?

高效液相色譜法測定人血漿中百草枯濃度

目的 建立人血漿中百草枯濃度高效液相色譜檢測方法，為百草枯中毒患者預(yù)后評估、治療方案選擇提供方法學(xué)支持。方法 樣品處理采用35%高氯酸處理。流動相為0.1mol·L-1磷酸緩沖液(含75 mmol·L-1庚烷磺酸鈉)-乙腈(88∶12，三乙胺調(diào)pH=3.0)；流速為1.0 mL·min-1；柱溫為28℃；檢測波長為258 nm。結(jié)果 所采用方法在0.2～500 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。平均絕對回收率為100.6%，RSD均小于3%；平均相對回收率為101.31%，RSD均小于6%。日內(nèi)和日間RSD均小于6%，凍融及凍存后百草枯樣品濃度測定結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論 高效液相色譜檢測方法快速，準(zhǔn)確、血液中雜質(zhì)無干擾，適用于百草枯中毒患者血藥濃度的分析測定。

百草枯；液相色譜法；血藥濃度

百草枯(paraquat，PQ)是目前廣泛應(yīng)用的有機雜環(huán)類除草劑，對人畜均具有高毒性[1]。口服中毒為其主要中毒途徑，文獻[2]報道人口服百草枯死亡率高達50%以上，目前臨床尚無有效治療方法。百草枯經(jīng)血液循環(huán)分布于肺、肝、腎、甲狀腺、肌肉中，造成多器官系統(tǒng)功能損害，是百草枯中毒死亡的主要原因[3]。血液中百草枯濃度與救治成活率密切相關(guān)，并可早期預(yù)測患者預(yù)后[4]。對于百草枯的分析檢測方法有紫外分光光度法、色譜法、毛細管電泳法等多種方法[5-7]，其提取方法也有液-液萃取法、固相萃取法等多種[8]，但操作繁瑣，費時費力，不利于臨床實踐應(yīng)用。本文采用簡單的蛋白沉淀法處理血漿樣本，建立專一、靈敏、快速的高效液相色譜法(HPLC)檢測血漿中百草枯濃度，可為評估患者中毒程度，建立百草枯中毒預(yù)后判斷指標(biāo)，評價臨床治療方案效果提供方法學(xué)支持。

1 資料與方法

1.1 儀器與試劑 福立 FL2200Ⅱ高效液相色譜儀，配有色譜工作站；eppendorf AG22331 minispin plus高速臺式離心機；IKA VORTEX genius.3渦旋混合器；梅特勒-托利多 AL-204分析天平；百草枯標(biāo)準(zhǔn)品(上立方聯(lián)合化工技術(shù)研究院 批號20107038)；1-庚烷磺酸鈉(國藥集團化學(xué)試劑有限公司 批號20110511)；乙腈、甲醇、三乙胺均為色譜純。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱為Utimate·XB-C18分析柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相為0.1 mmol-L-1磷酸緩沖液(含75 mmol·L-1庚烷磺酸鈉)-乙腈(88∶12，三乙胺調(diào)pH=3.0)；流速：1.0 mL/min；柱溫28℃；檢測波長為258 nm。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制 精密稱取百草枯標(biāo)準(zhǔn)品2.0 mg置于1.0 mL EP管中，以純水溶解并定容至刻度，得質(zhì)量濃度為2 000.0 μg·mL-1的百草枯儲備液，4℃冰箱內(nèi)避光儲存。用時取儲備液用純水逐級稀釋，配成含百草枯質(zhì)量濃度分別為2、20、200 μg·mL-1的百草枯系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.3 樣品處理 取樣品0.5 mL 置EP管中，加入35%高氯酸100 μL，渦漩1 min，低溫高速13 000 r/min，離心5 min，取上清液20 μL進行高效液相色譜分析。

1.2.4 方法專一性 分別取空白血漿、200 μg·mL-1百草枯標(biāo)準(zhǔn)溶液、空白血漿+200 μg·mL-1百草枯標(biāo)準(zhǔn)溶液、待測血漿樣品，按“1.2.3”項下方法操作，得色譜圖，確定百草枯出峰時間，排除血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)對百草枯測定的干擾。

1.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立 精密吸取百草枯標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，分別加入到空白血漿中，得百草枯濃度為0.2、0.5、2、5、20、50、200、500 μg·mL-1的血漿樣品。照“1.2.3”項下方法操作后，上述色譜條件下進行分析，分別以濃度(y)對峰面積(x)做線性回歸，得血漿百草枯濃度回歸方程，并檢測百草枯濃度定量下限。

1.2.6 絕對回收率 于空白血漿中加入適量不同濃度百草枯標(biāo)準(zhǔn)溶液，使百草枯濃度分別為2、20、200 μg·mL-1，按“1.2.3”項下方法處理，同時測定相應(yīng)濃度的百草枯標(biāo)準(zhǔn)溶液。將血漿樣品中與相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)溶液中的百草枯峰面積進行比較，測得絕對回收率。

1.2.7 相對回收率 于空白血漿中加入適量不同濃度百草枯標(biāo)準(zhǔn)溶液，使百草枯濃度分別為2、20、200 μg·mL-1，按“1.2.3”項下方法處理，每個濃度平行測定5份樣本，計算相對回收率，評價方法的準(zhǔn)確度。

1.2.8 批內(nèi)和批間精密度 以空白血漿配制2、20、200 μg·mL-1濃度梯度的百草枯系列溶液，按“1.2.3”項下方法處理，此為1個分析批；連續(xù)3天，每天測定1個分析批，分別用當(dāng)日標(biāo)準(zhǔn)曲線計算測得濃度。計算日內(nèi)和日間的相對標(biāo)準(zhǔn)差(RSD)，評價方法的精密度。

1.2.9 穩(wěn)定性試驗 以空白血漿配制2、20、200μg·mL-1濃度梯度的百草枯系列溶液，按時間分為原點，-20℃凍融1次，凍融2次，-20℃存放1天，存放7天。按“1.2.3”項下方法處理，每個濃度在每個時間點平行測定5份樣本，分別用當(dāng)日標(biāo)準(zhǔn)曲線計算測得濃度，評價-20℃凍融與存放時間百草枯穩(wěn)定性的影響。

2 結(jié)果

2.1 方法專一性 在本實驗色譜條件下，血漿中百草枯峰形良好，分離完全，不受血漿內(nèi)雜質(zhì)蜂干擾，百草枯保留時間為7 min左右，本方法具有較好的專一性，見圖1。

2.2 線性范圍與檢出限 百草枯的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=0.000011x-0.9956，r=0.998，y為百草枯的濃度(μg·mL-1)，x為峰面積。表明百草枯在0.2～500 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。最低檢出限(S/N=3)可達0.1 μg·mL-1。

2.3 回收率和精密度試驗 回收率結(jié)果見表1，平均絕對回收率為100.6%，RSD均小于3%；平均相對回收率為101.31%，RSD均小于6%。日內(nèi)和日間精密度見表2，RSD均小于6%。

表1 百草枯回收率(n=5)

表2 百草枯精密度(n=5)

2.4 穩(wěn)定性試驗 反復(fù)凍融及凍存不同時間百草枯樣品濃度測定結(jié)果見表3、4，三組間及組件兩兩比較無顯著性差異，P值均大于0.05，RSD均小于8%，表明上述條件下百草枯樣品穩(wěn)定。

表3 百草枯凍融穩(wěn)定性(n=5)

注：與原點比較，◆P>0.05；與凍融1次比較，●P>0.05，三組間比較，P>0.05。

表4 百草枯凍存穩(wěn)定性(n=5)

注：與原點比較，◆P>0.05；與凍存1次比較，●P>0.05，三組間比較，P>0.05。

3 應(yīng)用

患者郭某某，男，32歲，體重72 kg，口服20%百草枯溶液50 mL后半小時入院。于入院當(dāng)時，服毒后6、12、24、36、48 h取血漿，按照“1.2.3”項下方法操作，測定血漿中百草枯濃度，血藥濃度時間曲線見圖2?？梢娀颊呖诜俨菘莺螅獫{中百草枯濃度會隨時間推移而顯著下降，至48 h 后已難以測出，因此在臨床工作中，要及早進行洗胃，導(dǎo)瀉，血液灌流及抗氧自由基等綜合治療，盡最大可能挽救患者生命。

4 討論

百草枯的分子式為C12H14N2，分子量為186.3，純品為白色結(jié)晶，以陽離子形式存在，易溶于水，微溶于乙醇，300℃左右分解，在酸性及中性溶液中穩(wěn)定，可被堿水解，常用的為20%水溶液。由于其強極性及高沸點，因而液相色譜法尤其是高效液相色譜法是最常用的百草枯檢測方法。檢測效果和具體分析方法因選擇的色譜儀、色譜柱、流動相等的不同而異。通常情況下百草枯液相色譜法選用離子對試劑的流動相、富集特性強的色譜柱，更能獲得顯著的分析檢測結(jié)果[9-10]。百草枯生物樣品的預(yù)處理方法多采用固相萃取法[8]，成本較高且涉及多種化學(xué)試劑，步驟繁雜。本實驗參照Hara 等[11]，王雷等[12]報道的條件，采用高氯酸直接沉淀蛋白的方法，簡便快捷，且沉淀完全，在檢測中未見有干擾組分，且獲得了較高的回收率，從圖1血漿中百草枯色譜圖看，血漿中內(nèi)源性物質(zhì)多在6 min內(nèi)出峰，不干擾百草枯的測定。

本方法選用磷酸溶液作緩沖液，庚烷磺酸鈉作離子對試劑，乙腈為有機溶劑，同時用有機堿三乙胺調(diào)節(jié)pH值。結(jié)果顯示，百草枯峰形良好，保留時間適當(dāng)，回收率和精密度符合方法學(xué)要求，分析過程簡單易行，整個檢測過程可在30 min內(nèi)完成。本研究發(fā)現(xiàn)，流動相的存放時間可對百草枯保留時間有一定影響，這可能與流動相中乙腈揮發(fā)，導(dǎo)致流動相中乙腈比例降低有關(guān)。流動相中庚烷磺酸鈉的濃度及乙腈比例對百草枯的保留時間影響較大，庚烷磺酸鈉濃度降低或乙腈比例升高，都會使百草枯保留時間縮短，且有拖尾現(xiàn)象。當(dāng)柱溫為28℃，流動相中庚烷磺酸鈉含量為75 mmol·L-1，乙腈體積比為12%時，百草枯分離良好，同時避免了血漿中雜峰的干擾，能得到較好色譜圖。經(jīng)方法學(xué)驗證，其靈敏度、專一性、線性范圍、精密度、準(zhǔn)確度等，符合生物樣品分析方法要求，重現(xiàn)性好，可應(yīng)用于臨床百草枯中毒患者的血藥濃度快速檢測。

[1] Goel A,Aggarwal P.Pesticide poisoning[J].Natl Med J India,2007,20(4):182-191.

[2] 王生級, 范曉婷,吳偉,等.血必凈注射液對百草枯中毒短期預(yù)后影響的Meta分析[J].中國中西醫(yī)結(jié)合急救雜志,2011,18(4):222-224.

[3] 孔慶福, 張華, 王麗, 等. 急性百草枯中毒早期器官損害與細胞因子的變化[J].中國中西醫(yī)結(jié)合急救雜志,2010,17(3):159-162.

[4] Senarathna L,Eddleston M,Wilks M F,et al.Prediction of outcome after paraquat poisoning by measurement of the plasma paraquat concentration[J].QJM,2009,102(4):251-259.

[5] de Almeida R M,Yonamine M.Enzymatic-spectrophotometric determination of paraquat in urine samples:a method based on its toxic mechanism[J].Toxicol Mech Methods,2010,20(7):424-427.

[6] Whitehead R D Jr,Montesano M A,Jayatilaka N K,et al.Method for measurement of the quaternary amine compounds paraquat and diquat in human urine using high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J].J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci,2010,878(27):2548-2553.

[7] Lanaro R,Costa J L,Fernandes L C,et al.Detection of paraquat in oral fluid,plasma,and urine by capillary electrophoresis for diagnosis of acute poisoning[J].J Anal Toxicol,2011,35(5):274-279.

[8] Baeck S K,Shin Y S,Chung H S,et al.Comparison study of the extraction methods of paraquat in post-mortem human blood samples[J].Arch Pharm Res,2007,30(2):235-239.

[9] Zou Y,Shi Y,Bai Y,et al.An improved approach for extraction and high-performance liquid chromatography analysis of paraquat in human plasma[J].J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci,2011,879(20):1809-1812.

[10] Ito M,Hori Y,Fujisawa M,et al.Rapid analysis method for paraquat and diquat in the serum using ion-pair high-performance liquid chromatography[J].Biol Pharm Bull,2005,28(4):725-728.

[11] Hara S,Sasaki N,Takase D,et al.Rapid and sensitive HPLC method for the simultaneous determination of paraquat and diquat in human serum[J].Anal Sci,2007,23(5):523-526.

[12] 王雷,王本杰,孔祥麟, 等.高效液相色譜法測定大鼠血漿中百草枯的含量[J].藥物分析雜志,2009,29(4):623-626.

HPLC determination of paraquat concentration in human plasma

SUN Bin LUAN Chunye GUO Lisha ZHUANG Fuju XIA Juanjuan QIU Jianqing

Department of Emergency,Binzhou Medical University Hospital,Binzhou 256603，P.R.China

Objective To establish an HPLC method for determination of paraquat in human plasma to provide methodology support for the assessment of prognosis and choice of therapy of patients with paraquat poisoning.Methods The plasma samples were deproteimized with 35% perchlorld acid.The mobile phase consisted of 0.1 mol·L-1phosphate buffer (75 mmol·L-1sodium heptanesulfonate)-acetonitrile (88:12), adjusted pH to 3.0 by triethylamine,at a flowrate of 1.0 mL·min-1,and the detection occurred at 258 nm, column temperature at 28℃.Results A good linearity was obtained in the concentration range of 0.2～500 μg·mL-1.The average absolute recovery was 100.6%,RSD were less than 3%,average relative recovery was 101.31%,RSD less than 6%.The intra-day and inter-day RSD were less than 6%. After thawing and frozen,concentration of paraquat showed no significant difference.Conclusion HPLC method was rapid, accurate and without interference of impurities, which could be applied in analysis and determination of plasma concentration for patients with paraquat poisoning.

paraquat,HPLC,plasma concentration

山東省醫(yī)藥衛(wèi)生科技發(fā)展計劃項目(2013WS0307)

邱建清,E-mail: sbalyf@163.com

孫 斌 欒春業(yè) 郭麗莎 莊福聚 夏娟娟 邱建清

濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院急診科 濱州 256603

R 595.9

A

1001-9510(2016)05-0342-04

2016-06-21)