劉旭輝　劉螢　張姍

[摘 要] 對奶粉中牛磺酸的前處理方法、流動相比例和柱溫箱溫度對氨基酸分析儀測定奶粉中?；撬岬挠绊戇M行研究。結(jié)果表明，乙醇沉淀蛋白法能夠更好地提取奶粉中?；撬?；柱溫25℃的條件下，用75%pH4.20檸檬酸鋰緩沖液B和25%pH8.00檸檬酸鋰緩沖液C作為流動相進行梯度洗脫提取?；撬幔瑸榘被岱治鰞x測定奶粉中?；撬彷^優(yōu)條件。建立的氨基酸分析儀測定方法，該方法的相對標準偏差為0.62%，回收率為99.6%～101.5%，準確而靈敏，適合嬰幼兒配方奶粉中?；撬岬姆治?。

[關鍵詞] ?；撬幔话被岱治鰞x；分離度

中圖分類號：O657 文獻標識碼：A 文章編號：2095-5200（2016）05-092-03

DOI：10.11876/mimt201605034

?；撬幔═aurine）是一種含硫的β-氨基乙磺酸[1]。作為生理營養(yǎng)的活性物質(zhì)，對人體起著十分重要的生理調(diào)節(jié)作用[2]，尤其在促進嬰幼兒大腦和中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育，增強心血管功能以及鈣吸收等方面作用突出[3]，是嬰幼兒食品重要的營養(yǎng)添加劑。

目前測定?；撬岬闹饕椒ㄓ蟹止夤舛确╗4-5]、熒光吸光光度法[6]、高效液相色譜法[7-9]、衍生化高效液相色譜法[10]、自動電位滴定法[11]、傅立葉變換紅外線光譜法[12]等，這些方法操作煩瑣，操作要求高，比如液相色譜法儀器投入大，分析時間長；柱前衍生法靈敏度高，但操作條件要求高，干擾比較大；分光光度法樣品必須通過離子交換柱純化后才能測定?，F(xiàn)有的國家標準GB 5413.26-2010[13]《嬰幼兒食品和乳品中牛磺酸的測定》采用的是高效液相色譜法，其中OPA柱后衍生和單磺酰氯柱前衍生法都需要復雜的衍生步驟。

本研究建立了嬰幼兒奶粉中?；撬釡y定的氨基酸分析儀測定方法，樣品經(jīng)乙醇沉淀蛋白進行提取，前處理簡單，快速，可用于嬰幼兒奶粉中?；撬岬目焖俣ㄐ远繖z測，為保證嬰幼兒乳品安全提供了技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 樣品

嬰幼兒配方奶粉：市售，購于北京京客隆超市。

S-433D型氨基酸分析儀：德國Sykam公司，配有帶電子制冷功能的溶液存放單元s7130，帶電子恒溫的自動進樣器s5200，含雙波長檢測器的反應單元s4300，內(nèi)置在線真空脫氣機的四元梯度輸液單元；s21003K15型離心機，德國Sigma公司；N-EVAP 116型氮吹儀，美國Organomation 公司；天平：感量為 0.1mg，德國Sartorius公司。

1.2 試劑和耗材

緩沖液A： pH 2.90檸檬酸鋰緩沖液；緩沖液B： pH4.20檸檬酸鋰緩沖液；緩沖液C： pH8.00檸檬酸鋰緩沖液；再生液D： 檸檬酸鋰緩沖液；樣品稀釋液：pH 2.20檸檬酸鋰緩沖液、茚三酮溶液均購于北京捷盛依科科技發(fā)展有限公司。濃鹽酸、無水乙醇、磺基水楊酸固體、異丙醇、甲醇均購于北京中科三環(huán)有限公司。異丙醇和甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。玻璃帶塞水解管購于北京捷盛依科科技發(fā)展有限公司。

1.3 奶粉前處理方法

1.3.1 酸水解法 稱取一定量樣品，精確到0.0001g，（使樣品蛋白質(zhì)含量在10～20mg范圍內(nèi)）放于水解管內(nèi)。水解管加6mol/L鹽酸10mL，使奶粉全部溶解，搖勻。氮吹10～20s后，立即蓋緊瓶蓋。于110℃恒溫干燥箱內(nèi)放置水解22h，取出后漩渦振搖，冷卻后，在6000轉(zhuǎn)/min條件下離心5min。取上清液0.5mL，氮吹至完全干燥，加2mL樣品稀釋液復溶，經(jīng)0.45μm微孔膜過濾，供儀器測定使用。

1.3.2 蛋白沉淀法 稱取樣品約1.0000g，用0.2%鹽酸溶解樣品，并定容到10mL，使奶粉全部溶解。取2mL溶解后的試樣于10mL容量瓶中，加入無水乙醇（或磺基水楊酸）定容至刻度，靜置30min，取樣液約2mL放在2mL離心管中，在10000轉(zhuǎn)/min條件下離心5min。取上清液1mL，氮吹至完全干燥，加1mL樣品稀釋液復溶，經(jīng)0.45μm微孔膜過濾，供儀器測定使用。

1.4 氨基酸儀測定條件

色譜柱：Sykam LCA K 07/Li，150×4.6mm，LCA K

05/Li，100×4.6mm。流動相：75%緩沖液B和25%緩沖液C。流速：0.4mL/min。柱溫：25℃。進樣量：50μL。衍生試劑：茚三酮試劑，流速0.25mL/min。沖洗柱子試劑：再生液D，流速0.4mL/min。牛磺酸最大吸收波長在570nm處。

通過改變洗脫條件和柱溫箱溫度測試?；撬岬姆蛛x度。

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理方法的選擇

用鹽酸水解法對樣品進行測試，有雜質(zhì)峰干擾，分離度較??；已有采用鹽酸水解法提取食品中牛磺酸的報道[14]，但在本文的研究中，此方法不適用于奶粉樣品的提取。溶解后的樣品加入磺基水楊酸沉淀蛋白，蛋白質(zhì)并不能被完全沉淀，呈絮狀；溶解后的樣品加入乙醇沉淀蛋白后，取出再加入磺基水楊酸進一步沉淀蛋白（乙醇和磺基水楊酸沉淀蛋白法），?；撬岱迮c雜質(zhì)峰不能很好分離；溶解后的樣品加入磺基水楊酸沉淀蛋白后，取出再加入乙醇進一步沉淀蛋白（磺基水楊酸和乙醇沉淀蛋白法），使得牛磺酸峰與雜質(zhì)峰分離度有所提高；而用乙醇沉淀蛋白法提取?；撬幔蛛x度可達1.24，能夠完全滿足定量分析的需要。對樣品進行回收測試，各前處理方法的回收率在80%～120%允許的區(qū)間范圍內(nèi)。表1為不同前處理方法對測定結(jié)果的影響，圖1為不同前處理方法測定?；撬嵘V圖。

不同的前處理方法對回收率沒有太大影響。蛋白質(zhì)為兩性物質(zhì)，在酸性環(huán)境中帶正電荷，而磺基水楊酸根帶負電，可與蛋白質(zhì)結(jié)合沉淀，磺基水楊酸正好使液體呈酸性，促使二者結(jié)合，但磺基水楊酸沉淀效果不理想，多用于沉淀微量蛋白；而乙醇沉淀蛋白法，則是利用乙醇有機相能破壞蛋白質(zhì)顆粒的水化膜，導致蛋白變性而沉淀，效果比較理想。

2.2 流動相比例的選擇

通過改變洗脫條件進行比較，選用100%緩沖液A進行洗脫，雜質(zhì)峰與?；撬岱宸蛛x度小于1；選用100%緩沖液B進行洗脫，雜質(zhì)峰與牛磺酸峰分離度最高達到1.07；選用80%緩沖液B和20%緩沖液C進行梯度洗脫，雜質(zhì)峰與?；撬岱宸蛛x度最高達到1.17，分離均不理想；選用75%緩沖液B和25%緩沖液C進行梯度洗脫，雜質(zhì)峰與?；撬岱宸蛛x度最高可達到1.24，分離度達到理想值。對樣品進行回收測試，回收率在80%～120%允許的區(qū)間范圍內(nèi)，不同流動相洗脫比例對回收率沒有影響。

緩沖液A液pH為2.90，緩沖液B液pH為4.20，緩沖液C液pH為8.00，由此可得出，用pH比A液偏中性的75%緩沖液B和偏堿性25%緩沖液C一起洗脫，?；撬岱迮c雜質(zhì)峰分離度達到最好。前處理過程中，氮吹至干后，復溶液選用中性的水比選用酸性的樣品稀釋液作為復溶液更好。表2為不同流動相對測定結(jié)果的影響，圖2為不同流動相洗脫后色譜圖。

2.3 柱溫箱溫度的選擇

柱溫箱溫度調(diào)節(jié)為37℃時，用100%緩沖液A進行洗脫，有雜質(zhì)峰干擾，分離度較??；溫度調(diào)節(jié)為60℃時，用100%緩沖液A進行洗脫，牛磺酸與雜質(zhì)峰不分離；溫度為37℃時，用75%緩沖液B和25%緩沖液C進行梯度洗脫，有雜質(zhì)峰干擾，分離度不理想；而柱溫箱溫度為25℃時，用75%緩沖液B和25%緩沖液C進行梯度洗脫，分離度可達1.24；對樣品進行回收測試，回收率在80%～120%允許的區(qū)間范圍內(nèi)，不同柱溫對樣品進行測定對回收率沒有影響。

通過改變柱溫箱溫度，得出溫度變化對?；撬岢龇鍟r間影響不大，而對于雜質(zhì)峰，溫度低出峰時間前移，可與?；撬岱宸蛛x，實驗得出溫度在25℃時分離效果最好。表3為柱溫箱柱溫改變對分離度的影響，圖3為柱溫改變后的色譜圖。

2.4 線性范圍與檢出線

精確吸取?；撬針藴嗜芤?.2mL、0.5mL、1mL、1.5mL、2.5mL分別加入到10mL容量瓶中，用水定容，進行分析。以響應（峰面積）為Y，濃度為X，繪制線形圖。線形方程： Y=287572.52339×X+104.14317。相關系數(shù)R2=0.9999910。

2.5 精密度

儀器精密度：配置?；撬針藴嗜芤?0mg/L，重復測定，計算峰面積的RSD（n=6）為0.39%。

實驗方法精密度：取一定量奶粉樣品，按乙醇沉淀蛋白法測試?；撬岷?，重復測定，其測定結(jié)果的RSD（n=6）為0.50%。

2.6 加標回收率

取奶粉樣品按照乙醇沉淀蛋白法進行牛磺酸含量的測試，再在樣品中加入牛磺酸標準品進行測定，測試其回收率，回收率為99.6%～101.5%。

3 結(jié)論與討論

?；撬峥膳c茚三酮試劑反應，利用氨基酸自動分析儀檢測出其含量。通過改變前處理過程、改變儀器洗脫條件和柱溫箱的溫度，得出儀器洗脫梯度用比緩沖液A液偏中性的75%緩沖液B+25%緩沖液C作為流動相進行洗脫，溫度在25℃時，?；撬岬姆蛛x提取最好。

本文建立的乙醇沉淀蛋白用氨基酸分析儀檢測方法，適用于嬰幼兒配方粉中?；撬岬亩ㄐ远繖z測。結(jié)果表明本方法前處理簡單、分析速度快、準確度和靈敏度較高，可作為嬰幼兒配方粉監(jiān)測手段，為保證我國嬰幼兒乳制品的安全提供技術(shù)保障。

參 考 文 獻

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