尹淑杰 張 濤 榮光影 宋慶嬌 汪 悅 柳朝陽

(佳木斯大學(xué)，黑龍江 佳木斯 154007)

?

川芎嗪對(duì)阿爾茨海默病大鼠學(xué)習(xí)記憶能力和細(xì)胞周期蛋白E、P21表達(dá)的影響

尹淑杰1張 濤 榮光影 宋慶嬌 汪 悅 柳朝陽2

(佳木斯大學(xué)，黑龍江 佳木斯 154007)

目的 探討川芎嗪(TMP)對(duì)阿爾茨海默病(AD)模型大鼠學(xué)習(xí)記憶和細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)E、P21表達(dá)的影響及作用機(jī)制。方法 大鼠海馬區(qū)注入β淀粉樣蛋白(Aβ)1～42制作AD模型。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力；免疫組化法檢測(cè)海馬區(qū)CyclinE和P21蛋白的表達(dá)。結(jié)果 低、高劑量TMP組均能改善 AD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力(P<0.01，P<0.05),下調(diào)大鼠海馬CyclinE蛋白表達(dá)(P<0.05),上調(diào)P21蛋白表達(dá)(P<0.05)。低、高劑量TMP組相比無明顯差異。結(jié)論 TMP能改善AD大鼠學(xué)習(xí)記憶功能,下調(diào)CyclinE蛋白和上調(diào)P21蛋白表達(dá)，減輕神經(jīng)細(xì)胞凋亡。

川芎嗪；阿爾茨海默病；細(xì)胞凋亡

阿爾茨海默病(AD)的病理特征為神經(jīng)元纖維纏結(jié)、老年斑和神經(jīng)元廣泛丟失等〔1〕。有研究表明〔2〕細(xì)胞凋亡是引起大量神經(jīng)元丟失的主要原因之一，細(xì)胞凋亡可通過細(xì)胞周期蛋白的異常表達(dá)介導(dǎo)〔3〕。故通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)可以減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡，延緩AD發(fā)病。本實(shí)驗(yàn)采用β-淀粉樣蛋白(Aβ)1～42海馬區(qū)注入制作 AD 模型，觀察川芎嗪(TMP)對(duì)AD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及海馬區(qū)細(xì)胞周期蛋白E(CyclinE)和P21蛋白表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 采用10～14月齡SD大鼠，體重 210～230 g，佳木斯大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 主要試劑 磷酸川芎嗪片(北京市燕京制藥廠,50 mg/片,批號(hào)030201)；Aβ1～42(Sigma公司)；兔抗大鼠CyclinE多克隆抗體，兔抗大鼠P21多克隆抗體，免疫組化試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 AD模型建立〔4〕和動(dòng)物分組 大鼠麻醉后，固定在顱腦立體定位儀，暴露前囟，按大鼠腦立體定位圖譜進(jìn)行定位，在前囟后方 3.3 mm、中線左右各旁開1.9 mm穿顱鉆一小孔(直徑約1 mm)，將微量注射器垂直插入，緩慢進(jìn)針2.4 mm 至海馬，分別注入Aβ1～425 μl，注射后留針 5 min，緩慢拔針。術(shù)后牙托粉封固顱骨孔,青霉素預(yù)防感染。

將40只SD大鼠隨機(jī)分為五組(每組8只)：正常對(duì)照組、假手術(shù)組、AD模型組、TMP低劑量組(150 mg·kg-1·d-1)(L-TMP組)、TMP高劑量組(250 mg·kg-1·d-1)(H-TMP組)。

1.3.2 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)〔5〕造模后第7天起進(jìn)行水迷宮實(shí)驗(yàn)，連續(xù)5 d，前4 d作逃避潛伏期實(shí)驗(yàn)。在水迷宮中央隱蔽平臺(tái)的位置，將大鼠頭朝外壁在任何一個(gè)象限內(nèi)的隨機(jī)位置放入水中，潛伏期是指大鼠在120 s內(nèi)從入水點(diǎn)爬到平臺(tái)所需時(shí)間。實(shí)驗(yàn)中，如果在120 s內(nèi)大鼠找到平臺(tái)，讓大鼠站立在平臺(tái)上10 s；如果找不到，引導(dǎo)大鼠爬上平臺(tái)，并站立10 s，潛伏期計(jì)為120 s。空間探索實(shí)驗(yàn)在第5天進(jìn)行，平臺(tái)撤掉，從第二象限任何點(diǎn)放大鼠入水，記錄大鼠在120 s內(nèi)的游泳路徑,計(jì)算大鼠在入水象限游泳路徑長度占總路徑長度的百分比。Morris水迷宮圖像處理系統(tǒng)完成數(shù)據(jù)采集和處理。

1.3.3 免疫組化法檢測(cè)大鼠海馬CyclinE和P21蛋白的表達(dá) 取大鼠海馬組織于4%多聚甲醛中固定24 h,進(jìn)行乙醇系列脫水、二甲苯透明、常規(guī)石蠟包埋,制成4 μm厚連續(xù)切片。切片常規(guī)脫蠟至水,高壓修復(fù)抗原,冷卻后磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌,滴加適當(dāng)稀釋的一抗,37℃恒溫水浴箱孵育2 h,滴加二抗,二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色,蘇木素復(fù)染,脫水,透明,封片。經(jīng)DAB顯色,CyclinE和P21陽性細(xì)胞為黃褐色。 用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。 在CyclinE和P21免疫組化染色切片的海馬區(qū)各取3個(gè)視野(×400),應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)測(cè)量每個(gè)視野內(nèi)CyclinE和P21陽性細(xì)胞數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS11.0軟件行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果 與正常對(duì)照組相比，在前4 d逃避潛伏期實(shí)驗(yàn)中，AD模型組潛伏期明顯延長(P<0.01)；與正常對(duì)照組相比，在第5天空間探索實(shí)驗(yàn)中，AD模型組穿越平臺(tái)象限路徑占總路徑百分比降低(P<0.05)。與AD模型組相比，低、高劑量TMP組逃避潛伏期和穿越平臺(tái)象限路徑百分比明顯改善(P<0.01，P<0.05)。高劑量TMP組較低劑量TMP組有所改善，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。正常對(duì)照組和假手術(shù)組逃避潛伏期和穿越平臺(tái)象限路徑比無顯著差異(P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果

與正常對(duì)照組相比：1)P<0.01，2)P<0.05；與AD模型組相比:3)P<0.01，4)P<0.05

2.2 免疫組化檢測(cè)CyclinE和P21蛋白表達(dá)結(jié)果 與正常對(duì)照組相比，假手術(shù)組CyclinE和P21表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)無顯著差異(P>0.05)，而AD模型組大鼠海馬組織CyclinE陽性細(xì)胞數(shù)明顯增加(P<0.05)，P21陽性細(xì)胞數(shù)明顯減少(P<0.01)；與AD模型組相比,TMP各組CyclinE陽性細(xì)胞數(shù)明顯減少(P<0.05)，P21陽性細(xì)胞數(shù)明顯增加(P<0.05)；低、高劑量TMP組相比，CyclinE和P21陽性細(xì)胞數(shù)均無顯著性差異(P>0.05)。提示TMP能減少CyclinE的表達(dá)和增加P21的表達(dá)。見表 2。

表2 各組大鼠海馬CyclinE和P21表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)

與正常對(duì)照組相比：1)P<0.01，2)P<0.05；與AD模型組相比:3)P<0.05

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)中AD大鼠學(xué)習(xí)能力和記憶保持能力明顯降低，TMP治療后AD大鼠的學(xué)習(xí)能力和記憶保持能力得以明顯改善。細(xì)胞凋亡是引起AD病理特征之一的神經(jīng)元喪失的主要機(jī)制〔6〕。Cyclin、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子(CKI)相互作用調(diào)控細(xì)胞周期，使細(xì)胞分裂正常進(jìn)行。如果Cyclin、CDK或CKI三者的平衡被打破，細(xì)胞周期將重啟進(jìn)入有絲分裂，后期出現(xiàn)障礙，細(xì)胞分裂失敗，細(xì)胞周期停滯，形成細(xì)胞凋亡〔7〕。

AD病人正常的腦神經(jīng)細(xì)胞已停止分化處于G0期。Vincent等〔8〕發(fā)現(xiàn)，AD患者腦中有神經(jīng)元重新進(jìn)入細(xì)胞周期，由于CKI失活，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞經(jīng)過G1/S期檢驗(yàn)點(diǎn)，DNA復(fù)制后進(jìn)入G2期，但是細(xì)胞不能進(jìn)行正常的分裂，凋亡程序啟動(dòng)，細(xì)胞凋亡引發(fā)〔3〕。

CyclinE與CDK2結(jié)合在 G1/S 期啟動(dòng)和運(yùn)行中發(fā)揮作用。CyclinE可激活視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白(pRb)，使其與轉(zhuǎn)錄因子(E2F)解離，E2Fs可促進(jìn)形成CyclinE-CDK2復(fù)合體，使細(xì)胞越過G1/S期檢驗(yàn)點(diǎn)，進(jìn)入S期，CyclinE-CDK2復(fù)合體進(jìn)一步磷酸化pRb，使E2F充分釋放，促進(jìn)有關(guān)S期DNA復(fù)制的基因表達(dá)〔9〕。

P21屬于CKI家族成員，可結(jié)合并抑制CyclinE-CDK2等復(fù)合物的磷酸化活性，使Rb低磷酸化不能解離E2F而致DNA合成障礙，使細(xì)胞停滯在G1期。另外，P21分子可與增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)結(jié)合，使PCNA不能與DNA聚合酶形成δ復(fù)合物，影響DNA的復(fù)制〔10〕，從而阻止細(xì)胞重新進(jìn)入分裂周期失敗而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

CyclinE在G1期表達(dá)，CyclinE-CDK2復(fù)合體正性調(diào)控細(xì)胞周期，而P21負(fù)性調(diào)控細(xì)胞周期，CyclinE與P21表達(dá)紊亂可引發(fā)細(xì)胞周期紊亂。

本文結(jié)果顯示，大鼠海馬區(qū)注入Aβ1～42后，可上調(diào)CyclinE表達(dá)，啟動(dòng)了神經(jīng)元的細(xì)胞周期；同時(shí)由于其神經(jīng)毒性，使P21的表達(dá)抑制，打破細(xì)胞周期的平衡狀態(tài)，引發(fā)細(xì)胞凋亡。TMP可通過下調(diào)CyclinE蛋白表達(dá)和上調(diào)P21蛋白表達(dá)阻止細(xì)胞重新進(jìn)入細(xì)胞周期，減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡，從而延緩AD大鼠腦神經(jīng)病理進(jìn)程，減少Aβ對(duì)腦細(xì)胞神經(jīng)元的損傷，進(jìn)而改善大鼠學(xué)習(xí)記憶能力。

1 Petrella JR,Coleman RE,Doraiswamy PM.Neuroimaging and early diagnosis of Alzheimer's disease:a look to the future〔J〕.Radiology，2003;226(2):315-36.

2 黃文林，朱孝峰.信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)〔M〕.北京:人民衛(wèi)生出版社，2007:345-7.

3 McPhie DL，Coopersmith R，Hines-Peralta A，etaI.DNA synthesis and neuronal apoptosis caused by familial Alzheimer's disease mutants of the amyloid precursor protein are mediated by the p21 activated kinase PAK3 〔J〕.J Neurosci，2003;23(17)：6914-27.

4 朱飛奇，馬 英，錢采韻.大鼠海馬立體定向注射Aβ 1-40建立阿爾茨海默病動(dòng)物模型〔J〕.鄖陽醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2008;27(2):106-8.

5 劉潔生，陳 式，謝麗玲，彭志英.K-銀環(huán)蛇毒素對(duì)小鼠被動(dòng)學(xué)習(xí)和空間記憶的影響〔J〕.衛(wèi)生研究,1998;27(S1):96-9.

6 莊 瑩，陳 杰.阿爾茨海默病病因及發(fā)病機(jī)制研究進(jìn)展〔J〕.吉林醫(yī)藥學(xué)院學(xué)報(bào)，2008;29(2)：101-4.

7 謝朝陽，祝其鋒.細(xì)胞周期調(diào)控與阿爾茨海默病的研究進(jìn)展〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2004;24(4)：379-81.

8 Vincent I,Rosado M,Davies P.Mitotic mechanisms in Alzheimer's disease〔J〕?J Cell Biol,1996;132(3):413-25.

9 Obaya AJ,Sedivy JM.Regulation of cyclin-Cdk activity in mammalian cells〔J〕.Cell Mol Life Sci,2002;59(1):126-42.

10 馬 驥，劉文超.細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑與腫瘤相關(guān)性的研究進(jìn)展〔J〕.中國腫瘤生物治療雜志，2009;16(3)：315-8.

〔2015-11-17修回〕

(編輯 袁左鳴)

黑龍江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(H2015074)；黑龍江省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練項(xiàng)目(20050222026)；黑龍江省普通高等學(xué)校青年學(xué)術(shù)骨干支持計(jì)劃項(xiàng)目(1252G059)；佳木斯大學(xué)科技重點(diǎn)項(xiàng)目(Sz2011-009)

柳朝陽(1971-)，男，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事神經(jīng)干細(xì)胞和阿爾茨海默病機(jī)制研究。

尹淑杰(1969-)，女，副主任醫(yī)師，主要從事腦血管病、癲癇，頭痛及眩暈的診斷和治療研究。

R749.16

A

1005-9202(2016)20-4961-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.20.009

1 濟(jì)寧市第二人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科

2 佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院