薛毅輝 陳富勇 吳贊藝 王燈亮 葛洪良

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科，福建 福州 350005)

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Nrf2-抗氧化反應(yīng)元件信號(hào)通路對(duì)腦損傷大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用及機(jī)制

薛毅輝 陳富勇1吳贊藝 王燈亮 葛洪良

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)外科，福建 福州 350005)

目的 研究Nrf2-抗氧化反應(yīng)元件(ARE)信號(hào)通路對(duì)腦損傷大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用及機(jī)制。方法 將60只SD大鼠隨機(jī)分為2組，其中假手術(shù)組4只，模型組56只。模型組分為A組和B組：A組于手術(shù)前24 h腹腔注射特丁基對(duì)苯二酚(tBHO)50 mg/kg(5 mg/ml)，B組注射等量生理鹽水。比較假手術(shù)組和模型組術(shù)后神經(jīng)行為評(píng)分、腦組織含水量和神經(jīng)細(xì)胞凋亡率。比較A組和B組不同時(shí)刻(術(shù)后1、3、6、12、24 h，3、7 d)的單核細(xì)胞血紅素氧合酶(HO)-1、醌氧化還原酶(NQO)1、谷胱甘肽(GSH)和活性氧(ROS)水平。結(jié)果 各組神經(jīng)行為評(píng)分，腦組織含水量，凋亡率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。各組術(shù)后不同時(shí)刻的HO-1、NQO1、 GSH和 ROS水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 Nrf2-ARE通路主要通過(guò)上調(diào)下游抗氧化酶的表達(dá)發(fā)揮對(duì)腦損傷大鼠神經(jīng)保護(hù)作用。

Nrf2-ARE通路；腦損傷；氧化應(yīng)激反應(yīng)；抗氧化酶

顱腦損傷的病理生理過(guò)程包括原發(fā)性和繼發(fā)性腦損傷，其特點(diǎn)是腦皮質(zhì)及白質(zhì)搓碎、破裂，出血、水腫，血管栓塞，部分神經(jīng)細(xì)胞壞死；后者包括一系列的損傷級(jí)聯(lián)反應(yīng)，主要包括氧化應(yīng)激、炎癥和神經(jīng)細(xì)胞凋亡等，其中氧化應(yīng)激是繼發(fā)性腦損傷的病理生理機(jī)制〔1〕。針對(duì)顱腦損傷的復(fù)雜病理生理機(jī)制，臨床上尚未出現(xiàn)有效的干預(yù)措施，故患者預(yù)后較差。目前，Nrf2-抗氧化反應(yīng)元件(ARE)通路在腦損傷中的作用引起了較為廣泛的關(guān)注〔2〕，本次研究旨在探討Nrf2-ARE信號(hào)通路對(duì)腦損傷大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用及機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 動(dòng)物、主要儀器及試劑 SD大鼠60只，體重為200～220 g，平均(210.0±6.2)g，由福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)14-0212。主要儀器及試劑為Elx800光吸收酶標(biāo)儀〔美國(guó)伯騰(北京)儀器有限公司〕、改良液壓沖擊裝置(中國(guó)天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院)、BX53電子顯微鏡(日本奧林巴斯公司)、Image-Pro Insight 圖像分析軟件(廣州市明美光電技術(shù)有限公司)、Gallios流式細(xì)胞儀(美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司)、特丁基對(duì)苯二酚(tBHQ，上海棋成實(shí)業(yè)有限公司)、細(xì)胞凋亡測(cè)試盒(UNNEL法，上海博耀生物科技有限公司)、抗Nrf2抗體和抗β-actin抗體〔艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司〕、大鼠單核細(xì)胞血紅素氧合酶(HO)-1單克隆抗體(上海鈺博生物科技有限公司)、大鼠醌氧化還原酶(NQO)1單克隆抗體(上海古朵生物科技有限公司)、大鼠谷胱甘肽(GSH)ELISA分析檢測(cè)試劑盒(上海喬羽生物科技有限公司)、活性氧(ROS)檢測(cè)試劑盒(上海研拓生物科技有限公司)、羊抗鼠多克隆抗體(北京中杉金橋公司)、蛋白定量檢測(cè)試劑盒(美國(guó)Pierce公司)、電化學(xué)發(fā)光(ECL)底物(瑞典CE life science公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及模型構(gòu)建 對(duì)大鼠進(jìn)行分組，其中假手術(shù)組4只，模型組56只。均進(jìn)行適應(yīng)性培養(yǎng)1 w。大鼠實(shí)驗(yàn)前禁食12 h：模型組根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法分為A組，術(shù)前24 h給予腹腔注射N(xiāo)rf2激動(dòng)劑tBHQ，每隔8 h給藥1次(5 mg/ml)，每次劑量為16.7 mg/kg，共3次，總計(jì)50 mg/kg；B組同時(shí)給予等量生理鹽水。大鼠經(jīng)2%戊巴比妥鈉(40 mg/kg體重)腹腔麻醉后，在無(wú)菌條件下沿頭部正中矢狀位切開(kāi)皮膚、皮下組織，剝離顱骨外膜，在距離矢狀縫、冠狀縫5 mm處用磨鉆鉆取直徑0.5 cm的小孔，保持硬腦膜完整，使用改良液壓沖擊裝置造模，壓力為0.2 MPa。假手術(shù)組常規(guī)麻醉、開(kāi)顱，但不行液壓沖擊。觀察大鼠恢復(fù)自主呼吸即放回飼養(yǎng)籠，進(jìn)行損傷后觀察〔3〕。 分別將A組4只大鼠和B組4只大鼠于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)處死，取材對(duì)腦挫傷灶及其周?chē)鷧^(qū)進(jìn)行組織學(xué)觀察。

1.3 大鼠的神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分 術(shù)后24 h進(jìn)行大鼠腦損傷神經(jīng)功能評(píng)分，采用雙盲法〔4〕。

1.4 腦組織含水量測(cè)定 術(shù)后24 h用濾紙吸除標(biāo)本表面水分，分析天平稱(chēng)濕重后于110℃恒溫干燥箱內(nèi)干燥24 h至 恒重，稱(chēng)干重后按Elliot公式〔腦含水量=(濕重-干重)/濕重×100%〕計(jì)算腦含水量〔5〕。

1.5 組織學(xué)觀察 ①神經(jīng)細(xì)胞凋亡率：術(shù)后24 h取腦組織進(jìn)行組織染色的標(biāo)本用4%多聚甲醛固定并進(jìn)行組織學(xué)檢查。對(duì)組織進(jìn)行轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的三磷酸脫氧鳥(niǎo)苷-生物素刻痕末端標(biāo)記(TUNEL)染色并在顯微鏡下(×400)觀察凋亡細(xì)胞(細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃染顆粒)，在鏡下分5個(gè)視野計(jì)數(shù)細(xì)胞并計(jì)算凋亡率。凋亡率=(凋亡細(xì)胞/總細(xì)胞數(shù))×100.00%。②大鼠Nrf2表達(dá)水平檢測(cè)：手術(shù)后1、6、12、24 h，3、7 d采用Western印跡檢測(cè)大鼠Nrf2表達(dá)水平。取新鮮腦組織裂解、勻漿后取上清液，蛋白定量后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳、電轉(zhuǎn)移和膜封閉，封閉結(jié)束后分別滴加Nrf2大鼠單抗4℃孵育過(guò)夜。加入二抗室溫下于搖床孵1 h，二抗孵育后顯色、曝光、顯影。測(cè)量并分析上述蛋白的光密度值，并以β-actin為內(nèi)參計(jì)算相對(duì)光密度值(ROD)。③大鼠抗氧化與氧化物質(zhì)水平的檢測(cè)：別于手術(shù)后1、6、12、24 h，3、7 d檢測(cè)大鼠HO-1，NQO1，GSH和ROS水平。HO-1和NQO1采用Western印跡法，方法同②。 GSH采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)，ROS檢測(cè)采用流式細(xì)胞法，操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分及腦組織含水量 各組神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分和腦組織含水量差異顯著(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.2 大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡率比較 假手術(shù)組神經(jīng)細(xì)胞凋亡率(1.17±0.23)%，A組(23.98±4.17)%，B組(47.65±8.96)%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=7.984，P<0.05)。

2.3 大鼠不同時(shí)點(diǎn)的Nrf2表達(dá)水平比較 A組和B組術(shù)后不同時(shí)點(diǎn)的Nrf2的ROD高于假手術(shù)組，A組和B組不同時(shí)刻的Nrf2ROD不同(P<0.05)。見(jiàn)表2。

2.4 大鼠不同時(shí)點(diǎn)HO-1、NQO1、 GSH和 ROS水平 各組術(shù)后不同時(shí)點(diǎn)HO-1、NQO1、 GSH和 ROS水平差異顯著(P<0.05)。見(jiàn)表3、表4。

表1 各組神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分及腦組織含水量比較±s,n=4)

與假手術(shù)組相比：1)P<0.05

表2 各組術(shù)后不同時(shí)點(diǎn)Nrf2 ROD水平比較

與A組比較：1)P<0.05

表3 各組術(shù)后不同時(shí)點(diǎn)HO-1和NQO1水平比較

表4 各組術(shù)后不同時(shí)點(diǎn)GSH和ROS水平比較

3 討 論

顱腦損傷的病理生理過(guò)程包括機(jī)械性沖擊造成的原發(fā)性損傷和損傷后啟動(dòng)的一系列生化過(guò)程引起的繼發(fā)性、進(jìn)行性神經(jīng)細(xì)胞損傷即繼發(fā)性腦損傷〔6〕。后者則一般持續(xù)數(shù)小時(shí)至數(shù)天，是在首次損傷后啟動(dòng)的包括一系列生化降解過(guò)程的損傷級(jí)聯(lián)反應(yīng)，主要包括興奮性氨基酸毒性、氧化應(yīng)激、炎癥和凋亡，由自由基造成的氧化損傷成為繼發(fā)性腦損傷的重要原因之一〔7，8〕。為改善顱腦損傷者的預(yù)后，臨床上除避免或減輕原發(fā)性腦損傷外，還應(yīng)該對(duì)繼發(fā)性腦損傷進(jìn)行干預(yù)。

顱腦損傷大鼠存在氧化應(yīng)激、鈣紊亂、線粒體毒性、炎癥和凋亡等一系列病理生理變化：同時(shí)，大鼠體內(nèi)存在抗氧化應(yīng)激系統(tǒng)〔9〕。Nrf2反應(yīng)性表達(dá)增加，引起下游ARE元件及包含的HO-1和NQO1等抗氧化酶的表達(dá)水平增高，從而發(fā)揮抗氧化作用。大鼠術(shù)后的GSH水平明顯降低，而ROS水平增加，說(shuō)明抗氧化能力減弱。Nrf2是具有基本亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)的一種核轉(zhuǎn)錄因子，正常情況下存在于胞質(zhì)內(nèi)，一種Keap1蛋白可以特異結(jié)合在Nrf2的氨基端，使Nrf2的活性受到抑制。當(dāng)誘導(dǎo)劑存在的情況下，Nrf2磷酸化，向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移。磷酸化的Nrf2進(jìn)入核內(nèi)后，通過(guò)P38/ERK/JNK途徑與Maf蛋白形成異二聚體，并與ARE結(jié)合〔10〕。ARE是順式作用元件的一段增強(qiáng)子序列，NQO1、HO-1等基因序列中都存在ARE序列。因此，ARE介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)參與氧化應(yīng)激的基因轉(zhuǎn)錄水平的激活，Nrf2-ARE信號(hào)的激活能夠上調(diào)多種抗氧化酶、解毒酶的表達(dá)，抑制炎性反應(yīng)，強(qiáng)力升高細(xì)胞保護(hù)功能〔11〕。本研究說(shuō)明Nrf2-ARE通路對(duì)腦損傷大鼠的神經(jīng)系統(tǒng)具有保護(hù)作用，而tBHQ的可以通過(guò)上調(diào)Nrf2表達(dá)減輕大鼠的腦水腫和神經(jīng)細(xì)胞凋亡〔12〕。

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〔2015-02-19修回〕

(編輯 苑云杰)

福建省屬高?？蒲袑?zhuān)項(xiàng)項(xiàng)目(No.JK2012021)

薛毅輝(1962-)，男，副主任醫(yī)師，主要從事顱腦損傷和顱底中線腫瘤研究。

R285.6

A

1005-9202(2016)20-4953-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.20.006

1 深圳市第二人民醫(yī)院功能神經(jīng)科