修回)

(責任編輯 武建虎)

Establishing the model of acute ischaemic left heart failure with mitral regurgitation in beagles

SUN Jing1, FAN Chunzhi2, DOU Jianping3, and WEN Chaoyang4.

1.Department of Cardiology, Shaanxi Provincial Corps Hospital of Chinese People’s Armed Police Force, xi’an 710054, China; 2.Department of Ultrasonic Medicine, Beijing Chaoyang Hospital, Capital Medical University, Beijing 100043, China;3.Department of Ultrasonic Medicine, PLA General Hospital, Beijing 100853，China；4. Department of Ultrasonic Medicine, The First Affiliated Hospital of PLA General Hospital, Beijing 100048，China

Objective To establish the model of acute ischaemic left heart failure with mitral regurgitation in beagles. Methods (1)The construction of mitral regurgitation (MR)animal model: a catheter was introduced into left ventricle through the carotid artery in 15 experiment beagles, then a biopsy clamp was put into the mitral valve nearby through the catheterization and chordae tendineae was pinched under the guidance of echo in order to construct mitral regurgitation．(2) The construction of acute ischaemic left ventricular (LV) diastolic heart failure: 15 beagles with MR were further processed with coronary microembolization by microspheres repeatedly. Results (1) All mitral regurgitation models were successfully produced. The chordae tendineaes were broken in thirteen dogs, causing moderate MR. One dog with natural mild MR was with broken chordae tendineae. Continuous wave Doppler showed that the MR peak velocity was (483±1.12) cm/s, the maximun pressure gradient was (162.7±1.8) mmHg. (2)12 models of acute ischaemic left diastolic heart failure with mitral regurgitation were established. Left ventricular end-diastolic pressure emitting equal or greater than 5 mmHg was defined as model successful. The left ventricular end-diastolic pressure (LVEDP), -dP/dtmax, Tau-c in successful model were increased significantly (P<0.05). Conclusions This method is safe, feasible and easily successful in constructing the MR animal model under the guidance of transthoracic echocardiography．Coronary microembolization with microspheres is a sueeessfull way for establishing the acute ischaemic left diastolic heart failure.

guiding of transthoracic echocardiography; MR; acute myocardial ischaemic; left ventricular (LV) diastolic failure; beagles animal model

孫 靜，碩士研究生，主治醫(yī)師。

710054 西安，武警陜西總隊醫(yī)院心內(nèi)科；2.100043 北京，首都醫(yī)科大學附屬北京朝陽醫(yī)院超聲醫(yī)學科；3.100853 北京，解放軍總醫(yī)院介入超聲科；4.100048 北京，解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院超聲科

溫朝陽，E-mail：wency301@vip.sina.com

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