劉紅霞 王 華 于臘梅 郭 莉

濱州醫(yī)學院基礎醫(yī)學院生理學教研室 煙臺 264003

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·論著·

硫化氫對慢性應激抑郁模型大鼠行為及海馬SOD活力和MDA含量的影響

劉紅霞 王 華 于臘梅 郭 莉

濱州醫(yī)學院基礎醫(yī)學院生理學教研室 煙臺 264003

目的 觀察硫化氫(H2S)對慢性應激抑郁模型大鼠行為和海馬組織氧化應激的影響。方法 雄性健康成年Wistar大鼠，隨機分為正常對照組、應激抑郁(chronic unpredictable mild stress，CUMS)組、CUMS+低劑量NaHS(CUMS+L-NaHS)組、CUMS+高劑量NaHS(CUMS+H-NaHS)組。采用CUMS加孤養(yǎng)復制大鼠抑郁模型。用強迫游泳實驗檢測大鼠行為學變化，用比色法檢測海馬組織中超氧化物歧化酶(SOD)的活性和丙二醛(MDA)的含量。結果 與正常對照組比較，CUMS組大鼠強迫游泳不動時間顯著延長，海馬區(qū)SOD活性減低，MDA含量增高；與CUMS組比較，CUMS+L-NaHS組、CUMS+H-NaHS組大鼠強迫游泳不動時間均明顯縮短，海馬區(qū)SOD活性明顯升高，MDA含量均明顯下降。結論 H2S供體NaHS對慢性輕度不可預見性應激誘導的抑郁模型大鼠具有抗抑郁作用，其機制與提高大鼠的抗氧化應激能力有關。

硫化氫；抑郁癥；超氧化物歧化酶；丙二醛；氧化應激

抑郁癥患者表現(xiàn)出情感障礙及學習和記憶能力受損，有研究報道，抑郁癥患者腦組織存在脂類的氧化性損傷[1]，這是由于腦組織是動物氧代謝水平最高的組織，當腦內(nèi)發(fā)生創(chuàng)傷性損傷或病理性損傷(例如抑郁癥)時將會產(chǎn)生大量的氧自由基[2]。海馬是與情緒和學習記憶功能密切相關的腦區(qū)，也是應激易累及損傷的靶區(qū)[3-4]，且MRI顯示海馬體積縮小萎縮的程度與抑郁發(fā)作的頻率和抑郁未治療的持續(xù)時間有關[5]。硫化氫(hydrogen sulfide，H2S)具有抗氧化應激、細胞凋亡及神經(jīng)系統(tǒng)炎癥等神經(jīng)保護作用[6]。本實驗通過建立慢性不可預知性溫和性應激(chronic unpredictable mild stress，CUMS)模型，腹腔注射硫化氫供體NaHS進行抗抑郁治療，觀察應激前后及注射NaHS前后大鼠行為學變化，海馬區(qū)超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)的活力及丙二醛(malonaldehyde，MDA)含量變化，探討H2S對慢性抑郁障礙的防治作用，為臨床抑郁癥的診治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要實驗藥品、試劑及儀器 NaHS購于Sigma公司；SOD和MDA檢測試劑盒購于南京建成生物工程研究所；Uv-VIS spectrophotometer(U-1800型，日本Tokyo)全自動分光光度計；高速臺式低溫離心機(TGL-16M，美國Beckman)。

1.2 實驗動物、動物分組及給藥 實驗選用雄性健康成年Wistar大鼠(青島市藥檢所動物中心提供)，體質(zhì)量為280～300 g。適應性飼養(yǎng)大鼠1周，自由進食飲水，室溫為(20±3)℃。實驗前，用曠場實驗對大鼠進行行為學評分，選擇各項行為學得分相近的大鼠隨機分為正常對照(control)組、應激抑郁(CUMS)組、CUMS+低劑量NaHS(CUMS+L-NaHS)組、CUMS+高劑量NaHS(CUMS+H-NaHS)組，每組10只。低劑量與高劑量NaHS治療組每天分別腹腔注射1.68、5.6 mg·kg-1NaHS。給藥從造模第15天開始，所有大鼠連續(xù)給藥14天。正常對照組和CUMS組每天腹腔注射生理鹽水(按5 mL/kg 注射)。

1.3 抑郁模型的建立 根據(jù)文獻[7]建立模型，并加以改進。正常對照組大鼠正常條件飼養(yǎng)；其余3組大鼠用慢性不可預知性溫和性應激刺激進行抑郁造模，大鼠單籠飼養(yǎng)，進行28天隨機應激，包括足底電擊(強度10 mA，間隔1 min刺激1次，持續(xù)刺激10 s，共30次)、熱水游泳(45℃，5 min)、冰水游泳(4℃，5 min)、禁水(24 h)、禁食(24 h)、鼠籠傾斜(24 h)、潮濕墊料(24 h)、水平搖晃(5 min)和夾尾(1 min)共9種刺激方法，每日給予1種刺激，每種刺激≥2次，同種刺激不能連續(xù)出現(xiàn)，使大鼠不能預測刺激的發(fā)生，以避免發(fā)生適應性。

1.4 大鼠強迫游泳實驗(forced swimmingtest，F(xiàn)ST) 將動物動作輕柔地單獨置于大鼠強迫游泳圓筒內(nèi)，桶內(nèi)裝水，桶高度70 cm，內(nèi)徑 30 cm ，水面高度35 cm，水溫23～25°C，用攝像頭采集測試影像，共測試6 min，前2分鐘作為大鼠適應階段，后4分鐘納入不動狀態(tài)的時間統(tǒng)計。不動狀態(tài)的標準為大鼠漂浮或者僅有細小肢體運動，沿圓筒壁攀爬和掙扎不列入標準。每只大鼠測試前，更換一次游泳用水，避免重復用水對測試大鼠產(chǎn)生影響。游泳結束后，毛巾擦干大鼠，放回籠中。用漂浮不動時間作為判斷大鼠抑郁嚴重程度的指標。

1.5 海馬組織SOD和MDA含量測定 行為學實驗完成后，斷頭處死大鼠，在冰上迅速取出全腦并分離海馬組織，在預冷的生理鹽水中漂洗，濾紙吸干，稱重，按質(zhì)量加9倍的生理鹽水將腦組織制成勻漿，低溫離心3 000轉(zhuǎn)/ min，共15 min，取上清液，按照SOD、MDA試劑盒說明書檢測SOD活性和MDA含量。樣品具體處理過程及檢測方法均按試劑盒說明書進行，最后讀取各管吸光度值并計算數(shù)值。

2 結果

2.1 造模前后及硫化氫治療后各組大鼠強迫游泳指標變化 與正常對照組比較，CUMS組大鼠強迫游泳不動時間顯著延長(P<0.01)；與CUMS組比較，CUMS+L-NaHS組、CUMS+H-NaHS組大鼠強迫游泳不動時間均明顯縮短(P<0.01)(圖1)。

##P<0.01，與正常組比較；**P<0.01，與CUMS組比較。

圖1 各組大鼠強迫游泳實驗中不動時間比較

2.2 造模前后及硫化氫治療后各組大鼠海馬SOD和MDA含量變化 經(jīng)過28天慢性不可預知性溫和性應激刺激后，與正常對照組相比較，CUMS組大鼠海馬區(qū)SOD活性減低(P<0.01)，MDA含量增高(P<0.01)，具有顯著性差異；與CUMS組相比，CUMS+ L-NaHS組、CUMS+ H-NaHS組大鼠海馬區(qū)SOD活性明顯升高(P<0.01)，MDA含量均明顯下降(P<0.05)(圖2、3)。

##P<0.01，#P<0.05與正常組比較；**P<0.01，與CUMS組比較。

圖2 各組大鼠海馬區(qū)SOD活力的比較

##P<0.01，#P<0.05與正常組比較；*P<0.05，與CUMS組比較。

圖3 各組大鼠海馬區(qū)MDA含量的比較

3 討 論

抑郁癥是一種嚴重影響人類身心健康的神經(jīng)精神性疾病。慢性輕度不可預見性應激(CUMS)抑郁大鼠模型[7]與人類抑郁癥中慢性低水平的應激源促進抑郁癥的發(fā)生發(fā)展機理較為接近，具有合理的理論基礎，可模擬抑郁癥患者的部分發(fā)病原因與臨床癥狀，被國內(nèi)外學者廣泛應用于抑郁癥病理生理機制研究。本實驗采用了單籠孤養(yǎng)結合慢性輕度不可預見性應激建立抑郁大鼠模型。大鼠強迫游泳實驗是置于局限環(huán)境(如水中)中的動物在該環(huán)境下拼命掙扎試圖逃脫而又無法逃脫，測試過程中會表現(xiàn)出行為上的“不動狀態(tài)”，記錄該“不動狀態(tài)”的時間，即可以反映出動物的行為絕望狀態(tài)。不動時間越長，表示大鼠行為絕望狀態(tài)越嚴重，越傾向于抑郁癥。這種行為絕望狀態(tài)與抑郁癥的表征相類似，并且可以靈敏地反映抗抑郁藥物的效應，所以被廣泛應用于抗抑郁藥物的藥效學評價。本實驗以強迫游泳實驗中不動時間作為大鼠絕望行為的客觀指標，通過28天的單籠孤養(yǎng)結合慢性輕度不可預見性應激刺激，與正常對照組比較，抑郁組大鼠表現(xiàn)出強迫游泳不動時間明顯延長，表明大鼠抑郁模型復制成功。本實驗亦發(fā)現(xiàn)，造模過程中給予腹腔注射NaHS的兩組大鼠強迫游泳不動時間較模型組均縮短，該結果提示H2S的外源性供體NaHS具有抗抑郁作用。

有研究發(fā)現(xiàn)抑郁癥可引起體內(nèi)神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的功能變化，并伴有氧化/抗氧化應激系統(tǒng)失衡，引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)的氧化損傷[1]。應激使機體代謝異常產(chǎn)生大量自由基，過量的自由基超過了抗氧化系統(tǒng)的還原能力，導致機體損傷。MDA是不飽和脂肪酸在自由基作用下發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應時產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，其含量可反映機體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，間接反映應細胞損傷的程度[8]。SOD是內(nèi)源性抗氧化酶，可清除自由基，保護細胞免受自由基的損傷，其活力的高低可反映機體清除氧自由基的能力。因此，通過測定MDA 的含量和SOD酶的活性可反映腦缺血損傷時氧化和抗氧化的程度。腦組織代謝旺盛，耗氧量較大，含有豐富的脂質(zhì)，對氧自由基引起的損傷更為敏感，氧自由基引起的氧化損傷是腦部結構及功能繼發(fā)性損害的主要原因之一。海馬是與學習記憶和情緒行為功能密切相關的重要腦區(qū)，也是應激易累及損傷的靶區(qū)，抑郁癥患者的海馬體積減小，海馬神經(jīng)元變性、壞死[9-10]。有實驗證實抑郁模型大鼠皮層和海馬組織中的SOD的活性下降，MDA含量增加[11]。本研究結果顯示慢性應激抑郁模型大鼠海馬組織中SOD活性明顯降低，而脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA含量明顯升高，提示慢性應激抑郁模型大鼠體內(nèi)氧化與抗氧化系統(tǒng)失衡，與以上研究結果相一致。

H2S是一種具有臭雞蛋氣味的氣體，在體內(nèi)1/3以氣體形式存在，2/3以NaHS 形式存在[12]。20世紀80年代末，人們發(fā)現(xiàn)在生理狀態(tài)下腦組織中可檢測到H2S 的存在。近年來，大量文獻報道H2S 調(diào)節(jié)多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能，如參與神經(jīng)元興奮、學習和記憶的調(diào)節(jié)等。其作用機制主要涉及抗氧化、抗炎癥及抗凋亡等作用[6]。Kimura等[12-13]研究發(fā)現(xiàn)H2S 可通過提高細胞內(nèi)的谷胱甘肽水平，提高抗氧化酶活性，抗脂質(zhì)過氧化損傷，清除自由基而使細胞避免氧化應激。本研究中CUMS造模過程中給予腹腔注射NaHS的兩組大鼠與CUMS組大鼠相比，海馬組織中SOD活性增加，MDA含量下降，提示H2S的外源性供體NaHS抗抑郁作用可能與其增強抗氧化酶活性和抗脂質(zhì)過氧化有關，與以上研究結果一致。

綜上所述，H2S供體NaHS對慢性輕度不可預見性應激誘導的抑郁模型大鼠具有抗抑郁作用，其抗抑郁機制可能與提高腦部抗氧化酶的活性，清除腦部自由基，改善機體氧化/抗氧化應激平衡狀態(tài)有關。

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The effect of hydrogen sulfide on the behavior and SOD activity and MDA content of hippocampus in rats with chronic stress depression

LIU Hongxia WANG Hua YU Lamei GUO Li

Teaching and Research Section of Physiology,School of Basic Medical Sciences,Binzhou Medical University,Yantai 264003,P.R.China

Objective To observe the effects of hydrogen sulfide (H2S) on the behaviors,SOD (superoxide dismutase, SOD) activity and MDA (malonaldehyde,MDA) content of hippocampus in chronic stress depression rats.Methods Healthy male Wistar rats were randomly separated into normal control group,CUMS group,CUMS+L-NaHS group,CUMS+H-NaHS group.A rat depression model was induced by CUMS.Behaviors of rats were assessed by forced swimming test and UV spectrophotometer analysis technique was used to detect SOD activity and MDA content of hippocampus.Results Immobility time of rat in forced swimming test increased,SOD activity decreased and MDA content increased in the CUMS group rats.NaHS treatment could partly reverse these changes.Conclusion NaHS, the donor of H2S,could relieve the depression induced by CUMS in rats, and the mechanism may be correlated to increasing the antioxidative stress ability of rats.

hydrogen sulfide,depression,superoxide dismutase,malonaldehyde,oxidative stress

山東省自然科學基金(ZR2013HL009)；煙臺市科技發(fā)展計劃項目(2012ZH248)

R338.2

A

1001-9510(2016)05-0321-04

2016-07-05)

劉紅霞，E-mail: liuhongxia3210@163.com