?賈志剛，夏德安，李淑娟?

（東北林業(yè)大學林木遺傳育種國家重點實驗室，黑龍江　哈爾濱　150040）

楊樹環(huán)化酶基因組織表達模式和蛋白定位

賈志剛，夏德安，李淑娟

（東北林業(yè)大學林木遺傳育種國家重點實驗室，黑龍江哈爾濱150040）

半定量RT-PCR顯示，毛果楊形成層、幼葉和頂芽中的Potri.006G237100轉錄產物極低，但在木質部、葉柄和根中其轉錄水平卻較髙，在木質化莖節(jié)其轉錄產物也呈現高豐度積累，這表明Potri.006G237100在毛果楊木質化組織中特異地、高豐度轉錄表達。實驗構建pGWB5-Potri.006G237100載體，轉化擬南芥、分子鑒定得到5個過量表達轉基因植株，激光共聚焦分析顯示融合蛋白Potri.006G237100-GFP定位在轉基因植株的細胞質。

環(huán)化酶；組織表達模式；Potri.006G237100；蛋白定位；楊樹

環(huán)化酶是一種催化核苷三磷酸生成環(huán)核苷酸的酶，廣泛存在于動物、植物、微生物[1]。環(huán)化酶編碼基因呈現基因家族特征，在植物中存在多種類型，參與植物的多種生物學功能。研究報道，水稻的一類環(huán)化酶通過控制活性氧水平參與逆境脅迫[2]。番茄紅素ε-環(huán)化酶基因過量表達與光合作用有關[3]，番茄紅素β-環(huán)化酶基因參與小麥β-胡蘿卜素生物合成[4]。丙二烯環(huán)化酶基因參與作物的耐鹽性，過量表達該基因增加水稻在高鹽度環(huán)境下生物量[5]，這種功能在小麥中也有類似報道[6]。然而，環(huán)化酶基因在樹木中的研究信息卻報道甚少。

在前期研究中分離了一個楊樹環(huán)化酶基因Potri.006G237100，推測它可能參與木材形成。為了鑒定該基因的功能，采用半定量RT-PCR分析Potri.006G237100的組織中表達特性，及其轉錄水平與莖木質化程度同步情況。此外，通過融合綠色熒光蛋白GFP策略，分析Potri.006G237100-GFP融合蛋白在轉基因擬南芥植株細胞內的定位。以期對今后解析楊樹Potri.006G237100在木材形成上作用提供重要的基礎信息。

1　材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1植物材料從頂端向基部分別取毛果楊第1至第10莖節(jié)以及木質部、形成層、韌皮部、幼葉、老葉、葉柄、頂芽和根各組織，用于鑒定目標基因的組織表達特性。Columbia野生型擬南芥即WT作為遺傳轉化環(huán)化酶基因Potri.006G237100所需的擬南芥材料。

1.1.2載體和試劑載體：pENTR/SD/D-TOPO載體、LR Clonase載體、GWB5、pGWB2；主要試劑：植物基因組DNA提取試劑、DNA Marker、dNTP、pMD18-T載體、Taq DNA聚合酶和PrimeScript RT reagent Kit with gDNA eraser試劑盒。

1.2試驗方法

1.2.1植物總RNA提取及cDNA合成植物樣品材料經液氮速凍、研碎至粉末，移入1.5 mL離心管內，按0.1 g樣品加入0.5 mL pBIOZOL試劑，具體操作參照pBIOZOL試劑說明書。用不含核糖核酸酶水溶解總RNA，測定濃度和純度?？俢DNA合成使用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA eraser試劑盒，操作步驟參照其說明書。

1.2.2引物設計及序列Potri.006G237100基因所需擴增片段長度為507 bp，引物序列為：cds-UP：5′-ATGG CAGAAGAAACACCACAGAT-3′；cds-DN：5′- ACCC GATAGGA CATC CTGTTCCA-3′。內參基因ACT引物序列為：UP5′-CCCAGTGTTGTTGGTAGGCCA AGAC-3′；DN5′-CATAGCGGGAGAGTTAAAGGTCTC-3′。

1.2.3PCR擴增總體系為20 μL，水13 μL，模板1.0 μL，Taq DNA聚合酶1.0 μL，dNTP 2.0 μL，10×Buffer 2.0 μL，上、下游引物各0.5 μL。PCR反應程序：預變性95℃ 5 min，變性95℃ 30 s，引物退火均為62℃ 30 s、72℃ 30 s，擴增30循環(huán)，72℃延伸7 min，16℃保存。1.2.4植物表達載體構建及遺傳轉化擬南芥取30～60 ng基因片段和pENTR/SD/D-TOPO載體進行連接反應，體系為5 μL、反應時間2 h。取1 μL連接產物轉化TOP10感受態(tài)細胞，通過菌落PCR擴增進行陽性菌落篩選，并結合DNA測序。將帶有目的基因片段pENTR/SD/D-TOPO質粒與pGWB5植物表達載體LR反應，反應體系2.5 μL、反應時間8～12 h，取1 μL連接產物轉化DH5α感受態(tài)細胞，通過菌落PCR鑒定陽性菌落，重組質粒轉化GV3101農桿菌。擬南芥遺傳轉化用農桿菌蘸花法，操作參見文獻[7]。

1.2.5植物基因組DNA提取擬南芥基因組DNA提取方法參見文獻[8]。

1.2.6綠色熒光蛋白GFP檢測在1/2MS培養(yǎng)基上萌發(fā)6 d的幼苗被用于GFP熒光檢測。使用Zeiss LSM700激光共聚焦顯微鏡進行GFP熒光觀察和拍照，激發(fā)波長設定為488 nm。

2　結果與分析

2.1環(huán)化酶Potri.006G237100基因表達分析

為了鑒定楊樹Potri.006G237100基因在楊樹各組織的表達情況，首先以毛果楊的木質部、形成層、韌皮部、幼葉、老葉、葉柄、頂芽和根組織為模板，用該環(huán)化酶基因全長引物進行半定量RT-PCR擴增，經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果顯示：毛果楊Potri.006G237100基因在木質部、根、葉柄組織中轉錄表達水平最高，在韌皮部、老葉組織中轉錄表達水平低于木質部、葉柄、根組織中的轉錄表達水平，在形成層、幼葉和頂芽基本沒有轉錄水平表達，同時，使用內參基因ACT作為半定量RT-PCR內標，ACT基因擴增數據顯示木質部、形成層、韌皮部、幼葉、老葉、葉柄、頂芽、根組織各樣品cDNA模板濃度基本相同（圖1A）。

試驗通過分析第1至第10莖節(jié)中的Potri.006G237100基因轉錄水平，以進一步確定該基因轉錄水平與木質化組織相關性。在第1第2莖節(jié)處Potri.006G237100基因轉錄水平幾乎檢測不到，從第3至第10莖節(jié)轉錄水平逐漸提高（圖1B）。由于第1節(jié)至第10毛果楊莖節(jié)呈現逐漸木質化發(fā)育[9]，RT-PCR擴增結果表明：在木質化程度高的莖節(jié)中Potri.006G237100基因轉錄表達水平高，且它的轉錄表達水平與莖節(jié)木質化程度同步。此外，用內參基因ACT作為半定量RT-PCR內參，結果顯示各樣品cDNA模板濃度基本相等（圖1）。

圖1　毛果楊不同組織的Potri.006G237100轉錄表達水平

2.2Potri.006G237100植物表達載體構建

以毛果楊總cDNA為模板，以Potri.006G237100基因全長基因引物進行PCR擴增，經濃度為1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到約為500 bp的片段長度（圖2A），該片段長度基本符合目的基因片段長度，確定是試驗需要的目的片段。片段膠回收后與pENTR/SD/D-TOPO載體連接，得到重組質粒pENTR/ SD/D-TOPO-Potri.006G237100（圖2A），經質粒DNA測序表明全長Potri.006G237100基因片段被插入到pENTR/SD/D-TOPO載體上。

通過LR反應將pENTR/SD/D-TOPO載體上Potri.006G237100片段同源重組到pGWB5植物表達載體上，重組質粒pGWB5-Potri.006G237100經瓊脂糖凝膠電泳檢測（圖2B）。以該質粒DNA為模板，加入Potri.006G237100基因引物，PCR擴增產物出現約500 bp特異帶，與目標基因片段大小相符（圖2B）。這表明Potri.006G237100基因已經與植物表達載體pGWB5融合。由于pGWB5載體帶有報告基因GFP，得到Potri.006G237100-GFP基因（C端融合GFP）。

2.3轉Potri.006G237100-GFP基因擬南芥鑒定

將Potri.006G237100-GFP基因遺傳轉化擬南芥，通過卡那霉素篩選得到抗卡那霉素植株5株。為了分析這5個株系是否過量表達Potri.006G237100-GFP基因，提取各株系RNA、反轉錄成cDNA，通過半定量RT-PCR鑒定Potri.006G237100基因轉錄水平。結果如圖3所示，在未轉入外源基因的野生型擬南芥中沒有擴增出目的基因帶，而在5個轉基因植株中均擴增出特異的目的帶。以擬南芥內參基因ACT作為半定量RT-PCR內標，ACT基因擴增結果顯示野生型與各轉基因株系樣品cDNA模板濃度基本相同（圖3）。PCR循環(huán)數顯示轉基因植株過量表達了目的基因，由此判斷，該基因成功轉入擬南芥及在轉基因擬南芥中呈現出高豐度的轉錄表達。

圖2　pGWB5-Potri.006G237100植物表達載體構建

圖3　轉Potri.006G237100-GFP基因擬南芥RT-PCR分析

2.4Potri.006G237100-GFP融合蛋白細胞內定位分析

已有數據顯示Potri.006G237100特異在楊樹木質化組織內表達，其功能應該參與木材（次生細胞壁）形成。鑒于此，試驗分析Potri.006G237100-GFP融合蛋白在細胞內定位。用激光共聚焦顯微鏡檢測轉基因擬南芥根中GFP熒光信號，結果顯示：信號集中在細胞質內，在周質區(qū)域也有少量信號分布（圖4）。這一結果表明，Potri.006G237100-GFP融合蛋白并沒有定位在細胞壁。

圖4　轉Potri.006G237100-GFP蛋白的細胞內定位

3　結論與討論

環(huán)化酶基因廣泛地存在于生物體，在植物中一些環(huán)化酶基因被認為參與逆境脅迫[2，5]。研究中RT-PCR數據顯示，楊樹環(huán)化酶基因Potri.006G237100在木質化組織中特異地、高豐度轉錄表達，特別是在木質部、葉柄、根中高豐度轉錄表達，相關基因在木質部高豐度表達[10]，而木質部是植物木質化程度發(fā)育最快的部位，因此推測Potri.006G237100基因可能與楊樹次生生長有關。樹木木材是次生組織生長發(fā)育形成的，次生壁形成是其中的主要特征?；谶@點，分析了該環(huán)化酶在細胞內的定位。數據顯示Potri.006G237100定位于細胞質內，卻不是定位于細胞壁，這一結果暗示這個環(huán)化酶可能不是直接參與次生壁形成的。在生物體內環(huán)化酶種類較多，其作用的底物種類可能較多，然而其參與的生理功能被了解得很少。要確定楊樹環(huán)化酶Potri.006G237100是否參與木材形成，敲除該基因、分析其突變體遺傳表型無疑是一種非常有效的方式。

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（責任編輯：夏亞男）

Gene?Expression?Pattern?and?Subcellular?Localization?of?Populus Trichocarpa?Cyclase

JIA Zhi-gang，XIA De-an，LI Shu-juan
（State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding, Northeast Forestry University, Harbin150040, PRC）

Semi-quantitative RT-PCR analysis showed that Potri.006G237100 gene transcripts are very low in cambium， young leaf and apical bud of Populus trichocarpa， but high in xylem， petiole and root. Also， high abundance of Potri.006G237100 gene transcripts was detected in lignifying stems. These data suggest that Potri.006G237100 gene is specifically and abundantly expressed in the lignifying tissues of P. trichocarpa. In addition， the DNA fragement of Potri.006G237100 gene was constructed into plant expression vector pGWB5 and transformed into Arabidopsis plant. Five transgenic plants were attained through molecular identification. Confocal laser scanning microscope analysis suggested that Potri.006G237100-GFP fusion protein is located in the cytoplasm of transgenic plants.

cyclase; tissue expression pattern; Potri.006G237100; protein localization; Populus trichocarpa

S792.11

A

1006-060X（2016）10-0001-03

2016-08-01

國家“863”計劃課題（2013AA102702）

賈志剛（1989-），男，河北衡水市人，碩士研究生，研究方向為林木遺傳育種。

李淑娟