楊冬梅，陽 巍，邱 飛，孫四玉，陳劍雄，張彩平， 熊國祚， 庹勤慧，4， 廖端芳,

(1. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖南 長沙 410208；2. 南華大學(xué)藥物藥理研究所，湖南 衡陽 421001；3. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合心腦疾病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410208；4. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙 410208)

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姜黃素?zé)熕狨?duì)血管平滑肌細(xì)胞增殖及ERK1/2信號(hào)通路的影響

楊冬梅1，陽 巍2，邱 飛1，孫四玉1，陳劍雄3，張彩平2， 熊國祚2， 庹勤慧2，4， 廖端芳1,2

(1. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖南 長沙 410208；2. 南華大學(xué)藥物藥理研究所，湖南 衡陽 421001；3. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合心腦疾病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410208；4. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙 410208)

目的 探討姜黃素?zé)熕狨?curcumin trinicotinate，CurTn)對(duì)血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)增殖的影響及其可能機(jī)制。方法 體外培養(yǎng)VSMC，體積分?jǐn)?shù)為0.1的FBS刺激VSMC生長。MTT法觀察CurTn對(duì)VSMC活力的影響；流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期；Western blot檢測(cè)PCNA、p-ERK1/2、CyclinD1蛋白的表達(dá)。結(jié)果 CurTn抑制VSMC增殖并呈現(xiàn)一定量效、時(shí)效關(guān)系，并且使G1期的細(xì)胞比例增加，S期細(xì)胞比例下降，PCNA蛋白表達(dá)下調(diào)。同時(shí)發(fā)現(xiàn)CurTn能明顯抑制p-ERK1/2、CyclinD1蛋白表達(dá)。結(jié)論 CurTn能明顯抑制VSMC增殖，其作用機(jī)制可能與p-ERK1/2、CyclinD1蛋白表達(dá)下調(diào)有關(guān)。

姜黃素?zé)熕狨?；煙酸；姜黃素；VSMC；增殖；ERK；機(jī)制

心血管疾病是一種嚴(yán)重威脅人類健康，特別是中老年人健康的常見病。我國每年近300萬人死于心血管疾病，占全部死亡原因的40%，居各種死因之首[1-2]。動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是心血管疾病的主要發(fā)病原因，它是一種多因素導(dǎo)致的動(dòng)脈血管病變，其中血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)異常增殖是AS形成的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[3]。因此，抑制VSMC的異常增殖能夠抑制血管壁肥厚，延緩動(dòng)脈硬化，從而防治多種心腦血管疾病。

姜黃素(curcumin)是大部分姜科植物都含有的一種重要活性成分。研究已證實(shí)[4]，姜黃素具有抑制平滑肌細(xì)胞增殖，延緩AS發(fā)生發(fā)展的作用，但是生物利用度低限制了其臨床應(yīng)用。煙酸又稱維生素B3，文獻(xiàn)報(bào)道其具有明顯抗AS的作用，這可能與它作用于AS病變中的細(xì)胞增殖和遷移有關(guān)[5]。但單用煙酸能引起皮膚潮紅、瘙癢、胃腸道刺激等副作用。為充分發(fā)揮姜黃素和煙酸的藥物療效，克服各自缺點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)室根據(jù)新藥設(shè)計(jì)的拼合原理，合成了具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的新型合成化合物姜黃素?zé)熕狨?curcumin trinicotinate，CurTn)(專利號(hào)：ZL20091 0042665.8)。前期體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究已發(fā)現(xiàn)姜黃素?zé)熕狨ゾ哂锌笰S作用，但機(jī)制尚未清楚。本研究擬建立血清刺激的VSMC增殖模型，觀察CurTn對(duì)體外培養(yǎng)VSMC增殖的影響，并初步探討其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥物 姜黃素?zé)熕狨ビ赡先A大學(xué)藥理植化室合成(純度為95%以上)，使用前用DMSO溶解，用DMEM培養(yǎng)基稀釋成所需濃度于4℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試劑與儀器 VSMC細(xì)胞株購于長沙湘雅中心實(shí)驗(yàn)室；姜黃素和煙酸購于上海阿拉丁試劑；胎牛血清(FBS)、DMEM購于美國Gibco公司；胰蛋白酶、四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)、PD98059購于美國Sigma公司；一抗PCNA、CyclinD1、二抗山羊抗兔IgG購于美國Santa Cruz公司；一抗p-ERK1/2購于美國Cell Signaling公司；一抗β-actin、二抗山羊抗小鼠購于武漢博士得公司；一抗α-tubulin購于北京博奧森公司；ECL試劑盒購于碧云天；其他試劑均為分析純。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞培養(yǎng)使用含體積分?jǐn)?shù)為0.1的FBS的DMEM培養(yǎng)基，細(xì)胞同步化使用含體積分?jǐn)?shù)為0.001的FBS的DMEM培養(yǎng)基，并置于37℃、5%的CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力 取對(duì)數(shù)期VSMC，消化吹打成5×107·L-1的密度，每孔200 μL接種于96孔板中。待細(xì)胞貼壁后，用含體積分?jǐn)?shù)為0.001的FBS的培養(yǎng)基同步化處理24 h。然后按不同組別的處理因素處理VSMC，同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔(不加細(xì)胞和處理因素，加MTT和DMSO)，周邊孔則加入200 μL的PBS避免邊緣化效應(yīng)。24 h后，每孔加MTT液15 μL，繼續(xù)孵育4 h。隨后吸出每孔的培養(yǎng)液，加入200 μL的DMSO，搖床上震搖10 min，570 nm波長處檢測(cè)OD值。

1.3.3 流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期 VSMC適量接種于100 mm培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞融合度達(dá)到60%～80%后，同步化處理24 h。接著按不同處理因素處理，24 h后，消化細(xì)胞，并收集于離心管中，1 000 r·min-1離心5 min，倒掉培養(yǎng)基，加入1～2 mL PBS，再次離心5min，倒掉PBS，用流式固定液[V(乙醇) ∶V(冰PBS) = 4 ∶1]，4℃固定過夜，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布。

1.3.4 Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá) 取生長狀態(tài)良好的各組細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗3次，加入RIPA裂解液和PMSF的混合液，置于冰上裂解15 min，用細(xì)胞刮刮下蛋白，4 ℃、13 000 r·min-1離心15 min，吸取上清至EP管中，-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩５鞍踪|(zhì)含量用BCA蛋白定量的方法進(jìn)行計(jì)算。然后在提取的蛋白質(zhì)中加入5×SDS凝膠上樣緩沖液，沸水中煮蛋白質(zhì)10 min，使其變性，4℃保存?zhèn)溆?。配?%～12%聚丙烯酰胺凝膠，進(jìn)行電泳分離(積層膠80 V，分離膠120 V)，350 mA濕轉(zhuǎn)PVDF膜3 h，TBST配制5%的脫脂牛奶封閉液輕搖封閉2 h，按抗體說明書的比例加入稀釋的一抗，4℃孵育過夜，TBST洗3次，每次15 min，按說明書稀釋并加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔、山羊抗鼠二抗，37℃孵育45 min，然后用TBST洗膜4次，每次10～15 min，用化學(xué)發(fā)光顯影法進(jìn)行顯影，以分析軟件AlphaImager 2200分析產(chǎn)物的光密度值(灰度比值=蛋白條帶灰度/內(nèi)參照蛋白條帶灰度)

2 結(jié)果

2.1 姜黃素?zé)熕狨ヒ种芕SMC增殖并呈現(xiàn)一定的量效、時(shí)效關(guān)系 與對(duì)照組比較，模型組能明顯促進(jìn)VSMC增殖(P<0.05)；而1、3、10、30、100 μmol·L-1的CurTn則明顯抑制VSMC的增殖(P<0.05)，且抑制作用隨濃度增加而增加(Fig 1)。30 μmol·L-1CurTn處理24、48、72 h后，從Fig 2中可以看出，30 μmol·L-1的CurTn抑制VSMC的增殖(P<0.05)，并具有時(shí)效關(guān)系。

2.2 煙酸、姜黃素及姜黃素?zé)熕狨?duì)VSMC增殖的影響 用60 μmol·L-1的煙酸、30 μmol·L-1的姜黃素、30 μmol·L-1的姜黃素?zé)熕狨ヌ幚鞻SMC 24 h。如Fig 3所示，與對(duì)照組比較，體積分?jǐn)?shù)為0.1的FBS明顯刺激VSMC的增殖(P<0.05)，溶媒組與增殖組比較未發(fā)生明顯變化；單用煙酸、姜黃素和姜黃素?zé)熕狨ゾ芤种芕SMC的增殖(P<0.05)，而姜黃素?zé)熕狨ヒ种芕SMC增殖的作用比單用單體的作用強(qiáng)(P<0.05)。

Fig 1 Does effect of CurTn on the proliferation of ±s，n=3)

VSMC were treated with 10% FBS and stimulated with different concentrations of CurTn for 24 h, and then detected by MTT assay.*P<0.05vscontrol；#P<0.05vsmodel

Fig 2 Time effect of 30 μmol·L-1 CurTn on proliferation of VSMC

VSMC treated with 30 μmol·L-1CurTn for 24,48,72 h, and then detected by MTT assay.P<0.05vs24 h or 72 h；#P<0.05vs48 h or 24 h

Fig 3 Effect of 30 μmol·L-1 curcumin, 60 μmol·L-1niacin and 30 μmol·L-1 CurTn on proliferation of VSMC

*P<0.05vscontrol；#P<0.05vsmodel;△P<0.05vsniacin or curcumin

2.3 姜黃素?zé)熕狨?duì)VSMC周期及PCNA蛋白的影響 與對(duì)照組比較，模型組和溶媒組細(xì)胞G/G1期比例明顯降低，S期比例明顯增高(P<0.05)；與模型組比較，溶媒組未有明顯的改變；而姜黃素、煙酸、姜黃素?zé)熕狨ツ苊黠@增加G0/G1期比例，降低S期比例(P<0.05)。見Tab 1。

VSMC同步化24 h后，加入藥物處理24 h。與對(duì)照組比較，模型組中PCNA蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05)；與模型組比較，姜黃素、煙酸、姜黃素?zé)熕狨ゾ芟抡{(diào)PCNA蛋白的表達(dá)(P<0.05)；但姜黃素?zé)熕狨ハ抡{(diào)PCNA蛋白的表達(dá)比單用單體作用明顯(P<0.05)。見Fig 4。

Fig 4 Influence of CurTn on expression of PCNA in VSMC

VSMC treated with different factors for 24 h,the expression of PCNA was analyzed by Western blot.*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsmodel;△P<0.05vsniacin or curcumin

2.4 姜黃素?zé)熕狨?duì)VSMC增殖中p-ERK1/2、CyclinD1蛋白表達(dá)的影響 VSMC同步化24 h后，加入藥物處理24 h。與對(duì)照組比較，模型組中p-ERK1/2、CyclinD1蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05)；與模型組比較，姜黃素、煙酸、姜黃素?zé)熕狨ゾ芟抡{(diào)p-ERK1/2、CyclinD1蛋白的表達(dá)(P<0.05)；但姜黃素?zé)熕狨ハ抡{(diào)p-ERK1/2、CyclinD1蛋白的表達(dá)比單用單體作用明顯(P<0.05)。見Fig 5、6。

3 討論

AS是臨床最常見的、由多種因素引起的動(dòng)脈血管進(jìn)展性狹窄性疾病，其形成的重要環(huán)節(jié)為VSMC的異常增殖?，F(xiàn)代研究表明，姜黃素能抑制VSMC增殖，發(fā)揮抗炎、抗氧化、降血脂等作用，從而延緩AS發(fā)生發(fā)展。但因體內(nèi)水溶性差、吸收少及生物利用度低等特點(diǎn)，限制了它在臨床上的應(yīng)用。煙酸作為一類調(diào)脂作用明顯的藥物，發(fā)現(xiàn)它發(fā)揮抗AS作用可能與其抑制細(xì)胞增殖有關(guān)。然而，當(dāng)單用煙酸時(shí)存在著促前列腺素合成、易引起皮膚潮紅、瘙癢等副作用。為改善姜黃素的生物利用度，并且保留或提高兩化合物的藥理作用及生物活性，本實(shí)驗(yàn)室將姜黃素和煙酸進(jìn)行成酯拼合制成姜黃素?zé)熕狨?。?shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素?zé)熕狨ツ芤种聘咧桂B(yǎng)的ApoE-/-小鼠AS斑塊的形成，具有抗AS作用，但機(jī)制尚未清楚[6]。

GroupControlModelDMSONiacinCurcuminCurTnG0/G1/%62.36±3.72450.21±2.685*51.86±3.993*59.72±2.612#58.16±4.583#60.21±6.250#△S/%27.03±4.05339.36±3.417*38.52±1.623*32.16±1.603#28.18±5.104#29.61±6.726#△G2/M/%10.58±0.42810.44±0.878*9.62±2.4138.10±2.776#13.66±4.030#10.18±0.881#△

VSMC treated with different factors for 24 h , then detected by FCM.P<0.05vscontrol;#P<0.05vsmodel;△P<0.05vsniacin or curcumin

Fig 5 Influence of CurTn on expression of CyclinD1 in VSMC

*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsmodel;△P<0.05vsniacin or curcumin

Fig 6 Influence of CurTn on expression of p-ERK1/2 in VSMC

*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsmodel;△P<0.05vsniacin or curcumin

本實(shí)驗(yàn)以大鼠VSMC為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，觀察CurTn對(duì)體外培養(yǎng)的VSMC增殖的影響。研究發(fā)現(xiàn)，CurTn呈劑量和時(shí)間依賴性地抑制VSMC的增殖，并且能明顯降低細(xì)胞增殖核抗原(PCNA)蛋白的表達(dá)。同時(shí)結(jié)果表明，CurTn比單用煙酸或者單用姜黃素抑制VSMC增殖的作用強(qiáng)。

細(xì)胞增殖周期包括DNA合成前期(G1)、DNA合成期(S期)、DNA合成后期(G2期)以及有絲分裂期(M期)4個(gè)階段。G1-S期和G2-M期是細(xì)胞生長周期中主要的調(diào)控點(diǎn)。CyclinD1是細(xì)胞周期重要的調(diào)控因子之一，當(dāng)細(xì)胞周期受到外界因素刺激時(shí)，CyclinD1與Cdk4形成復(fù)合物，誘導(dǎo)細(xì)胞增殖。在AS病變反應(yīng)中，大量的VSMC離開G0/G1期，進(jìn)入細(xì)胞周期,從而進(jìn)行異常的增殖，促進(jìn)病變的發(fā)生[7]。為探究姜黃素?zé)熕狨?duì)VSMC周期的影響，我們應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期，結(jié)果證實(shí)姜黃素?zé)熕狨ツ苊黠@增加VSMC的G0/G1期的比例，減少G2/S期的比例，使VSMC滯留在G0/G1期，并且CurTn明顯降低CyclinD1蛋白的表達(dá)，從而達(dá)到抑制細(xì)胞增殖的作用。

細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal regulated kinase，ERK)是介導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至核內(nèi)的重要細(xì)胞信號(hào)分子，其參與從質(zhì)膜到胞核的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，是細(xì)胞增殖的重要調(diào)節(jié)因素[8]。有文獻(xiàn)報(bào)道[9]，p-ERK1/2抑制劑能降低VSMC CyclinD1蛋白的表達(dá)，CyclinD1為p-ERK1/2的下游蛋白。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，CurTn 也能降低p-ERK1/2蛋白的表達(dá)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明CurTn能抑制VSMC增殖，并且其比單用煙酸或者單用姜黃素抑制作用更加明顯。其主要機(jī)制可能是通過下調(diào)p-ERK1/2蛋白表達(dá)，使CyclinD1蛋白的表達(dá)減少，從而減慢細(xì)胞周期G1/S期轉(zhuǎn)換，細(xì)胞滯留在G0/G1期，抑制VSMC增殖。這為其作為AS疾病的防治藥物提供了新的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)主要在湖南中醫(yī)藥大學(xué)干細(xì)胞調(diào)控與應(yīng)用實(shí)驗(yàn)室及南華大學(xué)藥物藥理研究所完成，在此對(duì)實(shí)驗(yàn)室各位老師及同學(xué)的幫助表示衷心的感謝！)

[1] Alexander M R, Owens G K. Epigenetic control of smooth muscle cell differentiation and phenotypic switching in vascular development and disease[J] .AnnuRevPhysiol, 2012,74(1) :13-40.

[2] Wei N, Zhang C, He H, et al. Protective effect of saponins extract from Panax japonicus on myocardial infarction: involvement of NF-κB, Sirt1 and mitogen-activated protein kinase signalling pathways and inhibition of inflammation[J] .PharmPharmacol, 2014, 66(11) : 1641-51 .

[3] Mnjoyan Z H, Doan D, Brandon J L, et al. The critical role of the intrinsic VSMC proliferation and death programs in injury-induced neointimal hyperplasia[J] .PhysiolHeartCircPhysiol, 2008, 294(5) : H2276-84 .

[4] 冒慧敏, 劉劍剛, 趙福海, 等. 莪術(shù)提取物調(diào)控支架后再狹窄血管平滑肌細(xì)胞增殖的研究進(jìn)展[J] .中國藥理學(xué)通報(bào), 2016, 32(1) : 19-22 .

[4] Mao H M, Liu J G, Zhao F H, et al. Research progress on curcuma zedoary extracts inhibiting vascular smooth muscle cell proliferation in pathological process of in-stent restenosis[J] .ChinPharmacolBull, 2016, 32(1) : 19-22.

[5] 吳陳璐, 趙水平, 張丹華. 煙酸及其與他汀類藥物聯(lián)合治療現(xiàn)狀與展望[J] .中國藥理學(xué)通報(bào), 2010, 26(3) : 414-5 .

[5] Wu C L, Zhao S P, Zhang D H . The status and prospects of niacin and its combination therapy with statins[J] .ChinPharmacolBull, 2010, 26(3) : 414-5 .

[6] 張彩平, 孫少衛(wèi), 龔勇珍, 等 . PCSK9/LDLR通路介導(dǎo)姜黃素?zé)熕狨ゴ龠M(jìn)HepG2攝取脂質(zhì)[J] .生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展, 2015, 42(9) : 825-32 .

[6] Zhang C P, Sun S W, Gong Y Z, et al . PCSK9/LDLR pathway mediates curcumin trinicotinate promoting lipid uptake of HepG2[J] .ProgBiochemBiophys, 2015, 42(9) : 825-32 .

[7] Park E S, Lee K P, Jung S H, et al .Compound K, an intestinal metabolite of ginsenosides, inhibits PDGF-BB-induced VSMC proliferation and migration through G1arrest and attenuates neointimal hyperplasia after arterial injury[J].Atherosclerosis, 2013, 228(1) : 53-60 .

[8] Wang S, Cao W, Xing H, et al . Activation of ERK pathway is required for 15-HETE-induced angiogenesis in human umbilical vascular endothelial cells[J] .JReceptSignalTransductRes, 2016, 36(3) : 225-32 .

[9] Li T, Song T, Ni L, et al . The p-ERK-p-c-Jun-cyclinD1 pathway is involved in proliferation of smooth muscle cells after exposure to cigarette smoke extract[J] .BiochemBiophysResCommun, 2014, 453(3) : 316-20.

Effects of CurTn on proliferation of VSMC

YANG Dong-mei1, YANG Wei2, QIU Fei1, SUN Si-yu1, CHEN Jian-xiong3,ZHANG Cai-ping2, XIONG Guo-zuo2, TUO Qin-hui2,4, LIAO Duan-fang1,2

(1.SchoolofPharmacy,HunanUniversityofChineseMedicine,Changsha410208,China; 2.InstituteofPharmacyandPharmacology,UniversityofSouthChina,HengyangHunan421001,China; 3.IntegrativeHeartandBrainDiseasePreventionandControlLaboratory,HunanUniversityofChineseMedicine,Changsha410208,China;4.SchoolofMedicine,HunanUniversityofChineseMedicine,Changsha410208,China)

Aim To explore the anti-proliferation effects of curcumin trinicotinate (CurTn) on vascular smooth muscle cell (VSMC) and its mechanism. Methods The cells were cultured in DMEM supplemented with 10% fetal bovine serum. MTT assay was used to examine cell proliferation. FCM was used to observe cell cycle. The expressions of PCNA, CyclinD1 and p-ERK1/2 were analyzed using Western blot. Results CurTn could inhibit the proliferation of VSMC and showed a certain amount-time relationship. What’s more， CurTn could increase the G1phase proportion of cell, decrease the S phase proportion and the expression level of PCNA protein. It was also found that CurTn significantly inhibit the protein expression of p-ERK1/2 and Cyclin D1. Conclusion CurTn may inhibit the proliferation of VSMC via downregulating the expression of CyclinD1 and p-ERK1/2 .

curcumin trinicotinate; niacin; curcumin; VSMC; proliferation; ERK; mechanism

2016-07-12，

2016-08-20

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 81673722，816700291，81670268)；湖南省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 14JJ1024，2015JJ2117)；湖南省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目(No 16A156)

楊冬梅(1991-)，女，碩士，研究方向：心血管藥理學(xué)，E-mail:15273124659@163.com；

陽 巍(1987-)，男，碩士，研究方向：心血管藥理學(xué)，共同第一作者，E-mail:36828972@qq.com；

時(shí)間：2016-10-20 10:29

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20161020.1029.020.html

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.11.010

A

1001-1978(2016)11-1526-05

R284.1；R322.74；R329.24；R543.5；R977.6

庹勤慧 (1974-)，女，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：心血管藥理學(xué)，通訊作者，E-mail: qhtuo@aliyun.com；

廖端芳(1959-)，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：心血管藥理學(xué)，通訊作者，E-mail:dfliao66@aliyun.com