孫寶剛 王麗霞 曹井賀 張 寧 粱魯南 楊愛軍

濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院（山東濟(jì)寧 272000）

男性年齡對精子質(zhì)量與精子染色體影響的研究*

孫寶剛 王麗霞 曹井賀 張 寧 粱魯南 楊愛軍

濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院（山東濟(jì)寧 272000）

目的 探討男性年齡對精子質(zhì)量與精子染色體的影響。方法 選擇男性精液標(biāo)本120例，按照男方年齡分為3組：＜35歲組（n=42）、35歲～組（n=40）和≥40歲組（n=38）。對其進(jìn)行精液分析以及精子DNA損傷檢測，并應(yīng)用18， X，Y號染色體探針通過熒光原位雜交（FISH）技術(shù)對＜35歲組、35歲～組和≥40歲組進(jìn)行精子非整倍體檢測。結(jié)果 3組精液量［（5.25±2.05）mL vs（5.05±2.26）mL vs（5.09±3.67）mL］、精子濃度［（28.21±3.08）×106/ mL vs（26.21±3.73）×106/mL vs（23.85±5.56）×106/mL ］和前向運(yùn)動精子率［（30.05±9.34）% vs（28.30±8.04）% vs（26.30±5.08）%］差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。＜35歲組與35歲～組的正常形態(tài)率［（7.20±2.30）% vs（6.56±3.20）%］和DNA碎片率［（14.69±3.69）% vs（16.12±4.52）%］以及精子非整倍體率［（2.71±0.56）% vs（3.45±0.65）%］相比，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）?！?0歲組的正常形態(tài)率（4.68±2.89）%低于＜35歲組（7.20±2.30）%和35歲～組（6.56±3.20）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；≥40歲組的DNA碎片率（24.86±7.85）%、精子非整倍體率（6.56±0.70）%均高于＜35歲組和35歲～組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論 男性年齡增加可能導(dǎo)致精子正常形態(tài)率降低，精子DNA損傷率和精子非整倍體率增加，在生育過程中，男性年齡應(yīng)引起關(guān)注。

年齡因素； 原位雜交， 熒光； 精子； 染色體； DNA損傷

據(jù)統(tǒng)計(jì)，近20%的夫婦患有不孕癥，隨著全面二胎的放開，更多高齡的夫婦加入生育的行列。母親年齡對卵子染色體不利影響已是共識［1］，但是父親年齡對精子質(zhì)量、精子非整倍體率的重要性研究甚少。本文擬對男性年齡對精子質(zhì)量與精子染色體影響的研究進(jìn)行報道。

資料和方法

一、研究對象

對象選擇2015年1月至2016年2月在濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院生殖中心就診的男性患者120例，不同年齡男性患者均無煙酒嗜好、無遺傳性疾病、無傳染性疾病，無接觸X射線及無氰化物 、苯類 、二氧化硫等有毒物接觸史和接受放、化療患者。按照男方年齡分為3組：＜35歲組（n=42）、35歲～組（n=40）和≥40歲組（n=38）。

二、研究方法

1. 計(jì)算機(jī)輔助精子分析（CASA）：采用計(jì)算機(jī)輔助精子分析儀（西班牙， SCA）檢測精子密度、總數(shù)、各級運(yùn)動精子百分率和數(shù)量等。

2. 精子形態(tài)學(xué)分析（Diff-Quik法）：檢測精子形態(tài)正常率=畸形精子數(shù)/計(jì)數(shù)精子總數(shù)×100%

3. 精子DNA 碎片率：采用深圳市博銳德生物科技有限公司產(chǎn)品試劑盒檢測精子DNA 碎片率。

4. 精子熒光原位雜交（FISH）：應(yīng)用北京金菩嘉公司的X、Y與18號染色體采用精子熒光原位雜交（FISH）技術(shù)熒光顯微鏡觀察。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 16. 0對以上數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。均值比較采用多個樣本比較的Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)，相關(guān)分析采用Spearman相關(guān)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、各年齡組患者精液質(zhì)量比較

各年齡組患者的精液量、精子濃度、前向運(yùn)動（PR）精子率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。＜35歲組與35歲～組的正常形態(tài)率［（7.20±2.30）% vs（6.56±3.20）%］和DNA碎片率［（14.69±3.69）% vs（16.12±4.52）%］，兩組相比，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。正常形態(tài)率≥40歲組低于＜35歲組和35歲～組，DNA碎片率≥40歲組高于＜35歲組和35歲～組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0. 05），見表1。

表1　各年齡組患者精子質(zhì)量比較

二、精子染色體非整倍體率分析結(jié)果

本研究3組共計(jì)精子22 622個，其中非整倍體精子944個（異常18， X， Y染色體之和）。＜35歲組的非整倍體率低于35歲～組，兩組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；≥40歲組的精子非整倍體率高于＜35歲組和35歲～組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2　各年齡組患者精子非整倍體率分析結(jié)果比較

討 論

隨著生育年齡的推遲以及全面二胎政策的放開，逐漸有越來越多高齡夫妻步入孕育新生命的行列。近年來，男性年齡對生育和子代的影響越來越受到關(guān)注。相對于女性，男性生育力可維持的時間較長，但隨著年齡的增加以及不良的生活習(xí)慣、工作環(huán)境，男性生育功能也會逐漸減退。為了研究男性年齡對精子質(zhì)量以及精子功能的影響，我們對＜35歲組、35歲～組和≥40歲組進(jìn)行精液常規(guī)染色體精子以及DNA碎片率檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：3組精液量、精子濃度、前向運(yùn)動精子率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，＜35歲組與35歲～組的正常形態(tài)率、DNA碎片率以及精子非整體率相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。≥40歲組的正常形態(tài)率低于＜35歲組和35歲～組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；≥40歲組的DNA碎片率高于＜35歲組和35歲～組，差異也具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這與Vagnini等［1］和孫靜波等［2］研究相似。由此發(fā)現(xiàn)：隨著男性年齡增大，精子畸形率、DNA 碎片率隨之升高，增加了在精卵結(jié)合及胚胎發(fā)生當(dāng)中染色體異常和基因缺陷的可能性，從而提高了胚胎停育、早產(chǎn)及出生缺陷發(fā)生的風(fēng)險。

精子染色體非整倍體即精子染色體數(shù)目異常，大多數(shù)研究顯示［3，4］，染色體的非整倍體率增加是導(dǎo)致不孕不育、自然流產(chǎn)率升高和分娩率下降的主要原因。近年來，熒光原位雜交技術(shù)迅速發(fā)展，可以直接檢測精子以及胚胎間期核的染色體組成［5-8］，一次可以分析大量精子，而且精子熒光信號直觀，結(jié)果的敏感性、特異性和準(zhǔn)確性等強(qiáng) ，非常適合于精子染色體異常的研究。因此，我們實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)采用18， X，Y探針應(yīng)用三色FISH技術(shù)分析 ＜35歲組、35歲～組和≥40歲組的共計(jì)22 622個精子，可以明確區(qū)分非整倍體、二倍體、缺體或雜交失敗。

Sloter等［9］報道隨著男性年齡的增長，該男性子代患染色體缺陷的風(fēng)險可能增加。dela Rochebrochard等［10］報道男性年齡可能與自然流產(chǎn)相關(guān)。另外越來越多的研究顯示男性不育與精子的非整倍體率存在相關(guān)性［11］，其不僅導(dǎo)致自然流產(chǎn)、死產(chǎn)和胚胎早期丟失，也是新生兒遺傳病的主要原因之一，然而男性年齡與精子非整倍體發(fā)生率的相關(guān)性研究，未見相似性的報道?；谝陨系难芯勘尘埃虼吮狙芯恐荚谕ㄟ^應(yīng)用18，X，Y熒光原位雜交（FISH）技術(shù)對不同年齡男性精子的非整倍體進(jìn)行檢測，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著年齡增加，精子非整倍體率增加，≥40 歲組精子非整倍體率明顯高于 ＜35歲組和 35歲～組，差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；＜35歲組與35歲～組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究顯示，年齡增加對精子染色體有負(fù)面影響，當(dāng)男性年齡＞40 歲時，精子非整體率顯著增加，增大了精子發(fā)生過程中染色體異常的風(fēng)險，從而增加了子代出生缺陷以及早產(chǎn)的危險性。因此在男性不育診療過程中，對高齡男性進(jìn)行精子染色體分析有其必要性，能充分評估其生育風(fēng)險，這將有助于其選擇更加合理的生育方式。

對高齡男性患者在輔助生殖技術(shù)之前進(jìn)行精液常規(guī)、DNA損傷率以及精子非整倍體檢測，可以預(yù)測輔助生殖特別是卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射（ICSI）的成功率［12］，對輔助生殖前積極改善個人的不良生活習(xí)慣（吸煙、藥物、職業(yè)環(huán)境、長期化學(xué)物質(zhì)接觸者）以及行針對性的治療［13］（如：微創(chuàng)手術(shù)、口服抗氧化藥物等）以改善精子的質(zhì)量和減少患者精子DNA損傷以及精子非整倍體率，從而避免有缺陷的遺傳物質(zhì)傳遞給子代，而降低子代的出生缺陷的危險性。

綜上所述，年齡與精子正常形態(tài)、精子DNA損傷以及精液非整倍體率有一定相關(guān)性，對于不育癥患者，應(yīng)考慮年齡因素。高齡對生育能力及后代生長發(fā)育的影響是個不容忽視的問題。在做輔助生殖治療時，人們也必須關(guān)注男性的年齡，考慮男方年齡因素可能會影響輔助生殖助孕結(jié)果。這也將為男方診斷提供新的思路，為對育齡夫婦正確的生育指導(dǎo)提供理論依據(jù)，選擇最佳的生育年齡，優(yōu)生優(yōu)育。

1 Vagnini L，Baruffi 1tLlt， MauTi AL， et al. The effects of male age on sperm DNA damage in an infertile population. Reprod Biomed Online 2007； 15（5）： 514-519

2 孫靜波， 姜宏， 何瑞冰， 等. 精子DNA完整性與精液參數(shù)的相關(guān)性研究. 中國男科學(xué)雜志 2010； 24（4）： 26-29

3 Lewis-Jonc I， Aziz N， Seshadri S， et al. Sperm chromosomal ahnormalities are linked to sperm morphologic deformities. Fertil Steril 2003； 79（1）：212-215

4 Moosani N， Pattinson HA， Carter MD， et al. Chromosomal analysis of sperm from men with idiopathic infertility using sperm karyotyping and fluorescence in situ hybridization. Fertil Steril 1995； 64（4）： 811-817

5 Mercier S， Morel F， Fellman F， et al. Molecular analysis of the chromosomal equipment in spermatozoa of a 46，XY， t（7； 8） （q11. 21） carrier by using fl uorescence in situ hybridization. Hum Genet 1998； 102（4）： 446-451

6 李剛， 孫瑩璞， 金海霞， 等. 胚胎植入前遺傳學(xué)診斷10個周期的臨床分析. 生殖與避孕 2007； 27（11）： 718-722

7 龍見橋， 莊廣倫， 龍曉林， 等. 卵裂胚發(fā)育與染色體異常的關(guān)系. 南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報 2008； 28（7）： 1276-1278

8 萬均輝， 鐘澤艷， 田佩玲. FISH技術(shù)在診斷唐氏綜合征及植入前遺傳學(xué)診斷中的臨床應(yīng)用. 中國計(jì)劃生育學(xué)雜志 2011； 19（9）： 556-559

9 Sloter ED， Marchetti F， Eskenazi B， et al. Frequency of human sperm carrying structural aberrations of chromosome 1 increases with advancing age. Fertil Steril 2007； 87（5）： 1077-1086

10 de la Rochebrochard E， Thonneau P. Paternal age and maternal age are risk factors for miscarriage； results of a multicentre European study. Hum Reprod 2002； 17（6）：1649-1656

11 Sarrate Z， Vidal F， Blanco J. Role of sperm fl uorescent in situ hybridization studies in infertile patients： indications， study approach， and clinical relevance. Fertil Steril 2010；93（6）： 1892-1902

12 Bungum M， Humaidan P， Spano M， et a1.The predictive value of sperm chromatin structure assay （SCSA）parameters for the outcome of intrauterine insemination，IVF and ICSI. Hum Reprod 2004； 19（6）：1401-1408

13 Greco E， Iacobelli M， Rienzi L， et a1. Reduction of the incidence of sperm DNA fragmentation by oral antioxidant treatment. J Androl 2005； 26（3）： 349-353

（2016-05-30收稿）

Effects of males' age on sperm quality and aneuploidy of human sperms*

Sun Baogang， Wang Lixia， Cao Jingheng， Zhang Ning， Liang Lunan， Yang Aijun
Affi liated Hospital of Jining Medical College， Jining 272000， Shangdong， China

Objectivee To explore the effects of males'age on sperm quality and aneuploidy of human sperms. Metthhooddss Total of 120 semen samples were collected and divided into three groups according to the males'age， including＜35 yr group（n=42）， 35～ y group（n=40）， and ≥40 y group（n=38）. Based on the WHO Laboratory Manual （5th ed）， seminal parameters and aneuploidy of human sperms were detected and analyzed by tripl-color fl uorescence among the three groups. Results There were no statistically significant dilferences among the three groups in semen volume［ （5.25±2.05）mL vs（5.05±2.26） mL vs （5.09±3.67） mL］， sperm concentration［ （28.21±3.08） ×106/mL vs （26.21±3.73） ×106/mL vs （23.85±5.56）×106/mL］ and sperm motility［ （30.05±9.34） % vs （28.30±8.04） % vs （26.30±5.08） %］. There were no statistically signifi cant differences between ＜35 yr group and 35～39 yr group in sperm morphology［ （7.20±2.30） % vs （6.56±3.20） %］， sperm apoptosis［ （14.69±3.69） % vs （16.12±4.52） %］ and aneuploidy ［ （2.71±0.56） % vs（3.45±0.65）%］of human sperms. However， sperm morphology （4.68±2.89）%， sperm apoptosis（24.86±7.85）% and aneuploidy （6.56±0.70） % in ≥40 yr group on showed obvious differences compared with those in the group of ＜35yr and 35～yr. （P＜0.05）. Concluussiioonn Males'age increase might injure sperm normal morphology and sperm DNA integrity，result in an increase of sperm aneuploid.

age factors； in situ hybridization， fl uorescence； spermatozoa； chromosomes； DNA damage

10.3969/j.issn.1008-0848.2016.07.008

R 698.2

資助： 山東省醫(yī)藥衛(wèi)生科技發(fā)展項(xiàng)目（2015WS0410）；濟(jì)寧市科技發(fā)展項(xiàng)目［濟(jì)科字（2015）57號-15］；濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院苗圃科研項(xiàng)目［JYFY-MP-2013-（ZD）-005］