楊晶晶+毛志敏+萬(wàn)毅剛+吳薇+黃燕如+石格+韓文貝+姚建

[摘要]探討腎康注射液（Shenkang injection，SKI）在體內(nèi)調(diào)控細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extracellular-signal regulated protein kinase，ERK）1/2/基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）信號(hào)通路而改善腎衰竭模型鼠細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）降解的作用和機(jī)制。將20只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、SKI組、馬來(lái)酸依那普利（enalapril maleate，EM）組。采用腺嘌呤灌胃聯(lián)合單側(cè)輸尿管結(jié)扎術(shù)（unilateral ureteral obstruction，UUO）建立腎衰竭模型。造模后，SKI組和EM組大鼠分別經(jīng)腹腔注射或灌胃給予SKI或EM懸濁液，其余2組大鼠經(jīng)灌胃給予蒸餾水，共3周；其間，檢測(cè)各組大鼠24 h尿蛋白排泄量（urinary protein excretion，Upro）和尿N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶（urinaryN-acety1-β-D-glucosaminidase，UNAG）；給藥3周后，處死全部大鼠，抽取血液，摘除雙腎，觀察腎組織形態(tài)特征，檢測(cè)血清生化指標(biāo)和腎組織IV型膠原（collagen type IV，CIV），MMP-2，MMP-9，金屬蛋白酶組織抑制劑（tissue inhibitors of metalloproteinase，TIMP）-1，ERK1/2以及磷酸化ERK1/2（phosphorylated-ERK1/2，p-ERK1/2）蛋白表達(dá)量。結(jié)果表明，經(jīng)SKI干預(yù)后，模型鼠血清肌酐（serum creatinine，Scr），血清尿素氮（blood urea nitrogen，BUN），尿酸（uric acid，UA），白蛋白（albumin，Alb），Upro，UNAG以及腎臟組織形態(tài)均得到不同程度的改善，這些作用與EM相仿；SKI還可以調(diào)節(jié)模型鼠腎組織MMP-2，MMP-9，TIMP-1蛋白表達(dá)，下調(diào)p-ERK1/2蛋白表達(dá)，這些作用不同于EM?？傊琒KI在體內(nèi)可能是通過(guò)調(diào)控腎組織ERK1/2信號(hào)通路活性，干預(yù)MMPs/TIMP-1表達(dá)，促進(jìn)ECM降解，延緩腎衰竭進(jìn)展。

[關(guān)鍵詞]腎康注射液； 腎衰竭； 細(xì)胞外基質(zhì)； 基質(zhì)金屬蛋白酶； 細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2信號(hào)通路

[Abstract]This study aimed to clarify preliminarily the effects and mechanisms of Shenkang injection（SKI）promoting extracellular matrix（ECM）degradation via regulating extracellular-signal regulated protein kinase（ERK）1/2/matrix metalloproteinases（MMPs）signaling pathway in renal failure rats. Twenty rats were randomly divided into 4 groups：the Sham group，the Model group，the SKI group and the Enalapril maleate（EM）group. The model rats with renal failure were induced by intragastric administration of adenine and unilateral ureteral obstruction（UUO）. After modeling， the rats in SKI group and EM group were intervened by intraperitoneal injection of SKI or intragastric administration of the EM suspension，while the rats in Sham group and Model group were administrated with distilled water respectively for 3 weeks. The 24 h urinary protein excretion（Upro）and urinaryN-acety1-β-D-glucosaminidase（UNAG）in all rats were tested after drug administration. All rats were sacrificed after drug administration for 3 weeks，blood and kidney were collected，renal morphological characteristics were observed. Furthermore，serum biochemical indices and the protein expressions of collagen type IV（CIV），MMP-2，MMP-9，tissue inhibitors of metalloproteinase（TIMP）-1，ERK1/2 and phosphorylated-ERK1/2（p-ERK1/2）in the kidney were evaluated respectively. The results indicated that，after the intervention of SKI，serum creatinine（Scr），blood urea nitrogen（BUN），uric acid（UA），albumin（Alb），Upro，UNAG and renal morphological change in model rats were improved at different levels，respectively. Moreover，these actions were similar to EM. In addition to these，SKI adjusted the protein expressions of MMP-2，MMP-9 and TIMP-1，and down-regulated the protein expressions of p-ERK1/2 in the kidney. Moreover，these actions were different from EM. In conclusion，SKI promotes ECM degradation and delays the progression of renal failure possibly through regulating ERK1/2 signaling pathway activation in the kidney and intervening MMPs/TIMP-1 expressions in vivo.

[Key words]Shenkang injection； renal failure； extracellular matrix； matrix metalloproteinases； regulating extracellular-signal regulated protein kinase1/2/matrix metalloproteinases signaling pathway

doi：10.4268/cjcmm20162016

研究表明，腎衰竭（renal failure，RF）的進(jìn)展速度與腎間質(zhì)纖維化（renal interstitial fibrosis，RIF）程度密切相關(guān)^[1-2]。RIF的病理特征主要表現(xiàn)為“腎小管萎縮、腎間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、成纖維細(xì)胞分化、增生以及細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）主要成分（膠原）在腎間質(zhì)的大量沉積”^[3]，其中，膠原沉積是ECM生成和降解失衡的直接后果，因此，促進(jìn)ECM降解，就可以減輕膠原沉積，改善RIF，延緩腎衰竭進(jìn)展。ECM降解主要依賴于機(jī)體內(nèi)降解酶系統(tǒng)的調(diào)控，其中，基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）發(fā)揮著核心作用。MMPs屬于鋅離子依賴的內(nèi)肽酶大家族，幾乎能選擇性分解所有ECM成分，其中，MMP-2主要降解I和IV型膠原，MMP-9主要降解IV型膠原^[4]。MMPs的活性和表達(dá)水平受控于金屬蛋白酶組織抑制劑（tissue inhibitors of metalloproteinases，TIMPs）^[5]，并且，與其上游的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（transforming growth factor，TGF）-β1/Smads以及細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extracellular-signal regulated protein kinase，ERK）1/2等信號(hào)通路的活性密切相關(guān)^[6-7]。因此，調(diào)控MMPs相關(guān)信號(hào)通路活性，干預(yù)MMPs/TIMPs表達(dá)等措施可以成為臨床上促進(jìn)ECM降解的有效手段。

腎康注射液（Shenkang injection，SKI）是慢性腎臟病（chronic kidney disease，CKD）治療領(lǐng)域中“補(bǔ)腎活血法”的代表性中藥復(fù)方靜脈制劑，它由“黃芪、丹參、紅花、大黃”等中藥組成，具有“益氣（腎）活血，通腑利濕，降逆泄?jié)帷钡墓π?sup>[8]。國(guó)內(nèi)的臨床和藥理研究表明，SKI可以改善慢性腎衰竭（chronic renal failure，CRF）患者和動(dòng)物模型的腎功能，其機(jī)制與調(diào)控TGF-β1/Smad3信號(hào)通路而抑制腎臟纖維化和氧化應(yīng)激損傷有關(guān)^[9-11]。筆者團(tuán)隊(duì)的前期研究表明，對(duì)于腺嘌呤灌胃聯(lián)合單側(cè)輸尿管結(jié)扎術(shù)（unilateral ureteral obstruction，UUO）而建立的腎衰竭大鼠模型，其腎功能減退、RIF病變不僅非常明顯，而且，腎組織中MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)水平降低，TIMP-1和磷酸化ERK1/2（phosphorylated-ERK1/2，p-ERK1/2）蛋白表達(dá)水平增高；經(jīng)典的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑——依那普利不僅可以改善腎功能，減輕模型鼠RIF，還能夠調(diào)節(jié)腎組織MMP-2，MMP-9，TIMP-1以及p-ERK1/2蛋白表達(dá)水平^[12-13]?；诖?，筆者進(jìn)一步推測(cè)，SKI延緩腎衰竭進(jìn)展，促進(jìn)ECM降解的作用還可能與其調(diào)控腎組織ERK1/2信號(hào)通路活性，干預(yù)MMPs/TIMP-1表達(dá)有關(guān)。

1 材料

1.1 動(dòng)物

20只8周齡左右的雄性Sprague Dawley大鼠（SPF）購(gòu)自南京軍區(qū)總院動(dòng)物中心（批號(hào)SLXK2011-02），飼養(yǎng)于南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院（簡(jiǎn)稱鼓樓醫(yī)院）動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，所有大鼠均喂予標(biāo)準(zhǔn)飼料，并自由飲水，大鼠購(gòu)回后適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.2 藥物和試劑

腺嘌呤（adenine）購(gòu)自Sigma公司，將1 g腺嘌呤溶解于50 mL牛奶中，配制成20 g·L^-1的腺嘌呤懸濁液；腎康注射液（含生藥0.3 g·mL^-1）購(gòu)自西安世紀(jì)盛康藥業(yè)有限公司（批準(zhǔn)文號(hào)Z20040110）；馬來(lái)酸依那普利（enalapril maleate，EM）購(gòu)于揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)江蘇制藥股份有限公司（批準(zhǔn)文號(hào)H32026568），將20 mg EM溶解于50 mL蒸餾水中，配置成0.4 g·L^-1的EM懸濁液。全蛋白提取試劑盒、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白濃度測(cè)定試劑盒、蛋白相對(duì)分子質(zhì)量Marker購(gòu)自凱基公司；5×蛋白上樣緩沖液購(gòu)自碧云天公司；脫脂奶粉購(gòu)自伊利公司；聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜、辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）顯色液購(gòu)自Millipore公司；小鼠抗大鼠IV型膠原（collagen type IV，CIV）單克隆抗體、小鼠抗大鼠MMP-2單克隆抗體、兔抗大鼠MMP-9單克隆抗體、兔抗大鼠TIMP-1單克隆抗體購(gòu)自Abcam公司；兔抗大鼠ERK1/2和p-ERK1/2多克隆抗體、小鼠抗大鼠甘油醛磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dihydrogenase，GAPDH）單克隆抗體以及HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG和山羊抗小鼠IgG抗體購(gòu)自Bioworld公司。

2 方法

2.1 模型制作方法

采用腺嘌呤灌胃聯(lián)合UUO的方法建立大鼠腎衰竭模型。在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始的第1～14天進(jìn)行腺嘌呤（150 mg·kg^-1）灌胃；第15天，行左側(cè)輸尿管結(jié)扎手術(shù)。腹腔注射氯胺酮和地西泮等體積混合液（3 mg·kg^-1），麻醉后，將大鼠固定于手術(shù)板上，取仰臥位，常規(guī)消毒，左腹部切口1～1.5 cm，逐層切開(kāi)皮膚、肌肉，暴露左腎，鈍性分離腎周脂肪，沿腎門部位尋找輸尿管，在輸尿管上、下段結(jié)扎，并于中間處剪斷；分層縫合切口，予每只大鼠青霉素鈉（20萬(wàn)U）腹腔注射，連續(xù)3 d。假手術(shù)組大鼠在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始的第1～14天進(jìn)行蒸餾水灌胃。第15天，手術(shù)時(shí)僅暴露左側(cè)輸尿管，縫合切口。

2.2 分組、給藥方法

將20只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表分為4組：假手術(shù)組（蒸餾水灌胃）、模型組（蒸餾水灌胃）、SKI組（SKI腹腔注射）、EM組（EM懸濁液灌胃）各5只。體重60 kg患者的SKI臨床治療量為每天100 mL（相當(dāng)于生藥30 g），按動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)換算公式，大鼠的有效量相當(dāng)于每天5 g·kg^-1。EM的臨床治療量為每天20 mg，按動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)換算公式，大鼠的有效量相當(dāng)于每天0.02 g·kg^-1。SKI組大鼠及EM組于術(shù)后第2天開(kāi)始藥物干預(yù)，假手術(shù)組和模型組大鼠同時(shí)給予蒸餾水2 mL灌胃，每日1次，連續(xù)3周。各組大鼠自給藥開(kāi)始計(jì)時(shí)，第3周末，經(jīng)腹腔注射氯胺酮麻醉，心臟穿刺處死，采集血液樣本和腎組織而進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)的檢測(cè)。

2.3 觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

2.3.1 尿生化指標(biāo) 藥物干預(yù)后第3周末，分別將各組大鼠放入金屬代謝籠，禁食，自由飲水，收集24 h尿液，倍比稀釋后，采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定24 h尿蛋白排泄量（urinary protein excretion，Upro）。另外，采用比色法檢測(cè)尿N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶（urinaryN-acety1-β-D-glucosaminidase，UNAG）。在37 ℃環(huán)境和適當(dāng)?shù)膒H條件下，UNAG水解2-氯-4-硝基苯基-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷（2-chloro-4-nitrophenyl-N-acety1-β-D-glucosaminidase，CNP-NAG）的糖苷鍵和2-氯-4-硝基苯基-β-D-半乳糖苷（2-chloro-4-nitrophenyl-β-D-galactosidase，CNP-GAL）的糖苷鍵，游離出2-氯-4-硝基苯基（2-chloro-4-nitrophenyl，CNP）。在400～415 nm波長(zhǎng)下，觀察釋放出的CNP所引起的吸光度變化。將1 L尿液中NAG在每分鐘內(nèi)水解CNP-NAG所產(chǎn)生1 μmol的CNP作為1個(gè)酶單位活力，簡(jiǎn)稱為U·L^-1。

2.3.2 血清生化指標(biāo) 藥物干預(yù)3周后，在氯胺酮麻醉狀態(tài)下解剖大鼠胸腔，經(jīng)心臟采血。采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)大鼠血清生化指標(biāo)，包括血清肌酐（serum creatinine，Scr）、血清尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、尿酸（uric acid，UA）和白蛋白（albumin，Alb）等。

2.3.3 腎臟組織形態(tài)特征 解剖大鼠腹腔，自腎門處摘取兩側(cè)腎臟，腎臟摘除后，分離皮髓質(zhì)，并取少量腎皮質(zhì)（腎臟的上極或下極）固定于10%中性甲醛內(nèi)，經(jīng)脫水16 h后，石蠟包埋，切片3 μm，進(jìn)行過(guò)碘酸雪夫（periodic acid schiff，PAS）染色和Masson染色；借助光學(xué)顯微鏡（光鏡），觀察腎間質(zhì)ECM及膠原沉積程度；每張切片隨機(jī)選取20個(gè)腎小球，采用病理圖像分析系統(tǒng)Image-pro plus（IPP）計(jì)算腎間質(zhì)ECM和膠原相對(duì)面積（ECM 或膠原面積/腎間質(zhì)面積）。

2.3.4 腎組織CIV，MMP-2，MMP-9，TIMP-1，ERK1/2，p-ERK1/2蛋白表達(dá) 采用Western blot檢測(cè)腎組織CIV，MMP-2，MMP-9，TIMP-1，ERK1/2，p-ERK1/2蛋白表達(dá)水平。從-80 ℃冰箱中取出100 mg腎組織，用剪刀剪碎；用PBS沖洗腎組織，放入4 ℃離心機(jī)，3 000 r·min^-1離心5 min，反復(fù)沖洗，再離心，共3次；棄去PBS沖洗液，向腎組織中加入含蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑和苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）的總蛋白裂解液，用電動(dòng)勻漿機(jī)勻漿，在冰上放置30 min，每隔3 min震蕩1次，最后，再次放入4 ℃離心機(jī)，12 000 r·min^-1離心30 min，取上清液（即總蛋白），少量用于BCA法測(cè)定蛋白濃度，其余按4∶1與蛋白上樣緩沖液混勻，在沸水中煮10 min進(jìn)行蛋白變性，于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。提取總蛋白后，配制分離膠和濃縮膠，分別加樣，在電泳槽中加滿電泳緩沖液進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，PAGE-SDS）。電泳完畢，取下凝膠，根據(jù)目的蛋白的位置留取相應(yīng)凝膠，并將凝膠上的蛋白電轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，用含10%脫脂奶粉的Tris buffered saline tween（TBST）緩沖液[20 mmol·L^-1 Tris HCl，150 mmol·L^-1 NaCl，0.05%聚環(huán)氧乙烷山梨糖醇單月桂酸酯（tween 20）]封閉2 h。分別向PVDF膜中加入相應(yīng)的一抗（CIV，MMP-2，MMP-9，TIMP-1，ERK1/2，p-ERK1/2，GAPDH），室溫孵育4 h，用TBST緩沖液洗滌約1 h。分別加入二抗（HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體），室溫孵育2 h，再次用TBST緩沖液洗滌約1 h。取出PVDF膜，將HRP顯色液均勻地涂在PVDF膜上，在暗室曝光，定影。用Quantity one 4.1.1軟件進(jìn)行光密度分析，結(jié)果分別與GAPDH光密度相對(duì)照，其比值表示蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用±s表示。組間比較在進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)后采用單因素方差分析，P<0.05 或P<0.01 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（有顯著性或非常顯著性）。采用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

3 結(jié)果

3.1 SKI對(duì)模型鼠血清生化指標(biāo)的影響

假手術(shù)組大鼠Scr，BUN，UA始終保持在較低水平，而模型組大鼠在手術(shù)前（第2周末）及處死前（第5周末）顯著升高，與假手術(shù)組大鼠比較，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01或P<0.05）；經(jīng)SKI或EM干預(yù)3周后（第5周末），模型鼠Scr，BUN，UA出現(xiàn)下降，與模型組大鼠比較，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；在第5周末，模型組大鼠Alb有所下降，與假手術(shù)組大鼠比較，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；經(jīng)SKI或EM干預(yù)后，模型鼠Alb有所上升，與模型組大鼠比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（圖1）。該結(jié)果說(shuō)明，SKI能夠改善腎衰竭模型鼠Scr，BUN，UA，Alb，其效果與EM相仿。

3.2 SKI對(duì)模型鼠尿蛋白的影響

假手術(shù)組大鼠Upro，UNAG始終保持在較低水平，而模型組大鼠在手術(shù)前（第2周末）及處死前（第5周末）顯著升高，與假手術(shù)組大鼠比較，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；經(jīng)SKI或EM干預(yù)3周后，模型鼠Upro，UNAG出現(xiàn)下降，與模型組大鼠比較，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01或P<0.05）（圖2）。該結(jié)果說(shuō)明，SKI能夠減少腎衰竭模型鼠尿蛋白，其效果與EM相仿。

3.3 SKI對(duì)模型鼠腎臟組織形態(tài)和CIV蛋白表達(dá)的影響

經(jīng)光鏡觀察，造模后第3周末，假手術(shù)組大鼠腎小球毛細(xì)血管襻開(kāi)放良好，腎小管上皮細(xì)胞排列整齊，未見(jiàn)腎間質(zhì)ECM增寬、膠原沉積和明顯的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)（圖3 A，E）；模型組大鼠腎小管上皮細(xì)胞排列紊亂，腎小管萎縮、塌陷，大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，腎間質(zhì)內(nèi)ECM及膠原相對(duì)面積增多（圖3 B，F(xiàn)），與假手術(shù)組大鼠比較，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。經(jīng)SKI或EM干預(yù)后，腎小管上皮細(xì)胞排列比較整齊，腎小管萎縮、塌陷以及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)有所改善，腎間質(zhì)ECM及膠原相對(duì)面積明顯減少（圖3 C，G），與假手術(shù)組比較1）P<0.05，2）P<0.01；與模型組比較3）P<0.05，4）P<0.01（圖2同）。

與模型組大鼠比較，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。SKI組大鼠膠原相對(duì)面積明顯減少，與EM

組大鼠比較，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。此外，模型組大鼠腎組織CIV蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)，與假手術(shù)組大鼠比較，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。經(jīng)SKI或EM干預(yù)后，CIV蛋白表達(dá)水平有所下調(diào)，與模型組大鼠比較，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）。但是，EM組大鼠CIV蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)，與SKI組大鼠比較，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（圖3）。該結(jié)果說(shuō)明，SKI可以改善腎衰竭模型鼠腎間質(zhì)ECM、膠原相對(duì)面積以及CIV蛋白表達(dá)，其效果與EM相仿；但是，對(duì)于CIV蛋白表達(dá)，EM的改善作用優(yōu)于SKI。

3.4 SKI對(duì)模型鼠腎組織MMP-2，MMP-9，TIMP-1蛋白表達(dá)的影響

在造模后第3周末，模型組大鼠腎組織MMP-2，MMP-9蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)，與假手術(shù)組大鼠比較，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）；經(jīng)SKI或EM干預(yù)后，MMP-2，MMP-9蛋白表達(dá)水平有所上調(diào)，與模型組大鼠比較，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）；此外，模型組大鼠腎組織TIMP-1蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)，與假手術(shù)組大鼠比較，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；經(jīng)SKI或EM干預(yù)后，TIMP-1蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)，與模型組大鼠比較，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；SKI組大鼠TIMP-1蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)，與EM組大鼠比較，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（圖4）。該結(jié)果說(shuō)明，SKI能夠調(diào)節(jié)腎衰竭模型鼠腎組織MMP-2，MMP-9，TIMP-1蛋白表達(dá)；對(duì)于TIMP-1蛋白表達(dá)的改善作用，SKI優(yōu)于EM。

3.5 SKI對(duì)模型鼠腎組織ERK1/2，p-ERK1/2蛋白表達(dá)的影響

在造模后第3周末，模型組大鼠腎組織p-ERK1/2蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)，與假手術(shù)組大鼠比較，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；經(jīng)SKI干預(yù)后，p-ERK1/2蛋白表達(dá)水平有所下調(diào)，與模型組大鼠比較，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；經(jīng)EM干預(yù)后，p-ERK1/2蛋白表達(dá)水平亦有所下調(diào)，與模型組大鼠比較，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；SKI組大鼠p-ERK1/2蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)，但是，與EM組大鼠比較，其差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖5）。該結(jié)果表明，SKI能夠下調(diào)模型鼠腎組織p-ERK1/2蛋白表達(dá)，其改善作用不同于EM，其變化趨勢(shì)優(yōu)于EM。

4 討論

腎衰竭是CKD發(fā)展至終末期腎病的最終轉(zhuǎn)歸^[14]。無(wú)論何種病因，在腎衰竭進(jìn)展過(guò)程中RIF是其共同的病理基礎(chǔ)之一，而RIF的病理形態(tài)學(xué)特征與中醫(yī)學(xué)經(jīng)典概念——“癥積（腎積）”極為相似^[15]?；趪?guó)醫(yī)大師張大寧的學(xué)術(shù)思想，筆者認(rèn)為，腎衰竭屬于中醫(yī)學(xué)“虛勞（腎勞）”范疇，“勞”為“積”之盛，“積”為“勞”之漸?！胺e”之在腎，源于腎氣不足，行血無(wú)力，絡(luò)脈（腎臟微小血管）不暢，血瘀成積，釀生邪毒（濁毒或溺毒），毒損臟腑。這可能就是腎勞患者“因虛致瘀，因瘀致毒，因毒致勞”的病機(jī)演變規(guī)律。最為重要的是，這一“由積致勞”的病機(jī)假說(shuō)與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)有關(guān)腎衰竭患者腎臟濾過(guò)功能減退而致氮質(zhì)代謝產(chǎn)物、毒性中分子物質(zhì)潴留的認(rèn)識(shí)是一致的。因此，臨床上治療腎衰竭的原則當(dāng)為“補(bǔ)虛、化瘀、解毒、防勞”，其中，“補(bǔ)腎活血”是基本的治法，而且，必須貫穿治療始終。SKI由4味中藥組成，其中，黃芪益氣補(bǔ)腎，丹參、紅花活血化瘀，大黃泄?jié)峤舛荆焦沧唷把a(bǔ)腎活血，泄?jié)峤舛尽敝?。在本研究中，?duì)于腎衰竭動(dòng)物模型，在“補(bǔ)腎活血法”代表性中藥復(fù)方靜脈制劑——SKI干預(yù)后，其Scr，BUN等代表腎小球?yàn)V過(guò)功能的指標(biāo)的確得到明顯改善，而且，其改善作用與EM相仿。這個(gè)結(jié)果提示，“補(bǔ)腎活血法”改善腎衰竭模型鼠腎功能的效果是肯定的。

為了闡明“補(bǔ)腎活血法”代表性中藥SKI對(duì)腎積的改善作用，必須在腎衰竭動(dòng)物模型中模擬出人類RIF的病理特征。筆者發(fā)現(xiàn)，模型鼠不但出現(xiàn)腎功能減退，而且，腎小管上皮細(xì)胞排列紊亂，腎小管萎縮、塌陷，大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，腎間質(zhì)ECM及膠原相對(duì)面積增多，腎組織CIV蛋白表達(dá)水平上調(diào)。這個(gè)結(jié)果提示，腺嘌呤灌胃聯(lián)合UUO誘導(dǎo)的腎衰竭模型鼠不但初步具備人類RIF的病理特征，還表現(xiàn)出腎勞患者“虛、瘀、毒”的中醫(yī)病理因素。在本研究中，筆者發(fā)現(xiàn)，經(jīng)SKI干預(yù)后，模型鼠腎小管上皮細(xì)胞排列比較整齊，腎小管萎縮、塌陷以及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)有所改善，腎間質(zhì)ECM及膠原相對(duì)面積明顯減少，CIV蛋白表達(dá)水平有所下調(diào)。這個(gè)結(jié)果提示，“補(bǔ)腎活血法”改善腎衰竭模型鼠RIF的效果也是肯定的。王清任在《醫(yī)林改錯(cuò)》中曾有相關(guān)論述：“元?dú)饧忍摚夭荒苓_(dá)于血管，血管元?dú)獗赝Ａ舳觥?。筆者認(rèn)為，這可能就是“補(bǔ)腎活血法”治療腎積的中醫(yī)理論基礎(chǔ)。

研究表明，ECM降解與MMPs的表達(dá)和活性密切相關(guān)^[4]。對(duì)于腎臟而言，MMPs家族在腎間質(zhì)/小管表達(dá)的成員是MMP-2，3，7，9，14，24等，其中，MMP-2和MMP-9的作用主要是降解IV型膠原^[5]。在本研究中，腎衰竭模型鼠腎組織MMP-2，MMP-9蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)；經(jīng)SKI干預(yù)后，模型鼠腎組織MMP-2，MMP-9蛋白表達(dá)明顯改善。這個(gè)結(jié)果提示，SKI能夠調(diào)節(jié)腎衰竭模型鼠腎組織MMPs表達(dá)而促進(jìn)ECM降解。此外，MMPs特異性抑制物——TIMPs也會(huì)直接影響ECM降解^[16]。在腎組織中，抑制MMPs活性的TIMPs主要是TIMP-1和TIMP-2，其中，TIMP-1能抑制MMP-9活性^[17]。在本研究中，腎衰竭模型鼠腎組織TIMP-1蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)；經(jīng)SKI干預(yù)后，模型鼠腎組織TIMP-1蛋白表達(dá)明顯改善。這個(gè)結(jié)果提示，“補(bǔ)腎活血法”的代表性藥物——SKI能夠調(diào)節(jié)腎衰竭模型鼠腎組織MMPs/TIMP-1表達(dá)而促進(jìn)ECM降解，其中，對(duì)于TIMP-1蛋白表達(dá)的改善作用，SKI優(yōu)于EM。

ERK1/2信號(hào)通路是調(diào)控MMPs表達(dá)和活性的重要通路之一^[7]。對(duì)于脂多糖誘導(dǎo)的心肌纖維化模型，紅花提取物可以促進(jìn)心臟ECM降解，其作用是通過(guò)調(diào)控MMPs/ERK1/2信號(hào)通路而實(shí)現(xiàn)的^[18]。Zhang等觀察了UUO模型鼠中腎組織TGF-β1和ERK1/2蛋白表達(dá)特征，結(jié)果顯示，TGF-β1和ERK1/2蛋白表達(dá)水平與腎臟纖維化程度密切相關(guān)^[19]。在本研究中，筆者發(fā)現(xiàn)，隨著腎衰竭模型鼠RIF的加重，其腎組織p-ERK1/2蛋白表達(dá)水平明顯增加，ERK1/2信號(hào)通路活化；與EM不同的是，SKI能夠明顯下調(diào)模型鼠腎組織內(nèi)p-ERK1/2蛋白表達(dá)水平，抑制ERK1/2信號(hào)通路活性。然而，在筆者團(tuán)隊(duì)的既往研究中，對(duì)于同樣的腎衰竭動(dòng)物模型，EM是通過(guò)經(jīng)典的TGF-β1/Smads信號(hào)通路而影響ECM合成和降解的^[12]。這個(gè)結(jié)果提示，雖然“補(bǔ)腎活血法”的中藥復(fù)方制劑與血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑都能促進(jìn)ECM降解，但是，其靶點(diǎn)和途徑可能是不同的。

總之，對(duì)于腺嘌呤灌胃聯(lián)合UUO誘導(dǎo)的腎衰竭動(dòng)物模型，SKI能夠改善模型鼠的腎功能和RIF，其效果與EM相仿；與EM不同的是，SKI可能是通過(guò)調(diào)控腎組織ERK1/2信號(hào)通路活性，干預(yù)MMPs/TIMP-1表達(dá)，促進(jìn)ECM降解，延緩腎衰竭進(jìn)展。在本研究中，筆者只是發(fā)現(xiàn)SKI的作用和機(jī)制與ERK1/2/MMPs信號(hào)通路有關(guān)，盡管如此，還有很多問(wèn)題在活體模型中是無(wú)法得到明確答案的。

[致謝]本課題得到南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院檢驗(yàn)科羅潯陽(yáng)副主任技師和科技處張樂(lè)助理研究員的幫助和指導(dǎo)。

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[責(zé)任編輯 馬超一]