郭凱敏劉凌云綜述 田潤輝審校

1. 吉林大學第一醫(yī)院男科（吉林 130021）；2. 吉林大學第一醫(yī)院心理科

Src同源酪氨酸磷酸酶（Shp2）在雄性生殖調(diào)控的研究進展

郭凱敏1劉凌云1綜述 田潤輝2審校

1. 吉林大學第一醫(yī)院男科（吉林 130021）；2. 吉林大學第一醫(yī)院心理科

S r c同源酪氨酸磷酸酶（S r c h o m o l o g y phosphotyrosyl phosphatase2， Shp2）是非受體蛋白酪氨酸磷酸酶（protein tyrosine phosphatase， PTP）家族成員之一，由蛋白酪氨酸磷酸酶非受體型11（protein tyrosine phosphatase nonreceptor11，PTPN11）基因編碼并在人類細胞和組織中廣泛表達，參與細胞多種生物活動，包括細胞的增殖、分化、有絲分裂、器官發(fā)育、免疫反應以及代謝過程。已有大量研究顯示Shp2參與多種疾病的發(fā)生，如全身系統(tǒng)腫瘤（胰腺癌［1］、肺癌［2］、肝癌［3］、乳腺癌［4］等），在介導細胞增殖和分化過程中，Shp2是關(guān)鍵的細胞內(nèi)調(diào)控因子，其作用已被廣泛揭示。而Shp2 在睪丸組織的表達以及調(diào)控精子方面的研究最近才成為熱點。本文就近些年Shp2在雄性生殖的調(diào)控方面做一綜述。

一、Shp2在睪丸細胞中的表達和定位

Shp2的結(jié)構(gòu)是由兩個SH2（N-SH2和C-SH2）結(jié)構(gòu)域、一個單一的PPT區(qū)以及一個含有磷酸化位點的C端親水尾部結(jié)構(gòu)組成。由于和區(qū)之間的親密互作，它表現(xiàn)為一個低的基礎(chǔ)催化活性，以保持磷酸酶處于一個自動抑制的封閉構(gòu)象。因此，它的催化活性需要通過釋放這些互作而打開，這個反應發(fā)生在它的結(jié)構(gòu)域結(jié)合于在上游信號傳導搭檔上發(fā)現(xiàn)的特定磷酸酪氨酸基序［5］。目前普遍認為Shp2在發(fā)育方面至關(guān)重要的作用離不開它在不同競爭物的應答中促進Ras/MAPK通路激活，而且在許多雄性繁殖過程，包括精子發(fā)生、精子成熟、支持細胞和精原細胞粘附、以及血睪屏障的動態(tài)性改變中，Shp2發(fā)揮了正向調(diào)控作用。

Puri等［6］應用免疫熒光技術(shù)發(fā)現(xiàn)Shp2在睪丸支持細胞細胞核和細胞漿中高表達，而且在位于血睪屏障周圍生精小管基底膜部的支持細胞表達更為顯著，同時其表達水平在睪丸全部發(fā)育過程中基本保持穩(wěn)定。在睪丸生殖細胞中，Shp2表達于大部分未成熟的單個A形精原干細胞（As）和鏈狀A形精原干細胞（A aligned）精原細胞細胞核、胞漿以及質(zhì)膜。質(zhì)膜的Shp2檢測水平與質(zhì)膜受體磷酸酶的相互作用相關(guān)。而分化的精原細胞、精母細胞和精子細胞不表達Shp2，其調(diào)控精原細胞分化機制方面目前尚不清楚。

二、Shp2維持精子生成

有研究顯示，Noonan 綜合征和Leopard綜合征都與Shp2的編碼基因PTPN11點突變有關(guān)，而這兩種先天性疾病均表現(xiàn)為男性不育［7，8］。Yoon等［9］發(fā)現(xiàn)Noonan 綜合征PTPN11點突變多達47種。Shp2完全缺失能引起胚胎原腸腔神經(jīng)節(jié)、脊索和脊索后延伸缺陷，造成胚胎發(fā)育停滯［10］。在維持成年小鼠精子生成方面，Puri等［6］通過哺育PTPN11floxed小鼠，將他莫昔芬結(jié)合蛋白結(jié)合域和泛素啟動子融合到Cre重組酶，構(gòu)建了條件性基因敲除小鼠模型，發(fā)現(xiàn)敲除29d后小鼠生精小管精原細胞和精母細胞缺失，敲除43d后除部分成熟的長型精子細胞外，其余睪丸各級生精細胞均缺失。同時，發(fā)現(xiàn)殘存的精子細胞分布散亂，個別細胞頂體部位變異。在敲除63d后，生精小管各級生精細胞均缺失。這提示Shp2 基因敲除可以影響未分化精原細胞的產(chǎn)生，而并不直接影響分化精原細胞和成熟精子細胞的存活。另外，Puri［6］將PTPN11floxed小鼠與 Vasa Cre 小鼠交配 建立了生殖母細胞特異性Shp2 基因敲除模型（GCPTPN11KO），此時胚胎發(fā)育15d，精原干細胞（SSC）未形成，3～4周時敲除小鼠生殖細胞進行性減少，8周后生殖細胞全部消失，從而認為Shp2 對出生后小鼠睪丸精子形成起重要作用。

小鼠出生后5d睪丸中可以存在兩種生殖母細胞，一種形成SSC ，負責后續(xù)精子的產(chǎn)生。另一類的生殖母細胞可以一次性繞過SSC和未分化精母細胞階段，這類細胞直接分化形成A1型精母細胞，進而分化產(chǎn)生精子，稱為第一階段精子形成［11］。因此，研究發(fā)現(xiàn)GCPTPN11KO 小鼠可以正常形成第一階段精子，這與未分化精母細胞未檢測到Shp2表達一致［6］。這提示Shp2可能在維持A1分化精原細胞與和后續(xù)生殖細胞產(chǎn)生方面作用局限，而其重要作用表現(xiàn)在SSC增殖以及精子持續(xù)生成方面。與之相比，Shp2敲除小鼠出生后5d SSC和未分化精原細胞增加50%，而出生后7d由于細胞凋亡造成這些細胞下降60%?？梢奡hp2對SSC增殖和精子持續(xù)生成至關(guān)重要。已有研究顯示Shp2條件性基因敲除小鼠可以抑制多種類型細胞（如神經(jīng)干細胞、造血干細胞（HSC）、心臟祖細胞和T細胞）增殖［12］。Shp2抑制因子能夠通過SSC增殖啟動子bFGF和GDNF調(diào)控，進而抑制ERK信號激活，在體外抑制SSC增殖。

三、Shp2在SSC自我更新及分化中的作用

已有大量研究證實Shp2 在造血干細胞和神經(jīng)干細胞更新分化中的作用［13-15］，而其在SSC的研究較少。SSC的自我更新主要由細胞因子GDNF、bFGF、集落刺激因子（CSF-1）、以及趨化因子配體（CXCL12）調(diào)控［16］。這些因子在SSC更新盡管沒有詳細的描述，然而GDFN和bFGF 在富集培養(yǎng)SSC中激活的AKT，介導的ERK磷酸化發(fā)揮作用已被廣泛認可［17］。ERK和AKT激活產(chǎn)生的活性氧ROS刺激GFRA1和FGFR受體后可以促進SSCs自我更新和增殖［18］。Shp2參與體細胞GDNF和bFGF介導的信號通路，以及在體外SSC中Shp2活性是GDFN和bFGF誘導ERK磷酸化的必要條件。目前尚不清楚是否在SSC中Shp2可以通過GDNF和bFGF調(diào)控AKT激活。因此，仍然需要進一步研究證實Shp2是否能夠引起激活不同的AKT或ERK通路從而決定細胞自我更新或分化。

STAT3是一種促進SSC分化和抑制自我更新的轉(zhuǎn)錄因子，由它調(diào)控的信號旁路可能是Shp2 介導的SSC分化的潛在靶點［19］。Shp2通過STATS3磷酸化將其激活［20，21］， STAT3激活后可以刺激SALL4表達，后者可以隔離ZBTB16基因，從而表達轉(zhuǎn)膜受體c-kit，最終促進精原細胞分化［22］。STAT3 也可以誘導NGN3轉(zhuǎn)錄因子生成，后者再與E-box轉(zhuǎn)錄因子相互作用，引起促進SSC分化基因的表達［23］。可見，Shp2介導的STAT3和NGN3下調(diào)是阻滯SSC分化的機制之一。SSC中Shp2的下游靶點ETV5和BCL6B也是SSC自我更新的重要轉(zhuǎn)錄因子［24］。而這些因子接受bFGF 和 GDNF通過PTPN11依賴的MAPK通路正向調(diào)控［25］（如圖1）。

圖1　Shp2激活SSC增殖、自我更新、分化的細胞通路

研究顯示，敲除生殖細胞Shp2基因能夠通過抑制SSC增殖而誘導生精阻滯，而敲除支持細胞Shp2基因可以干擾旁分泌因子的表達，促進SSC過度分化［27］。后者基因敲除引起SSC來源的未分化精母細胞從出生后第二周開始迅速減少，以及分化成熟的精母細胞過早出現(xiàn)，同時Shp2可以很大程度上修復支持細胞細胞連接以及SSC克隆形成。早幼粒細胞白血病鋅指蛋白（PLZF）是SSC和未分化精母細胞的特異性標志物，基因敲除小鼠以及Shp2loxp/loxp小鼠中，PLZF陽性的細胞數(shù)只在出生后一周內(nèi)數(shù)量保持相同，隨著小鼠增齡數(shù)量急劇下降，支持細胞Shp2基因敲除引起SSC維持受損。此外，盡管目前尚不能明確促進SSC自我更新基因表達的改變是否與Shp2基因敲除有關(guān)，但是Shp2缺陷的支持細胞中編碼分化促進因子基因上調(diào)。這些研究提示支持細胞Shp2基因缺失破壞SSC維持自我更新和分化間的平衡，通過誘導SSC分化而阻止生殖細胞的補充儲備［27］?？梢?，支持細胞正常表達的Shp2是保持SSC自我更新和分化之間相互平衡的必要條件，也是維持精子持續(xù)生成和生育力的重要因素。

四、Shp2調(diào)控血睪屏障的完整性和SSC的附著

血睪屏障（BTB）是睪丸中毛細血管和支持細胞之間的緊密連接形成，將生精小管分為基底部和頂部，它為精原細胞提供營養(yǎng)。血睪屏障破壞可以造成睪丸生精細胞脫落以及分化、發(fā)育阻滯［28］。血睪屏障周期性結(jié)構(gòu)更新可以促進精原細胞從生精小管基底部向管腔部轉(zhuǎn)運，其中激酶介導的信號級聯(lián)反應在血睪屏障維持和重塑中起關(guān)鍵作用。Puri等［6］研究發(fā)現(xiàn)組成性激活Shp2突變體SHP2Q79R的表達可以減小支持細胞跨膜電阻，從而破壞體外支持細胞之間的黏附。在生精周期一些特定階段，支持細胞和生精細胞會分泌一系列細胞因子來調(diào)節(jié)BTB的開閉以及精子的形成［29］。肝細胞生長因子（HGF）是個調(diào)節(jié)血睪屏障重要的生長因子，它可以刺激體外支持細胞增加SRC和ERK活性，減低細胞跨膜電阻，是Shp2的上游調(diào)控因子。Shp2可同HGF 受體（c-Met）銜接蛋白（Gab1）相互作用從而負調(diào)節(jié)MAPK通路激活［30］。

體外大鼠睪丸支持細胞的研究表明，組成性激活Shp2通過降低樁蛋白的磷酸化，引起負調(diào)節(jié)因子SRC與CSK解離，從而激活ERK，導致表達SHP2Q79R的支持細胞間粘附調(diào)節(jié)因子FAK 失活，穩(wěn)定細胞間黏附的細胞骨架破壞［31］。最終，組成性激活的Shp2改變引起緊密連接蛋白ZO-1，銜接蛋白β-catenin和轉(zhuǎn)膜蛋白N-cadherin從質(zhì)膜細胞粘附部位與支持細胞胞漿發(fā)生定位改變。這些表明Shp2對于維持SSC之間和SSC和支持細胞間黏附有重要意義。

五、Shp2調(diào)節(jié)間質(zhì)細胞睪酮生成

睪酮是重要的雄性激素和合成代謝類固醇，在雄性中主要由睪丸間質(zhì)細胞產(chǎn)生。促卵泡激素刺激間質(zhì)細胞產(chǎn)生cAMP增加，激活蛋白激酶A，通過上調(diào)轉(zhuǎn)運體急性調(diào)節(jié)蛋白（STAR）促進膽固醇轉(zhuǎn)運至線粒體，從而刺激激素合成通路合成類固醇。酰基輔酶A合成酶（ACSL4）和?；o酶A硫解酶（ACOT2）可以調(diào)控花生四烯脂氧化和環(huán)氧化代謝產(chǎn)物產(chǎn)生，進而增強STAR表達［32］。最近研究發(fā)現(xiàn)［33］Shp2是間質(zhì)細胞ACSL4 表達的重要調(diào)控因子，用Shp2的抑制劑NSC87877可以在體外抑制間質(zhì)細胞產(chǎn)生睪酮。此外，shRNA調(diào)控的Shp2基因敲除引起的睪酮含量減少與ACSL4 和STAR蛋白含量減低相關(guān)。而Shp2過表達可以提高ACSL4和STAR蛋白以及睪酮的含量。Shp2能夠通過胞漿MAPK和PI4K-Akt通路調(diào)控FSH以及睪酮的產(chǎn)生。此外，Shp2基因敲除能夠抑制線粒體融合這一重要的睪酮產(chǎn)生過程［34］。

國內(nèi)學者蔡曉黎等發(fā)現(xiàn)，出生后小鼠Shp2連續(xù)性表達以及在特定發(fā)育階段表達量的明顯波動，預示Shp2參與小鼠出生后睪丸發(fā)育的全過程，此外檢測小鼠血清中睪酮水平，發(fā)現(xiàn)Shp2在全部睪丸發(fā)育過程中的表達模式與小鼠血液中睪酮水平趨勢變化基本吻合［35］?？梢?，Shp2對睪丸發(fā)育和睪酮生成持續(xù)發(fā)生作用。

綜上所述，Shp2在精子生成、精原細胞自身更新分化以及雄激素的生成方面起重要作用。目前Shp2研究還停留在動物水平，在男性不育人群中的未見報道，對其深入研究有利于揭示男性不育癥的發(fā)病機理，同時也可能為不育的治療提供理論依據(jù)，Shp2抑制劑可能代替?zhèn)鹘y(tǒng)的手術(shù)結(jié)扎成為控制雄性生育的方法之一?？傊?，Shp2 能否應用于實踐仍需要大量研究。

致謝：本文受吉林省財政廳科研專項資助（項目卡編號3D5157343428）基金項目資助

含SH2域蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶類； 精子發(fā)生； 雄激素類

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（2016-05-05收稿）

10.3969/j.issn.1008-0848.2016.07.016

R 698.2