莫思燕,韋明中,邱金慧,朱勛帥,劉 林,林 軍

(廣西醫(yī)科大學藥學院藥理學教研室，廣西 南寧 530021)

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莫思燕,韋明中,邱金慧,朱勛帥,劉 林,林 軍

(廣西醫(yī)科大學藥學院藥理學教研室，廣西 南寧 530021)

目的 基于高遷移率族蛋白B1(HMGB1)探討老鼠簕生物堿A(HBOA) 抗大鼠肝纖維化的作用機制。方法 采用四氯化碳(CCl4)橄欖油溶液灌胃12周，建立大鼠肝纖維化模型。第8周確定建模成功后，將其隨機分為模型對照組、秋水仙堿組、HBOA高劑量組、HBOA低劑量組，從第9周起，相應藥物干預4周后，取肝組織切片行HE染色及Masson染色；測定血清中ALT、AST、T-BIL、HMGB1、IL-1β、TNF-α 的含量；免疫組化法檢測肝組織中HMGB1 蛋白的表達；實時熒光定量PCR 法測定肝組織中HMGB1 mRNA表達量。結果 與模型對照組相比，HBOA 高、低劑量均明顯減輕CCl4所致肝組織病變程度，降低血清中ALT、AST、T-BIL、HMGB1、 IL-1β、TNF-α含量，減少肝組織中HMGB1蛋白及 mRNA 表達，且血清HMGB1水平與IL-1β、TNF-α、ALT、AST、T-BIL呈正相關。結論 HBOA對CCl4誘導的大鼠肝纖維化有一定的改善，其作用機制可能與降低致炎因子HMGB1有關。

高遷移率族蛋白 B1；老鼠簕生物堿A；肝纖維化；CCl4；炎癥因子；大鼠老鼠簕(AcanthusilicifoliusL.)是爵床科老鼠簕屬的植物，為重要藥用紅樹林植物，我國民間主要用于治療急慢性肝炎、淋巴結腫脹、肝脾腫大、胃痛、咳嗽、哮喘等[1]。本課題組前期研究表明，老鼠簕藥理活性成分主要為老鼠簕生物堿，具有保肝作用[2]。其中，老鼠簕生物堿A[4-羥基苯并噁唑-2-酮，英文名4-hydroxy-2(3H)-benzoxazolone，簡稱HBOA]是老鼠簕生物堿中的1個活性單體。

肝纖維化(hepatic fibrosis,HF)是肝硬化發(fā)生的前奏和必經的中間環(huán)節(jié)，是慢性肝病的重要病理特征，也是臨床治療慢性肝病的關鍵環(huán)節(jié)。研究證實，慢性炎癥反應是肝纖維化發(fā)生、發(fā)展的重要因素[3]。近年來，人們對細胞因子在炎癥反應中的作用有了較深入的研究，高遷移率族蛋白 B1(high mobility group box 1，HMGB1)是一種晚期致炎因子，可能參與了多種組織器官如肺、肝的纖維化進程[4]。由于其具有作用持久的特點，針對HMGB1的治療比其他早期炎癥因子具有更寬泛的治療窗口期。所以，以HMGB1為靶點的抗炎治療引起人們的極大興趣[5]。本實驗擬通過CCl4誘導的大鼠肝纖維化模型，檢測大鼠血清及肝組織中HMGB1的含量，觀察大鼠肝組織病理學及血清肝功能指標、早期炎癥因子的變化，并探索其中的內在聯系，初步探討老鼠簕生物堿A基于HMGB1 抗肝纖維化的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 受試藥物與試劑 HBOA 由廣西醫(yī)科大學藥學院藥物化學教研室合成，純度為0.9937；秋水仙堿購于西雙版納藥業(yè)有限責任公司(批號：140515)；CCl4、羧甲基纖維素鈉購于西隴化工股份有限公司；ALT、AST及T-BIL試劑盒購于南京建成生物工程研究所；大鼠HMGB1、IL-1β及TNF-α ELISA 試劑盒、HMGB1兔多克隆抗體、兔IgG-免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒均購于武漢博士德生物工程有限公司；引物、RNAiso Plus、Prime Script RT Master Mix、SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ購于日本TaKaRa公司。

1.1.2 儀器 TGL-16G-A高速冷凍離心機(上海安享科學儀器廠)；電熱恒溫水浴箱(北京塞多利斯儀器系統有限公司)；ND-2010 型紫外可見分光光度計(美國Thermo Fisher Scientific)；連續(xù)光譜掃描式酶標儀(香港分子儀器公司)；CX-41型倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；ABI7300實時熒光定量PCR儀(應用生物系統公司)。

1.1.3 動物 SD大鼠，60只，♂，180 g～220 g，由廣西醫(yī)科大學實驗動物中心提供(許可證號：SCXK桂 2015-0002，實驗單位使用許可證編號：SYXK桂 2011-0005)。于室溫(23±2)℃、濕度(60±20)%、標準光線環(huán)境下飼以我校實驗動物中心提供的專業(yè)飼料，飼養(yǎng)期間大鼠均自由攝食、飲水。

1.2 方法

1.2.1 動物分組與干預 60只SD大鼠適應飼養(yǎng)1周后，其中50只大鼠灌胃予以體積分數為0.40的CCl4橄欖油溶液3 mL·kg-1建立肝纖維化模型，首劑加倍，每周2次，共12周。剩余10只大鼠設為正常對照組，僅灌胃相應體積生理鹽水。第8周，取10只模型對照組大鼠HE 染色病理檢測結果證實大鼠肝纖維化模型成立后，將大鼠隨機分為模型對照組(MC)、秋水仙堿組(Colchicine)、HBOA 高劑量組(HH)、HBOA 低劑量組(HL)，每組各10只，以及正常對照組(NC)10只。從第9周開始，秋水仙堿組灌胃給予秋水仙堿混懸液(0.4 mg·kg-1)；HBOA高劑量組(100 mg·kg-1)、HBOA 低劑量組(50 mg·kg-1)灌胃予以質量濃度為6 g·L-1的羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)配制成的HBOA混懸液(溶液現配現用)；模型對照組及正常對照組灌胃給予相應體積CMC-Na 溶液10 mL·kg-1，連續(xù)4周。

1.2.2 取材 12周后，大鼠用10%的水合氯醛麻醉，腹主動脈抽血，經3 000 r·min-1離心10 min后，分離血清于-80 ℃保存?zhèn)溆?。同時取相同部位肝左葉約1 cm×1 cm 大小，用10%的福爾馬林固定，石蠟包埋切片，病理切片行常規(guī)HE及Masson染色，光鏡下觀察肝組織病理變化。將部分肝組織用4%的多聚甲醛保存，用于制作免疫組化切片，其余肝臟置于-80 ℃冰箱備用。

1.2.3 血清觀察指標 肝功能指標 ALT、AST、T-BIL嚴格根據試劑盒說明書指示方法檢測。酶聯免疫吸附法(ELISA)測定血清中HMGB1、IL-1β、TNF-α 的水平。

1.2.4 大鼠肝組織中HMGB1蛋白及mRNA表達分析 采用免疫組化SP法測定肝組織中HMGB1蛋白的表達，脫蠟、抗原修復、阻斷內源性過氧化物酶、封閉、滴加一抗及二抗、染色均嚴格按照說明書步驟操作。采用自來水浸泡10 min返藍后，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，鏡檢。采用Image-Pro Plus軟件分析免疫組化圖片光密度(IOD)值。 根據Genbank大鼠HMGB1、GAPDH引物序列設計HMGB1及GAPDH的上、下游引物(Tab 1)。嚴格根據RNAiso Plus 試劑盒說明書提取大鼠肝臟總RNA，紫外分光光度計測定RNA濃度，A260/280均為1.8～2.0，純度符合要求。通過RNA 20 μL逆轉錄體系，在37 ℃15 min、85 ℃ 5 s、4 ℃條件下逆轉錄得到cDNA。實時熒光定量PCR 采用兩步法：95℃ 30 s預變性；95 ℃ 5 s變性、60 ℃ 31 s退火， 共40個循環(huán)進行cDNA擴增。

Tab 1 Primer sequences of HMGB1 and GAPDH

2 結果

2.1 肝組織病理學變化 HE染色結果可見,正常對照組肝小葉的結構完整，肝細胞排列整齊，肝索結構清晰，無炎癥細胞浸潤(Fig 1A)；模型對照組可見肝小葉被破壞，肝細胞結節(jié)、脂肪變性、氣球樣變性及壞死，炎癥細胞浸潤，肝索排列紊亂，伴肝纖維化(Fig 1B)；秋水仙堿組及HBOA高、低劑量組對纖維組織增生情況均有明顯的改善，肝組織肝小葉結構已恢復至正常，肝細胞變性、壞死及炎性細胞浸潤程度也明顯減少(Fig 1C、Fig 1D、Fig 1E)。Masson染色結果顯示，正常對照組大鼠肝細胞完整，僅于匯管區(qū)及中央靜脈有少量膠原纖維存在,無纖維組織增生(Fig 2A); 模型對照組大鼠肝組織中大量膠原纖維增生，匯管區(qū)呈明顯的橋樣纖維化，并向肝小葉內延伸，形成較粗大的纖維間隔(Fig 2B)；秋水仙堿組及 HBOA 高、低劑量組大鼠肝組織中膠原纖維增生較模型對照組明顯減少，僅分布于匯管區(qū)及血管周圍，且纖維間隔薄，不完全分割肝小葉，其中HBOA 高劑量組肝組織結構趨向正常(Fig 2C、2D、 2E)。 各組大鼠肝纖維化程度按Ishak 評分系統分期及計分。分期結果顯示，模型對照組主要分布在F4-F5期，秋水仙堿組主要分布在F2-F3期，HBOA高劑量組分布在F0-F1期，HBOA低劑量組主要分布在F2-F4期(Tab 2)。

2.2 HBOA降低CCl4性肝纖維化大鼠血清中的AST、ALT 及T-BIL 與正常對照組比較，模型對照組血清中的AST、ALT 及T-BIL含量明顯升高(P<0.01)；與模型對照組比較，HBOA 高劑量組可降低血清中的AST、ALT 及T-BIL 水平(P<0.01)(Fig 3)。

Fig 1 Rat liver histopathological changes observed by HE staining in different groups(×100)

Fig 2 Changes of rat liver tissue collagen observed by Masson staining in different groups(×100)

GroupDose/mg·kg-1nStageofliverfibrosis0123456Scoreofliverfibrosis(x±s)Normal-10100000001.10±1.52Model-8000133113.25±3.24**Colchicine0.4901331108.11±3.44##HBOA1001043111004.80±4.05##50801322008.13±3.52##

**P<0.01vsnormal;##P<0.01vsmodel

2.3 HBOA 降低CCl4性肝纖維化大鼠血清中的炎癥因子含量 由ELISA結果可見，與正常對照組比較，模型對照組血清中的HMGB1、IL-1β及TNF-α含量明顯升高(P<0.01)；與模型對照組比較，HBOA高劑量組明顯降低血清中的HMGB1、IL-1β及TNF-α水平(P<0.01)(Fig 4)。

2.4 HBOA減少CCl4性肝纖維化大鼠肝組織中HMGB1蛋白及mRNA的表達 免疫組化法結果可見(Fig 5A)，與正常對照組比較，模型對照組肝組織中的HMGB1 含量明顯升高(P<0.01)；與模型對照組比較，HBOA高、低劑量組均明顯降低肝組織中的HMGB1水平(P<0.01)。同時，實時熒光定量PCR結果可見(Fig 5B)，與正常對照組比較，模型對照組肝組織中HMGB1 mRNA表達水平明顯升高(P<0.01)；與模型對照組比較，HBOA高、低劑量組均明顯降低肝組織中的HMGB1 mRNA表達水平(P<0.01)。

3 討論

肝星狀細胞(hepatic stellate cells，HSCs)是肝纖維化的關鍵細胞，在肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮核心作用，其活化調控被視為抗肝纖維化的治療靶標[6]。當肝臟受到各種急、慢性炎癥刺激后，可激活HSCs，使其變?yōu)榧〕衫w維細胞，最終合成及分泌大量的細胞外基質(ECM)沉積于肝臟內，啟動肝纖維化的病理過程[7]?？梢?，慢性炎癥反應是肝纖維化發(fā)生、發(fā)展的重要因素。

炎癥因子HMGB1是一種高度保守的染色體相關蛋白，具有出現晚、作用持久的特點。在正常情況下，HMGB1在細胞核內不參與炎癥反應。然而，當機體受到刺激而產生反應時，HMGB1不僅可由激活的巨噬細胞、成熟的樹突細胞(mDC)及自然殺傷(NK)細胞主動分泌，還可由壞死細胞被動釋放至細胞外，在胞外作為損傷相關分子模式(DAMPs)成員之一，具有強大的致炎細胞因子活性，在細胞外參與多種病理過程[8]。在肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展中，HMGB1作為晚期炎癥介質，成為慢性炎癥持續(xù)存在并持久激活HSCs的基礎。HMGB1可通過晚期糖基化受體(RAGE)及 Toll 樣受體(TLRs)啟動和增強多個通路[9-10]，如 TLR4-MyD88-NF-κB 通路，激活內皮細胞，促使其產生炎癥細胞因子如IL-1β、TNF-α 等，而產生的IL-1β、TNF-α 又可與HMGB1相互刺激、促進，致使HMGB1 大量釋放，最終形成一個完整的回路，引起瀑布樣的級聯反應，造成炎癥反應的失控遷延，增強肝臟損傷和炎癥[11]。

Fig 3 Effects of HBOA on serum AST,ALT and T-BIL in CCl4-induced liver fibrosis rats

A: AST; B: ALT; C: T-BIL.**P<0.01vsnormal control;##P<0.01vsmodel control

Fig 4 Effects of HBOA on serum HMGB1,IL-1β and TNF-α in CCl4-induced liver fibrosis rats

A:HMGB1;B:IL-1β;C:TNF-α.**P<0.01vsnormal control;##P<0.01vsmodel control

Bai等[12]發(fā)現，抑制HMGB1 能降低IL-1β、TNF-α 的表達，減輕肝臟炎性反應，減輕肝纖維化程度。然而，僅給予早期炎癥因子例如IL-1β、TNF-α 的拮抗劑，并不能阻止肝纖維化病情進展[13]。所以，考慮是否是HMGB1的大量釋放，導致HSCs持續(xù)激活，致使ECM 堆積，導致肝纖維化的發(fā)生。

Fig 5 Effect of HBOA on tissue expression of HMGB1 protein and mRNA in CCl4-induced liver fibrosis rats

A:HMGB1 protein; B: HMGB1 mRNA.**P<0.01vsnormal control;##P<0.01vsmodel control

綜上所述，HBOA能夠減輕CCl4所致大鼠肝纖維化程度，其作用機制可能與抑制晚期炎癥因子HMGB1表達有關。最終通過上游通路減少其他炎癥因子IL-1β 、TNF-α 等的釋放，又通過下游通路減少細胞損傷引起的肝細胞凋亡、壞死及巨噬細胞系統激活而產生HMGB1，降低炎癥反應，從而減少HSC活化，抑制ECM產生，最終減輕肝纖維化程度。然而，其具體的分子生物學機制還有待進一步研究。

Fig 6 Relation between serum HMGB1 level and liver function，inflammatory cytokines

A: The relation of HMGB1 to liver function index; B: The relation of HMGB1 to IL-1β and TNF-α

(致謝:本實驗在廣西醫(yī)科大學藥理學實驗室、實驗動物中心及醫(yī)學科學實驗中心完成。感謝實驗室老師們在實驗期間的幫助。)

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Anti-hepatic fibrotic mechanism ofAcanthusilicifoliusalkaloid A involved in high mobility group box 1

MO Si-yan, WEI Ming-zhong, QIU Jin-hui, ZHU Xun-shuai, LIU Lin, LIN Jun

(DeptofPharmacology，SchoolofPharmacy,GuangxiMedicalUniversity，Nanning530021，China)

Aim To investigate anti-hepatic fibrotic mechanism ofAcanthusilicifoliusalkaloid A(HBOA)involved in high mobility group box 1(HMGB1).Methods A hepatic fibrosis model of rat was established by the olive oil of CCl4for 12 weeks. Then, at the 8th week,the successful model rats were randomly divided into model control group,colchicine group, HBOA high-dose group and HBOA low-dose group. From the 9th week,the rats in each group were treated with the drugs daily for 4 weeks respectively. The changes of liver histopathology and collagen were observed by HE staining and Masson staining, and the serum indicators including aspartate aminotransferase(AST),alanine aminotransferase(ALT) , total bilirubin(T-BIL), HMGB1,interleukin-1β(IL-1β) and tumor necrosis factor-α(TNF-α) were determined. Moreover, the protein of HMGB1 in liver was examined by immunohistochemistry, and the expression of HMGB1 mRNA was measured by real-time fluorescence quantitative PCR.Results Compared with the model control group，HBOA high-dose and HBOA low-dose groups significantly attenuated the fibrotic degree induced by CCl4, markedly decreased the levels of ALT,AST,T-BIL, HMGB1, IL-1β,TNF-α. Moreover, the expression of HMGB1 protein and mRNA in liver was decreased. And furthermore, serum HMGB1 level had significant positive correlation with IL-1β,TNF-α,ALT,AST and T-BIL.Conclusion HBOA has beneficial effects against liver fibrosis in rat which is induced by CCl4, the mechanisms may be related to the inhibition of inflammatory response to HMGB1.

high mobility group box 1;Acanthusilicifoliusalkaloid A; hepatic fibrosis; CCl4; inflammatory factor;rat

2016-07-14，

2016-08-13

廣西高?？茖W技術研究項目(No 201106LX095)；廣西省自然科學基金資助項目(No 2013YB054)

莫思燕(1988-)，女，碩士生，研究方向：中藥藥理學，E-mail:d-v-wade2007@163.com；

林 軍(1962-)，男，博士，教授，研究方向：中藥藥理學，通訊作者，Tel:0771-5358272,E-mail: junlin989@sina.com

時間：2016-10-20 10:29

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20161020.1029.030.html

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.11.015

A

1001-1978(2016)11-1553-06

R-332；R322.47；R392.12；R575.2；R977.6