張?zhí)戽?楊慧杰，2?,孫世峰

(1.遼寧省獸藥飼料畜產品質量安全檢測中心,遼寧 沈陽 110000; 2.沈陽農業(yè)大學畜牧獸醫(yī)學院,遼寧 沈陽 110866; 3.遼寧省沈陽市動物衛(wèi)生監(jiān)督所,遼寧 沈陽 110000)

飼料中4種四環(huán)素類藥物的檢測
——高效液相色譜法

張?zhí)戽?,楊慧杰1，2?,孫世峰3

(1.遼寧省獸藥飼料畜產品質量安全檢測中心,遼寧 沈陽 110000; 2.沈陽農業(yè)大學畜牧獸醫(yī)學院,遼寧 沈陽 110866; 3.遼寧省沈陽市動物衛(wèi)生監(jiān)督所,遼寧 沈陽 110000)

本研究建立了高效液相色譜法同時測定飼料中土霉素、金霉素、四環(huán)素、強力霉素4種四環(huán)素類藥物。結果顯示,4種藥物在1～100 g/m L范圍內均呈現良好的線性關系,相關系數均達到0.999以上;土霉素和四環(huán)素的檢出限為0.25 g/g,金霉素和強力霉素的檢出限為0.5 g/g;土霉素和四環(huán)素的定量限為2 g/g,金霉素和強力霉素的定量限為4 g/g;回收率達到74.1%～98.8%。本方法適用于濃縮飼料、配合飼料、預混合飼料中土霉素、四環(huán)素、金霉素、強力霉素4種四環(huán)素類抗生素的檢測。

高效液相色譜法;土霉素;金霉素;四環(huán)素;強力霉素

四環(huán)素類抗生素是一類廣譜抗生素,對革蘭氏陽性菌和陰性菌都有很好的抑制作用,因此在養(yǎng)的應用,經常以亞治療劑量添加于動物飼料中,用于預防動物疾病和促生長。長期的使用導致動物食品中該類藥物的殘留富集,不僅會有耐藥菌株的出現［1],降低該藥物的治療效果,四環(huán)素還會與骨骼中的鈣結合,抑制牙齒和骨骼的發(fā)育,引起人的蕁麻疹等［2]。由此可見畜產品質量安全直接關系到人類的健康,而控制畜產品質量需從源頭把關,特別是嚴把飼料質量關。

目前,已報道的四環(huán)素類藥物檢測方法主要有微生物法、薄層色譜法、酶聯免疫法、分光光度計法、熒光法和色譜法［3-5],色譜法具有靈敏度高、快速等特點,已經被我國2000年版藥典采用［6]。本研究以四環(huán)素類抗生素為研究對象,采用高效液相色譜法,建立了一種高效、簡便、快速、靈敏的測定飼料中土霉素、四環(huán)素、金霉素、強力霉素的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與設備美國Waters公司2695型高效液相色譜儀(配紫外檢測器);高速冷凍離心機(美國賽默飛世爾科技公司生產);O asisRHLB固相萃取小柱(美國沃特世公司生產);圣德利純水系統(tǒng)(重慶市澳凱龍醫(yī)療器械研究有限公司);氮吹儀(N-EVAP型,美國Organomation公司生產)。

1.2 試劑和材料土霉素對照品、四環(huán)素對照品、鹽酸金霉素對照品(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所),強力霉素對照品(Dr.Ehrenstor fer公司),色譜純甲醇(Fisher公司),色譜純乙腈(Fisher公司),三氯乙酸(國藥集團化學試劑有限公司),試驗用水均為超純水。

1.3 方法

1.3.1 對照品的配制標準儲備液的配制:稱量土霉素、鹽酸金霉素、鹽酸四環(huán)素和強力霉素的對照品各約25 m g(精確至0.000 01 g),分別置于25 m L棕色容量瓶中,用甲醇稀釋成濃度均約為1 m g/m L的溶液,作為標準儲備液。

標準工作液配制:量取標準儲備液適量,用甲醇稀釋成含土霉素、鹽酸金霉素、鹽酸四環(huán)素和強力霉素濃度為10～20μg/m L的標準工作液?，F用現配。

1.3.2 樣品處理和提取稱取5.0 g樣品(精確至0.000 1 g),至于具塞錐形瓶中,加入50 mL MCI-Vaine-Na2EDTA緩沖液,5 mL 20%三氯乙酸溶液,震蕩提取30 min,10000 r/min離心5 min,取5 m L上清液過經3 mL甲醇,3 mL水潤洗的HLB固相萃取小柱。固相萃取小柱經3 mL水,3 mL 5%甲醇淋洗后,用3 mL甲醇洗脫,洗脫液經60℃氮氣吹干后,用1.0 mL流動相復溶,復溶液渦旋后過0.22μm濾膜,上機測定。

1.3.3 色譜條件色譜柱:XBridgeTMC18 150 mm× 1.6 mm,粒徑5μm;檢測器:紫外檢測器,檢測波長360 nm;柱溫:30℃;流動相組成及比例為草酸(0.01 mol/L):甲醇:乙腈=75:12.5:12.5;流動相速度:1.0 mL/min;進樣量:10～20μL。

2 結果與分析

2.1 流動相的確定

2.1.1 流動相試劑的確定本試驗嘗試采用乙腈-水作為系統(tǒng)流動相,結果樣品峰型嚴重拖尾,分離度及對稱度均不理想。相關文獻記載［7]四環(huán)素類化合物多以陽離子的形式存在,可以和草酸根結合形成離子對,改善峰型,且峰型的改善程度與草酸溶液的濃度相關。本試驗經過驗證,采用草酸-甲醇-乙腈作為系統(tǒng)流動相,色譜峰分離好且峰型標準,草酸溶液濃度確定為0.01 mol/L。

2.1.2 流動相pH的選擇試驗表明流動相的p H變化對4種抗生素的分離度、對稱性和柱效都有不同程度的影響。試驗分別考察了流動相p H為1.75、2.0、3.0、4.0時色譜的系統(tǒng)適用性情況,結果表明流動相p H為2.0時,柱效、色譜峰分離度、峰型的對稱性都最佳,因此流動相的p H確定為2.0。

2.1.3 流動相比例的選擇流動相中有機相與水相的比例直接影響目標物質的出峰時間,一定范圍內,有機相比例越高,出峰時間越早。對于本試驗而言,結合四環(huán)素類抗生素的性質,經過多次試驗選擇了流動相的比例為草酸(0.01 mol/L):甲醇:乙腈=75:12.5:12.5等度洗脫。

2.2 樣品前處理條件的優(yōu)化飼料樣品組成成分多、基質復雜,其中又常含有大分子蛋白和金屬離子,為了保證結果的準確性,在檢測時,首先要先將大分子量蛋白及飼料中常添加的金屬離子除去。常用的提純試劑有鹽酸、磷酸鹽、三氯乙酸、MCI-Vaine-Na2EDTA等［8-9],本試驗建立的高效液相色譜法測定飼料中的土霉素、金霉素、四環(huán)素、強力霉素的含量時,選用的提純試劑是MCI-Vaine-Na2EDTA緩沖液加三氯乙酸溶液,因為相同條件下,這兩種試劑的組合提取效果最好。

2.3 方法學考察

2.3.1 專屬性考察取混合標準工作液進行測定,色譜圖見圖1,4種抗生素分離度良好,彼此無干擾。將6份空白飼料樣品5.0 g,按1.3.2操作,色譜圖見圖2,空白基質無干擾。將一定體積的4種抗生素對照品溶液加入空白飼料樣品中,按1.3.2操作,色譜圖見圖3,空白飼料對4種抗生素無干擾,專屬性良好。

2.3.2 方法的線性范圍配置標準曲線,濃度分別為1、5、10、20、50、100μg/mL,每個濃度點制備2個平行試驗,用平均值繪制標準曲線。以待測物濃度為橫坐標(X,μg/mL),待測物峰面積比值為縱坐標(Y),進行回歸運算,求得直線回歸方程。標準曲線回歸方程見表1。由表1可見,在相應的濃度范圍內,各因子的響應值與質量濃度呈良好的線性關系。

圖1 土霉素(1)、四環(huán)素(2)、金霉素(3)、強力霉素(4)混合標準溶液色譜圖Fig.1 The mixed standard solution chromatogram of oxytetracycline，tetracycline，chlortetracycline and doxycycline

圖2 空白飼料樣品色譜圖Fig.2 Blank chromatogram of the feed

圖3 飼料樣品添加混合標準溶液色譜圖Fig.3 The mixed standard solution chromatogram of adding feed sample

2.3.3 檢測限的確定以相當于基線3倍信號(S/N≥3)相應的濃度為檢測限,當飼料中添加0.25μg/g土霉素和四環(huán)素,0.5μg/g金霉素和強力霉素時,信/噪(S/N)比均大于3,因此本方法土霉素和四環(huán)素檢測限為0.25μg/g,金霉素和強力霉素檢測限為0.5μg/g。

表1 HPLC法測定飼料中土霉素、四環(huán)素、金霉素、強力霉素標準工作曲線的回歸方程及相關系數Table1 The regression equation and correlation coefficient o f standard curve of oxytetracycline，tetracycline，chlortetracycline and doxycycline in feed determined by HPLC

表2 方法的回收率及精密度(n=6)Table2 Recovery and precision of the method

2.3.4 定量限的確定以相當于基線10倍信號(S/ N≥10)相應的濃度為檢測定量限,當飼料中添加2μg/g土霉素和四環(huán)素,4μg/g金霉素和強力霉素時,信/噪(S/N)比均大于10,因此本方法的土霉素和四環(huán)素定量限為2μg/g,金霉素和強力霉素定量限為4μg/g。

2.3.5 方法回收率及精密度采用標準添加法,分別向空白飼料樣品中添加低、中、高3種不同濃度的混合標準儲備液(添加濃度分別為20.0、50.0和100.0μg/m L),每一濃度制備6份樣品分析,平均回收率在76.2%～96.8%之間,相對標準偏差均＜5%,計算結果見表2。統(tǒng)計結果表明此方法穩(wěn)定性強,重現性好,能夠滿足配合飼料和濃縮飼料產品中土霉素、金霉素、四環(huán)素、強力霉素含量的測定。

3 結論

3.1 1 本試驗建立了應用高效液相色譜法測定飼料中土霉素、金霉素、四環(huán)素、強力霉素4種四環(huán)素類抗生素的聯檢方法。應用該方法測定,4種藥物在1～100μg/m L范圍內均呈現良好的線性關系,相關系數均達到0.999以上;土霉素和四環(huán)素的檢出限為0.25μg/g,金霉素和強力霉素的檢出限為0.5μg/g;土霉素和四環(huán)素的定量限為2μg/g,金霉素和強力霉素的定量限為4μg/g;回收率達到74.1%～98.8%。

3.2 該方法適用于濃縮飼料、配合飼料、預混合飼料中土霉素、四環(huán)素、金霉素、強力霉素4種四環(huán)素類抗生素的檢測,操作簡單,實用性強,為保障我國飼料質量安全進而保障食品安全提供了重要的技術支撐。

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Simultaneous determination of 4 kinds of tetracycline in feed by high performance liquid chromatography

Zhang Tianshu1,Yang Hui jie1.2*,Sun Shifeng3
(1.Animal feed quality and safety of venterinary testing centre in Liaoning province,Liaoning Shenyang 110016; 2.College of Animal Science and Veterinary of shenyang Agricultural University,Liaoning Shenyang 110866; 3.Shenyang Animal Health Inspection Institute,Liaoning Shenyang 110000)

A HPLC method to Simultaneous Determination of oxytetracyline,etracycline,chlortetracycline,doxycycline in Feed stuff was established.The results showed that the calibration curves of 4 tetracyclinesexhibited good l inearity in th erange 1～100μg/mL with correlation coefficients greater than 0.999.The oxytetracyline and chlortetracycline detection limit was 0.25 μg/g.The etracycline and doxytetracyline detection limit was 0.5μg/g.The oxytetracyline and chlortetracycline limit of quantitation was 2μg/g.The etracycline and doxytetracyline limit of quantitation was 4μg/g.The average recovery rate reached 74.1%～98.8%.The method is applicable for detecting the content of oxytetracycline,tetracycline,chlortetracycline and doxycycline in the combinative feed,concentrated feed and premixed feed.

High Performance Liquid Chromatography;Oxytetracycline;Chlorotetracycline;Tetracycline;Doxycycline殖業(yè)中被廣泛用作飼料添加劑。近年來隨著養(yǎng)殖業(yè)的不斷集約化,四環(huán)素類抗生素得到了更廣泛

S859.84

B

1672-9692(2016)10-0016-05

2016-09-08

張?zhí)戽?1985-),女,碩士,主要從事飼料檢驗工作。

楊慧杰(1986-),女,本科,主要從事飼料檢驗工作。