趙艷麗, 丁亞琴, 王 慧, 章 毅, 楊 靜, 劉云峰

(山西醫(yī)科大學(xué) 1. 第一臨床醫(yī)學(xué)院、2.藥理學(xué)教研室、3.第一醫(yī)院內(nèi)分泌科，山西 太原 030001)

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1-磷酸鞘氨醇促進(jìn)胰島素分泌及可能機(jī)制研究

趙艷麗1,3, 丁亞琴2, 王 慧2, 章 毅2, 楊 靜1,3, 劉云峰1,3

(山西醫(yī)科大學(xué) 1. 第一臨床醫(yī)學(xué)院、2.藥理學(xué)教研室、3.第一醫(yī)院內(nèi)分泌科，山西 太原 030001)

目的 研究1-磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate, S1P)促進(jìn)葡萄糖刺激的胰島素分泌效應(yīng)及其分子機(jī)制，探索糖尿病治療藥物的作用靶點。方法 使用膠原酶P消化SD大鼠胰腺，Histopaque 1077梯度離心獲得胰島，Dispase II消化得到胰島細(xì)胞。不同濃度S1P(0～20 μmol·L-1)干預(yù)，觀察低糖(2.8 mmol·L-1)和高糖(16.7 mmol·L-1)條件下胰島素分泌的變化。膜片鉗技術(shù)記錄β細(xì)胞電壓依賴性鉀通道電流(Kv電流)，觀察S1P干預(yù)后Kv電流的變化。鈣成像技術(shù)記錄β細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，觀察不同濃度S1P(0～20 μmol·L-1)干預(yù)后細(xì)胞內(nèi)的Ca2+濃度變化。結(jié)果 與低糖組相比，高糖組明顯刺激了胰島素的分泌(P<0.01)。低糖條件下，S1P沒有改變胰島素分泌量(P>0.05)。高糖條件下，S1P濃度依賴性增加了胰島素分泌量(P<0.01)。與對照組相比，S1P明顯抑制了β細(xì)胞Kv電流(P<0.01)。高糖條件下，S1P濃度依賴性升高了胰島細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度(P<0.01)。結(jié)論 S1P可能通過抑制β細(xì)胞Kv電流、升高細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，最終促進(jìn)葡萄糖刺激的胰島素分泌。

1-磷酸鞘氨醇；Ca2+；胰島素分泌；電壓依賴性鉀通道；SD大鼠；β細(xì)胞

國際糖尿病聯(lián)盟調(diào)查顯示，截至2013年，全球約有4億糖尿病患者，預(yù)計2040年將達(dá)到6.42億，而糖尿病每年的死亡人數(shù)已經(jīng)高達(dá)500萬[1]?？梢娞悄虿∫呀?jīng)嚴(yán)重威脅到全球公民的健康。糖尿病常常伴有血糖的升高，而胰島素的分泌增加是對血糖升高的直接反應(yīng)，同時，血液中其他營養(yǎng)物質(zhì)也可以增加葡萄糖刺激的胰島素分泌，例如氨基酸、脂肪酸等[2]。當(dāng)血液中葡萄糖濃度升高時，三羧酸循環(huán)活動加強(qiáng)，ATP生成增多，ATP/ADP比值升高，ATP敏感性鉀通道(KATP)關(guān)閉，進(jìn)而細(xì)胞膜去極化，電壓依賴性鈣通道開放，鈣內(nèi)流導(dǎo)致細(xì)胞Ca2+濃度增加，促進(jìn)胰島素囊泡的胞吐作用[3-4]。研究證實[5]，1-磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate，S1P)可以刺激葡萄糖依賴性的胰島素分泌(glucose-stimulated insulin secretion，GSIS)，但其作用機(jī)制目前并不清楚。本研究通過分離SD大鼠胰島和細(xì)胞，驗證S1P是否通過抑制Kv電流和升高細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，從而促進(jìn)葡萄糖刺激的胰島素分泌。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 8～10周齡的♂ SD大鼠，體質(zhì)量250 g～280 g，由山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。生產(chǎn)許可證號：SCXK(晉)2015-0001。

1.1.2 試劑 S1P(美國Cayman,批號：0467600-11)；膠原酶P(瑞士Roche，批號：11104222)； D-葡萄糖(北京索萊寶，批號：405A0918)；BSA(北京索萊寶，批號：831O0513)；HEPES(北京索萊寶，批號：710B048)；青鏈霉素(北京索萊寶，批號：20150909)；Histopaque 1077(美國Sigma，批號：RNBF1783)；胎牛血清(上海生工，批號：B326FA0092)；RPMI 1640培養(yǎng)基(上海生工，批號：C518FA0002)；Dispase II(美國Amresco，批號：10888700)；胰島素檢測試劑盒(北京北方生物技術(shù)研究所，批號：20160320)。

1.1.3 儀器 電子天平(上海精密，型號：GB/T26497)；體式顯微鏡(上海中恒，型號：SM262)；倒置顯微鏡(日本OLYMPUS，型號：AE-2000)；臺式離心機(jī)(長沙湘儀，型號：SC-3610)；細(xì)胞培養(yǎng)箱(北京博奧恒信生物科技，型號：HF100)；MODEL電極拉制儀(日本Narishige，型號：PP-830)；MIRO FORGE拋光儀(日本Narishige，型號：MF-200)；EPC10全自動膜片鉗(德國HEKA，型號：MP-285)；鈣成像(北京MDE，型號：LAMBDA 10-B)。

1.2 方法

1.2.1 胰島及細(xì)胞的分離和培養(yǎng) ① 使用斷頭法處死大鼠，1 g·L-1膠原酶P溶液(不含血清的RPMI 1640培養(yǎng)基溶解)消化胰腺，37℃水浴消化、Histopaque 1077梯度離心后，在體顯微鏡下手工挑取胰島，將挑好的胰島加入培養(yǎng)液后，放入37℃恒溫孵箱中培養(yǎng)[3]。② 5 g·L-1Dispase II溶液(PBS溶解)消化狀態(tài)良好的胰島為單個細(xì)胞，離心后，均勻滴在預(yù)先滴過細(xì)胞黏附劑的玻片上，加入培養(yǎng)液后，放至37℃恒溫孵箱中培養(yǎng)[3]。

1.2.2 胰島素分泌實驗 KRBH緩沖液成分(mmol·L-1)：644.0 NaCl、24.0 KCl、6.0 KH2PO4、6.0 MgSO4、12.5 CaCl2·2H2O、50 HEPES，此外，每100 mL KRBH緩沖液中再加入0.042 g NaHCO3、2 g BSA。酸乙醇成分(mL·100mL-1)：75無水乙醇、23.5蒸餾水、1.5濃鹽酸。實驗共4組，每組7個管，每管挑入大小均一，狀態(tài)良好的5個胰島。① 每組在低糖(2.8 mmol·L-1，LG)KRBH孵育液中孵育1 h，棄上清。② 分別在含S1P 0、5、10、20 μmol·L-1的低糖KRBH孵育液中孵育30 min，收集上清液待測。③ 分別在含S1P 0、5、10、20 μmol·L-1的高糖(16.7 mmol·L-1，HG)KRBH孵育液中孵育30 min，收集上清液待測。④ 每管加入500 μL的酸乙醇，超聲粉碎儀粉碎胰島組織，稀釋80 000倍后留取待測。待測樣本均使用放射免疫方法測胰島素含量。

1.2.3 膜片鉗技術(shù)記錄Kv電流 細(xì)胞外液成分(mmol·L-1)：141.9 NaCl、5.6 KCl、1.2 MgCl2、5.0 HEPES、11.1葡萄糖，pH=7.40。細(xì)胞內(nèi)液成分(mmol·L-1)：140.0 KCl、1.0 MgCl2、0.05 EGTA、10.0 NaCl和10.0 HEPES ，pH=7.30。① 細(xì)胞膜電容>7pF的為β細(xì)胞，在-70 mV的鉗制電壓下給予-70～80 mV電壓刺激400 ms，每次遞增10 mV,檢測Kv電流。② 細(xì)胞外液中加入S1P(10 μmol·L-1)，方法同上，觀察Kv電流變化情況。

1.2.4 鈣成像技術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度 使用含有2 μmol·L-1Fura-2AM的低糖(2.8 mmol·L-1)染液孵育胰島細(xì)胞后，置于高糖(16.7 mmol·L-1)溶液中，在510 nm發(fā)射波長、380 nm和340 nm激發(fā)波長下，可得到F340/F380的比值。在高糖條件下，觀察不同濃度S1P(0、5、10、20 μmol·L-1)干預(yù)前后的F340/F380的變化。

2 結(jié)果

2.1 分離的SD大鼠胰島及細(xì)胞 如Fig 1所示，分離的大鼠胰島質(zhì)地均一，狀態(tài)良好，邊緣圓潤，胰島細(xì)胞狀態(tài)良好，包膜完整。

Fig 1 Rat pancreatic islets and cells

A：Isolated rat pancreatic islets digested by collagenase P(×10)； B： Isolated rat pancreatic islet cells digested by Dispase II(×40)

2.2 S1P干預(yù)對GSIS的影響 每組7個管(每管5個胰島)，在低糖和高糖下，不同濃度S1P(0、5、10、20 μmol·L-1)干預(yù)，觀察胰島素分泌的變化，所測胰島素以2.8 mmol·L-1葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)，標(biāo)化后結(jié)果見Tab 1。與低糖比較，高糖明顯刺激了胰島素分泌(P<0.01)。低糖條件下，S1P干預(yù)后，胰島素含量沒有明顯變化(P>0.05)。高糖條件下，S1P濃度依賴性刺激了胰島素的分泌(P<0.01)。

2.3 S1P干預(yù)的Kv電流變化 在-70 mV的鉗制電壓下給予-70～80 mV電壓刺激400 ms，每次遞增10 mV,檢測Kv電流。與對照組相比，S1P(10 μmol·L-1)明顯抑制了Kv電流[對照組(110.714 6±4.811 3) pA/pF，n=8；S1P組(68.094 3±2.927 1) pA/pF，n=8；P<0.01](Fig 2)。

2.4 S1P干預(yù)的細(xì)胞內(nèi)Ca2+變化 使用含2 μmol·L-1Fura-2 AM低糖染液孵育細(xì)胞后，置于高糖溶液中，在510 nm發(fā)射波長、380 nm和340 nm激發(fā)光下，測得F340/F380。不同濃度S1P(0、5、10、20 μmol·L-1)干預(yù)，可以看到S1P濃度依賴性增加了細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，以S1P(0 μmol·L-1)為標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)化，結(jié)果如下： 0 μmol·L-1，1.000 0±0.039 3，n=5；5 μmol·L-1, 1.152 8±0.049 3，n=5；10 μmol·L-1, 1.382 8±0.063 4，n=5；20 μmol·L-1, 1.718 8±0.031 2，n=5。見Fig 3。

Tab 1 S1P promotes glucose-stimulated insulin ±s，n=7)

LG: low glucose(2.8 mmol·L-1) , HG: high glucose (16.7 mmol·L-1).##P<0.01vsLG group(S1P 0 μmol·L-1);*P<0.05,**P<0.01vsHG group(S1P 0 μmol·L-1)

Fig 2 S1P inhibits Kv currents of pancreatic beta cells

A,B：Representive current traces recorded under control and S1P treatment conditions from rat beta cells； C： Current-voltage curves of Kv channels under control and S1P treatments conditions； D： Summary of the mean current density of Kv channels recorded at 80 mV depolarization.**P<0.01vscontrol group.

Fig 3 S1P increases the level of intracellular

A： The changes of fluorescence intensity after S1P treatments from beta cells； B： Traces show the changes of intracellular Ca2+level after S1P treatments under high glucose condition； C： The ratio of fluorescence intensity (F340/F380) after S1P treatments, five cells were tested.**P<0.01vscontrol.

3 討論

糖尿病的發(fā)病率逐年上升，已成為繼心腦血管疾病、腫瘤之后第3位嚴(yán)重危害人民健康的重要慢性非傳染性疾病[6]。1型糖尿病發(fā)病機(jī)制主要是胰島素絕對缺乏，2型糖尿病則主要是胰島素抵抗伴有胰島素分泌不足，但兩者共同的核心病理環(huán)節(jié)都是β細(xì)胞功能的衰退[7]。鞘脂類代謝產(chǎn)物S1P是一種有活性的脂質(zhì)分子，在細(xì)胞內(nèi)外均發(fā)揮重要作用，已經(jīng)證實，在腫瘤、心血管疾病、骨代謝及糖尿病方面均有明顯作用[8-10]。本實驗中，與低糖相比，高糖明顯刺激了胰島素分泌。S1P干預(yù)后，低糖條件下并沒有影響胰島素分泌，而在高糖條件下，濃度依賴性促進(jìn)了胰島素分泌。在Hasan等[11]研究中發(fā)現(xiàn)，S1P可以促進(jìn)β細(xì)胞的生存和生長，抑制其凋亡，促進(jìn)GSIS。在研究中發(fā)現(xiàn)，高糖可以激活鞘氨醇激酶2(SphK2)，增加S1P的生成，促進(jìn)GSIS[5]。本實驗中，在高糖條件下，S1P明顯抑制了β細(xì)胞的Kv電流，減少鉀外流。研究已經(jīng)證明Kv通道參與動作電位的形成，抑制Kv電流可以延長動作電位時程、升高細(xì)胞內(nèi)鈣濃度，從而促進(jìn)胰島素分泌[3]。細(xì)胞內(nèi)的S1P可以調(diào)節(jié)鈣動員，升高細(xì)胞內(nèi)的Ca2+水平，促進(jìn)β細(xì)胞生長，抑制其凋亡[11-12]。本實驗證實高糖條件下，S1P干預(yù)后，濃度依賴性增加了細(xì)胞內(nèi)的Ca2+水平，而Ca2+作為細(xì)胞內(nèi)的第二信使，可以調(diào)節(jié)眾多過程，其中包括增加胰島素分泌。我們推測，S1P可能通過抑制Kv電流，延遲了動作電位時程，進(jìn)而增加鈣離子內(nèi)流，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣增加，從而促進(jìn)了胰島素分泌。

綜上，本實驗通過分離和培養(yǎng)SD大鼠原代胰島、細(xì)胞，證實了S1P可能通過抑制細(xì)胞Kv電流、升高胰島細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，最終促進(jìn)了葡萄糖刺激的胰島素分泌。此結(jié)果對于胰島素促泌劑的研發(fā)提供了實驗依據(jù)，為糖尿病的治療提供了新的治療方向。但關(guān)于S1P促進(jìn)葡萄糖刺激的胰島素分泌的下游信號通路仍待進(jìn)一步研究。

(致謝：本文實驗在山西醫(yī)科大學(xué)藥理教研室章毅老師實驗室完成，在此對參與實驗的人員表示感謝。)

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Effects and possible mechanism of sphingosine-1-phosphate-stimulated insulin secretion from rat islets

ZHAO Yan-li1,3, DING Ya-qin2, WANG Hui2, ZHANG Yi2, YANG Jing1,3, LIU Yun-feng1,3

(1.theFirstClinicalMedicalCollege, 2.DeptofPharmacology, 3.DeptofEndocrinologyoftheFirstHospital,ShanxiMedicalUniversity,Taiyuan030001,China)

Aim To observe the effects of glucose-stimulated insulin secretion (GSIS) on rat islets after S1P treatments and the underlying molecular mechanisms. Methods Collagenase P and Histopaque 1077 were used to digest and isolate rat pancreatic islets, and Dispase II was used to digest pancreatic islet to obtain pancreatic cells. Insulin secretions were measured after S1P (0～20 μmol·L-1) treatment under low glucose (LG, 2.8 mmol·L-1) and high glucose (HG, 16.7 mmol·L-1) conditions. Patch-clamp recordings were applied to monitor voltage-dependent potassium channel currents (Kv currents) after S1P treatment. Calcium image technique was used to measure the changes of intracellular Ca2+concentration after S1P (0～20 μmol·L-1) treatments. Results HG group significantly increased insulin secretion compared to LG group (P<0.01) . S1P had no effect on insulin secretion under LG condition (P>0.05). S1P increased insulin secretion significantly in a dose-dependent manner under HG condition (P<0.01) . Kv currents of β cells were inhibited significantly after S1P treatment (P<0.01) . S1P increased the concentrations of intracellular Ca2+in a dose-dependent manner under HG condition(P<0.01) . Conclusion S1P may promote GSIS by inhibiting Kv currents and increasing the level of intracellular Ca2+.

sphingosine-1-phosphate; Ca2+; insulin secretion; voltage-dependent potassium channels; SD rat; β cell

2016-06-17，

2016-07-27

國家自然科學(xué)基金資助項目(No 81273564，81373464)；山西省自然科學(xué)基金資助項目(No 201401143)；山西省回國留學(xué)人員科研資助項目(No 2013-111);中華醫(yī)學(xué)會臨床醫(yī)學(xué)科研專項資金項目(No 13040440429)；山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院青年創(chuàng)新基金資助項目(No YC1422)；山西省留學(xué)回國人員科技活動項目擇優(yōu)資助項目(No 2016-97)

趙艷麗(1990-)，女，碩士生，醫(yī)師，研究方向：糖尿病的治療及發(fā)病機(jī)制，E-mail：zhaoyanli995@163.com；

劉云峰(1973-)，女，博士，副主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，研究方向：糖尿病的治療及發(fā)病機(jī)制，通訊作者，E-mail：nectarliu@163.com

時間：2016-10-20 10:29

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20161020.1029.016.html

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.11.008

A

1001-1978(2016)11-1516-05

R-332；R329.24；R335.6；R587.105；R977.15