王嬌嬌,張世偉,張麗君,王澤英,羅光彬,白文林

(1.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院,遼寧 沈陽(yáng) 110886; 2.遼寧省畜牧業(yè)經(jīng)濟(jì)管理站,遼寧 沈陽(yáng) 110032)

遼育白牛MSTN基因分子克隆及序列分析

王嬌嬌1,張世偉2?,張麗君2,王澤英1,羅光彬1,白文林1

(1.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院,遼寧 沈陽(yáng) 110886; 2.遼寧省畜牧業(yè)經(jīng)濟(jì)管理站,遼寧 沈陽(yáng) 110032)

肌肉生長(zhǎng)抑制素(簡(jiǎn)稱(chēng)MSTN)是肌肉發(fā)育負(fù)調(diào)控因子,為了實(shí)現(xiàn)將來(lái)對(duì)遼育白牛的分子育種,本試驗(yàn)對(duì)MSTN分子特征及其靶MicroRNA進(jìn)行了分析。以遼育白牛為研究對(duì)象,利用分子生物學(xué)技術(shù),設(shè)計(jì)特定引物對(duì)遼育白牛MSTN基因的編碼區(qū)和調(diào)控區(qū)分段PCR擴(kuò)增,并進(jìn)行克隆和測(cè)序。借助生物信息學(xué)分析軟件,尋找各個(gè)區(qū)域的單核苷酸多態(tài)性(SNP)并分析了MSTN基因分子特征、組織表達(dá)譜以及3'非翻譯區(qū)靶標(biāo)m iRNA。試驗(yàn)表明, MSTN基因5′調(diào)控區(qū)SNPs使啟動(dòng)子位置和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合情況發(fā)生變化,但編碼區(qū)的突變未造成氨基酸改變。遼育白牛MSTN編碼區(qū)序列全長(zhǎng)為1 128 bp,編碼375個(gè)氨基酸,該蛋白存在信號(hào)肽序列,為分泌性蛋白,疏水性較弱且不穩(wěn)定。遼育白牛MSTN基因在不同組織中具有表達(dá)差異性,且肌肉中表達(dá)量最高。3′UTR存在肌肉生長(zhǎng)發(fā)育功能miRNA,且比較保守。為開(kāi)展遼育白牛分子育種研究奠定理論基礎(chǔ)。

遼育白牛;MSTN基因;MicroRNA;單核苷酸多態(tài)性

遼育白牛是遼寧省新培育出來(lái)的肉牛新品種,其生長(zhǎng)性狀具有一定的優(yōu)勢(shì)和典型性,由于初培育目前對(duì)遼育白牛的深入研究現(xiàn)在還非常少,要想讓該種群擴(kuò)大并保持生長(zhǎng)性狀的優(yōu)越性,僅用傳統(tǒng)的育種手段,其遺傳進(jìn)展無(wú)疑是緩慢的,效果也是不理想的。借助先進(jìn)的分子育種技術(shù)手段找尋遼育白牛重要經(jīng)濟(jì)性狀的主基因或與之連鎖的分子標(biāo)記,是提高我國(guó)遼育白牛生產(chǎn)水平,尤其是產(chǎn)肉和肉品質(zhì)性狀的一條有效途徑［1]。

根據(jù)目前研究,國(guó)內(nèi)外關(guān)于肌肉生長(zhǎng)發(fā)育和肉質(zhì)性狀的研究方法有很多,一般采用定位影響肉質(zhì)的主效基因的方法來(lái)實(shí)現(xiàn),所涉及的主要調(diào)節(jié)肌肉生長(zhǎng)發(fā)育因素有如下幾種:肌肉生長(zhǎng)抑制素、瘦蛋白基因、鈣素基因、生肌調(diào)節(jié)因子MyoG基因［2]、腎上腺髓質(zhì)基因、腺苷酸環(huán)化酶2型基因［3]、胰島素樣生長(zhǎng)因子［4]。

肌肉生長(zhǎng)抑制素(簡(jiǎn)稱(chēng)MSTN),又稱(chēng)GDF-8,是TGF-β(transforming growth factor beta,轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β)超家族成員。MSTN在骨骼肌中廣泛表達(dá),是功能比較專(zhuān)一的肌肉發(fā)育負(fù)調(diào)控因子,在控制骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育與分化上起著非常重要的作用。MSTN基因?qū)崿F(xiàn)對(duì)肌細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育的負(fù)向調(diào)控的原理,是通過(guò)抑制成肌細(xì)胞的分化抗體家族成員的轉(zhuǎn)錄活性來(lái)實(shí)現(xiàn)的,肌肉重量大小的變化表現(xiàn)為與MSTN基因的表達(dá)量呈顯著的負(fù)相關(guān)性［5]。已有最新報(bào)道表明,在不同的家畜動(dòng)物中,可以使MSTN基因失活,從而導(dǎo)致肌肉增大重量增加現(xiàn)象［6]。肌肉生長(zhǎng)抑制素基因的研究一直是近年來(lái)國(guó)內(nèi)外分子遺傳領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一,并已取得顯著成果。

MicroRNA是一類(lèi)進(jìn)化上高度保守的非編碼的單鏈內(nèi)源性小分子R N A［7]。目前,大約有3 000種MicroRNA已經(jīng)被鑒定出來(lái)［8]。目前,已經(jīng)被證實(shí),在肌肉發(fā)育和肌肉細(xì)胞增殖和分化過(guò)程中MicroRNA具有重要的調(diào)節(jié)作用［9]。

1 材料與方法

1.1 血液與肌肉組織樣品試驗(yàn)以遼寧省培育的新品種——遼育白牛為研究對(duì)象進(jìn)行多次采樣分析。樣品分別由遼寧省畜牧業(yè)經(jīng)濟(jì)管理站聯(lián)系大連雪龍集團(tuán)公司與遼寧綠源肉業(yè)有限公司提供。在大連雪龍集團(tuán)公司,利用加有抗凝劑EDTAK2的采集管對(duì)20頭遼育白牛靜脈采血,將采集的樣品低溫保存,帶回實(shí)驗(yàn)室-70℃冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｔ谶|寧綠源肉業(yè)有限公司所屬的屠宰場(chǎng)采集平均年齡約為5歲的遼育白牛肋脊部肌肉組織,以及心、肝、脾、肺、腎、翠丸、附翠組織,用提前經(jīng)過(guò)滅菌的鑷子和手術(shù)刀片分別取100 g并切成小塊分裝,裝在紗布袋里,拴好并在繩上粘上標(biāo)簽,立即放入液氮罐中冷凍備用。

1.2 試劑蛋白酶K(proteinase K)、Taq DNA聚合酶、5×SDS PAGE蛋白上樣緩沖液、DEPC、dNTPs、6×Buffer、DL 2000 DNA Marker、RNA simple總RNA提取試劑盒、血液DNA提取試劑盒、RT-PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑2×Taq PCR Master Mix、β Actin抗體等,購(gòu)自天跟生物有限公司和大連寶生物工程有限公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)及合成參考Gen Bank上公布的牛MSTN序列(登錄號(hào)為NM_001001 525.2),使用Primer 5.0和Olio 6軟件分別對(duì)基因的5′調(diào)控區(qū),CDS和3′-UTR設(shè)計(jì)特異引物,由上海生工合成引物。5M1和5M2擴(kuò)增5′調(diào)控區(qū)(位于編碼區(qū)上游長(zhǎng)約1 240 bp), 5M1,F:5 CTAAGGTTGAGAGTTTGA 3,R:5 TCTTTTGCTTTTGAGTAA 3,長(zhǎng)度1 226 bp,退火溫度51.0℃;5M2,F:5 AGACCTTACCCCAAATCCC 3,R: 5 AGACAACTTGCCACACCAG 3,長(zhǎng)度 1 101 bp,退火溫度61.0℃。M1、M2、M3擴(kuò)增編碼區(qū)(1～1 128 b p), M1,F:5 TTGGCTTGGCGTTACTCA 3,R:5 CCATCTTCTCCTGGTTCT 3,長(zhǎng)度826 bp,退火溫度57.4℃;M2,F:5 TTGGGCTTGATTGTGAT 3,R:5 GAATGGTAACCTGCGTAT 3,長(zhǎng)度846 bp,退火溫度55.0℃;M3,F:5 CCACAAAGTAGGGAT 3,R:5 CATTGGATGTAAGAA 3,長(zhǎng)度977 bp,退火溫度46.4℃。3M1、3M2、3M3擴(kuò)增3′調(diào)控區(qū)(位于編碼區(qū)下游長(zhǎng)約1 058 bp),3M1,F:5 GTAGATCGCTGTGGGTGT 3,R:5 CCATAGGGAGGAGTGTGA 3,長(zhǎng)度700 bp,退火溫度54.2℃;3M2,F:5 AGGTCTTCCCCTCAACAA 3,R:5 CAGCCATTCAGCCTATTG 3,長(zhǎng)度552 bp,退火溫度53.4℃;3M3,F:5 AGGACATAAAAGCAAAAG 3,R:5 TACAATGACAGTAAACCA 3,長(zhǎng)度194 bp,退火溫度48.5℃。

1.4 基因組DNA及總RNA的提取及檢測(cè)按照血液基因組DNA提取試劑盒(天根)提取基因組DNA。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)基因組DN A純度,紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA濃度,采用RNA simple總RNA提取試劑盒(天根),對(duì)遼育白牛肌肉及心、肝、脾、肺、腎、翠丸、附翠八種組織的總RNA進(jìn)行提取,并用0.8%的甲醛的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.5 產(chǎn)物擴(kuò)增與序列鑒定本試驗(yàn)采用設(shè)計(jì)的上、下游特異引物,分別在各自最適退火溫度條件下獲得MSTN基因各個(gè)區(qū)段目的片段。編碼區(qū)的引物M1、M2、M3對(duì)基因擴(kuò)增時(shí),采用的模板是遼育白牛各組織中提取的RNA反轉(zhuǎn)錄后獲得的cDNA。用MSTN基因的5′調(diào)控區(qū)和3′-U T R區(qū)域的基因引物進(jìn)行基因擴(kuò)增時(shí),需要對(duì)10頭遼育白牛種公牛血樣提取的DNA分別進(jìn)行擴(kuò)增。然后根據(jù)巢式PCR方法,將檢測(cè)后成功獲得的MSTN基因的5′調(diào)控區(qū)和3′-UTR區(qū)域基因擴(kuò)增產(chǎn)物每3管混在一起,將所有成功獲得的MSTN基因擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。目的序列與GenBank中相應(yīng)基因序列比對(duì)分析,確定基因的序列結(jié)構(gòu)。利用DNAStar,DNAMAN 4.0,BLAST等軟件與GenBank中序列進(jìn)行比較分析。利用數(shù)據(jù)庫(kù)和在線(xiàn)軟件分別分析5′端非翻譯區(qū)序列、預(yù)測(cè)TATAbox、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)、預(yù)測(cè)CpG島、預(yù)測(cè)蛋白結(jié)構(gòu)及功能位點(diǎn)、預(yù)測(cè)3′端非翻譯區(qū)序列靶標(biāo)MicroRNA。

圖1 MSTN基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.1 PCR products of MSTN gene

圖2 MSTN基因中SNP的峰圖Fig.2 Peak profile of SNPs in MSTN gene

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因片段擴(kuò)增與測(cè)序采用設(shè)計(jì)的上、下游特異引物,在最適退火溫度條件下獲得MSTN基因不同區(qū)段目的片段(圖1)。測(cè)序結(jié)果顯示,在5′調(diào)控區(qū)-805 bp位處發(fā)生G/C突變,編碼區(qū)571 bp位處發(fā)生A/G突變,3′-UTR區(qū)5 387 bp處發(fā)生C/T突變(圖2)。

2.2 MSTN 基因分子特征分析測(cè)序結(jié)果分析后,在MSTN基因5′調(diào)控區(qū)發(fā)現(xiàn)4個(gè)突變位點(diǎn),分別是-805 bp位點(diǎn)G/C突變、-163 bp位點(diǎn)T缺失突變、-156 bp位點(diǎn)A插入突變、-130 bp位點(diǎn)A插入突變。利用Berkeley Drosophila Genome Project軟件對(duì)MSTN基因5′端的啟動(dòng)子分析預(yù)測(cè)。結(jié)果顯示發(fā)生SNP突變后,在-161 bp和-137 bp位點(diǎn)處的兩個(gè)TATA box消失,推斷-163 bp位點(diǎn)的T缺失突變,-156 bp位點(diǎn)的A插入突變和-130 bp位點(diǎn)的A插入突變很有可能都是潛在的功能性突變位點(diǎn)。利用TFSEARCH轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)軟件,比較發(fā)現(xiàn)發(fā)生SNPs后,導(dǎo)致MSTN的5′端結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子種類(lèi)和數(shù)量都發(fā)生了變化。通過(guò)methprimer cpG島軟件查找發(fā)現(xiàn)5′調(diào)控區(qū)存在明顯的cpG Islands。

借助ORF Finder在線(xiàn)分析軟件,參照Kozak法則(起始密碼子符合CCA/GCCATG),對(duì)得到的遼育白牛MSTN的DNA序列進(jìn)行閱讀框架的識(shí)別,發(fā)現(xiàn)MSTN基因開(kāi)放閱讀框由3個(gè)外顯子組成長(zhǎng)度分別為373、374和381 bp,編碼375個(gè)氨基酸。測(cè)序結(jié)果中發(fā)現(xiàn)在571 bp處發(fā)生A/G突變。

ExPASy-ProtParam分析結(jié)果表明其蛋白質(zhì)氨基酸殘基親疏水性總和為-0.337,蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)為40.48(此值大于40為不穩(wěn)定蛋白),說(shuō)明遼育白牛MSTN蛋白的疏水性較弱,且不穩(wěn)定。根據(jù)Signal P4.1和Server 4.1軟件對(duì)遼育白牛MSTN基因編碼的蛋白進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè),結(jié)果顯示遼育白牛的MSTN蛋白中存在明顯的信號(hào)肽序列。成熟鏈序列(mature chain sequence)預(yù)測(cè)在19 bp、375 bp位置處,屬分泌性蛋白,這與已有研究結(jié)果相一致。

通過(guò)ExPASy-ProtScale軟件對(duì)遼育白牛MSTN蛋白進(jìn)行蛋白疏水區(qū)的預(yù)測(cè)(圖3)。從圖3可見(jiàn),遼育白牛MSTN基因編碼蛋白的C端具有親水性,N端具很強(qiáng)疏水性,位于分子內(nèi)部;中間部分親水性和疏水性表現(xiàn)交替出現(xiàn)。從總體上講,該蛋白的親水性更強(qiáng),而疏水區(qū)相對(duì)較少。

對(duì)遼育白牛MSTN蛋白序列用SOPMA進(jìn)行蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。該蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中由22.93%的a螺旋(h)、21.33%的伸展鏈(e)、2.93%的β轉(zhuǎn)角(t)和52.80%的隨機(jī)線(xiàn)圈螺旋(c)組成。氨基酸的對(duì)應(yīng)序列顯示整個(gè)蛋白結(jié)構(gòu)出現(xiàn)了3個(gè)大峰和2個(gè)較小峰,可見(jiàn)a螺旋結(jié)構(gòu)出現(xiàn)的集中區(qū)域相對(duì)比較明顯。

將遼育白牛MSTN蛋白序列用SWISS MODEL軟件,進(jìn)行搜索同源性高的三維結(jié)構(gòu)建模模板。結(jié)果顯示,與遼育白牛MSTN蛋白同源性最高的是Transforming growth factor beta1蛋白因子(3rjr.1.B),同源性達(dá)到84%?；赥ransforming growth factor bta-1(3rjr.1.B)的三維結(jié)構(gòu),所提交的氨基酸序列構(gòu)建的遼育白牛蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)模式(圖4),其含有多個(gè)a螺旋結(jié)構(gòu)域,該三維空間結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)結(jié)果與二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)結(jié)果相一致。

圖3 ProScale預(yù)測(cè)遼育白牛MSTN親水性分布圖Fig.3 MSTN hydropathy profile in Liaoyu white cattle predicted by ProScale

2.3 MSTN MSTN基因組織表達(dá)譜遼育白牛MSTN蛋白不同組織部位表達(dá)見(jiàn)圖5,組織部位包括翠丸、心臟、肌肉、肺、肝、脾、腎、附翠,利用β actin作為參照基因,從圖可知,MSTN在心臟、肌肉和肝中的表達(dá)量相對(duì)強(qiáng)些,而在翠丸、脾、腎、附翠中的轉(zhuǎn)錄信號(hào)相對(duì)較弱,但在遼育白牛的肺中沒(méi)有檢測(cè)到表達(dá)信號(hào), MSTN在肌肉中的表達(dá)信號(hào)相對(duì)最強(qiáng)。

2.4 MSTN基因3′-UTR-UTR靶標(biāo)miRNA分析測(cè)序后通過(guò)基因序列與波峰的比對(duì)發(fā)現(xiàn),在MSTN基因3′UTR區(qū)發(fā)現(xiàn)了三個(gè)突變位點(diǎn),分別是+5 304 bp位點(diǎn)A到C的突變,+5 378 bp位點(diǎn)C到G的突變,+5 387 bp位點(diǎn)C到T的突變(圖6)。

利用在線(xiàn)軟件查找牛的miRNA,牛的靶標(biāo)miRNA庫(kù)包含687個(gè)相關(guān)miRNA,用Micro Inspector軟件將MSTN基因與牛的miRNA結(jié)合情況分析后發(fā)現(xiàn)MSTN基因的3′U TR可以結(jié)合5個(gè)miRNA(圖7)。發(fā)生突變后結(jié)合的miRNA的情況沒(méi)有發(fā)生變化,結(jié)合的miRNA詳細(xì)信息見(jiàn)表1。

3 討論

圖4 遼育白牛MSTN基因編碼蛋白三維空間結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)圖Fig.4 Predictions of three-dimensional structure of protein encoded by MSTN in Liaoyu white cattle

圖5 MSTN基因在遼育白牛不同組織中的表達(dá)結(jié)果Fig.5 Results of MSTN gene expression in different tissues in Liaoyu white cattle

圖6 遼育白牛MSTN基因3′UTR測(cè)序Fig.6 Sequencing of 3′UTR in MSTN gene of Liaoyu white cattle

啟動(dòng)子是基因的重要組成部分,它位于基因5′端上游,參與基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。它通過(guò)與RNA聚合酶特異性作用,來(lái)對(duì)基因的轉(zhuǎn)錄水平起作用。由于啟動(dòng)子在轉(zhuǎn)錄水平的功能,當(dāng)5′調(diào)控區(qū)發(fā)生SNP后,可能會(huì)造成啟動(dòng)子發(fā)生相應(yīng)的變化。本試驗(yàn)已經(jīng)得到遼育白牛MSTN基因的5′調(diào)控區(qū)發(fā)生SNP后,啟動(dòng)子位置發(fā)生了明顯的變化,且原區(qū)域的TATA box消失。這表明在遼育白牛MSTN基因上存在多個(gè)潛在的啟動(dòng)子區(qū)段。而在很多研究中,牛基因組中的5′調(diào)控區(qū)或外顯子1和2附近并沒(méi)有典型的TATA框序列。轉(zhuǎn)錄結(jié)合因子在基因轉(zhuǎn)錄中具有重要的意義,它也是通過(guò)與RNA酶結(jié)合來(lái)發(fā)揮功能,影響著基因的轉(zhuǎn)錄,不同的轉(zhuǎn)錄因子,會(huì)產(chǎn)生不同的結(jié)合物,最后影響基因轉(zhuǎn)錄成不同的轉(zhuǎn)錄本,繼而影響到后續(xù)的進(jìn)程［10]。本試驗(yàn)通過(guò)尋找SNP前后潛在的轉(zhuǎn)錄因子潛在的結(jié)合位點(diǎn)的變化,功能性SNP使遼育白牛MSTN基因5′端結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子種類(lèi)數(shù)量和結(jié)合力上都發(fā)生了改變,產(chǎn)生了不同的潛在結(jié)合位點(diǎn),而這些潛在的結(jié)合因子共同作用可能會(huì)對(duì)MSTN基因的表達(dá)產(chǎn)生一定的影響。

圖7 Microlnspector分析遼育白牛MSTN基因靶標(biāo)miRNA結(jié)合情況Fig.7 Microinspector analysis of miRNA binding conditions targeted by MSTN gene in Liaoyu white cattle

表1 靶標(biāo)miRNA的堿基序列Table1 Base sequence of target miRNA

MSTN基因在不同物種間是十分保守的:甚至小鼠、大鼠、人、豬、雞和火雞在C-端的同源性能達(dá)到100%,而牛羊相比只有1～3個(gè)堿基的差別,斑馬魚(yú)與其他動(dòng)物比同源性最差也能達(dá)到88%。遼育白牛MSTN蛋白與多個(gè)哺乳動(dòng)物MSTN蛋白序列的序列一致性都在90%以上,說(shuō)明了該蛋白在哺乳動(dòng)物中存在顯著的相似性,因而可以認(rèn)為其功能也存在保守性［11]。所以該基因在其他哺乳動(dòng)物中的研究對(duì)遼育白牛的研究具有一定的借鑒意義。

MSTN在骨骼肌中廣泛表達(dá),是功能比較專(zhuān)一的肌肉發(fā)育負(fù)調(diào)控因子［12]。目前有關(guān)遼育白牛基因的相關(guān)研究還比較少,因此本試驗(yàn)將以生物信息學(xué)手段對(duì)MSTN的mRNA序列進(jìn)行多物種比對(duì)并根據(jù)其保守區(qū)設(shè)計(jì)了遼育白牛MSTN基因克隆的引物,最終獲得全長(zhǎng)為1 128 b p的遼育白牛MSTN基因cD NA序列。再通過(guò)生物信息學(xué)分析對(duì)該未知序列進(jìn)行初步的確認(rèn)及功能預(yù)測(cè),為后續(xù)試驗(yàn)確定初步的研究方向。

遼育白牛MSTN編碼的蛋白總體上屬于疏水性較弱、親水性較強(qiáng)的分泌性蛋白,這一點(diǎn)與其他學(xué)者研究的普通牛MSTN相一致［13],雖然疏水區(qū)相對(duì)較少,但可以推測(cè)出這些疏水區(qū)對(duì)MSTN蛋白形成重要功能結(jié)構(gòu)域上發(fā)揮一定的作用。經(jīng)生物信息學(xué)分析王偉等也曾發(fā)現(xiàn)豬MSTN編碼的蛋白質(zhì)在細(xì)胞外,很有可能作為信號(hào)肽［14]。

隨著動(dòng)物發(fā)育時(shí)期的變化和物種的不同以及組織的不同,MSTN基因的表達(dá)也呈現(xiàn)一定差異［15]。Kim等［16]分析了新生牛不同時(shí)期MSTN基因在肌肉中的表達(dá)量逐漸發(fā)生變化。Sharma［17]研究在其他組織器官中MSTN蛋白的分布情況時(shí),發(fā)現(xiàn)牛和綿羊心肌組織中該基因也表達(dá)。Ji等［18]發(fā)現(xiàn),除骨骼肌外,在豬的心、肝、肺、腎、腦、舌、骨髓、小腸、乳腺和脂肪組織中也都有表達(dá)。本試驗(yàn)對(duì)于MSTN在不同組織中表達(dá)分析,發(fā)現(xiàn)其在遼育白牛肌肉組織中表達(dá)量相對(duì)很高,因此可以試圖通過(guò)對(duì)其調(diào)控作用實(shí)現(xiàn)對(duì)肌肉性狀的控制。MSTN基因5′端啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄因子、cpG島等都是都是在其轉(zhuǎn)錄水平起調(diào)控作用,可將其作為切入點(diǎn)實(shí)現(xiàn)對(duì)MSTN基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)克隆遼育白牛MSTN基因,發(fā)生SNPs后,啟動(dòng)子原區(qū)域兩個(gè)TATA box消失,5′端結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子種類(lèi)和數(shù)量都發(fā)生變化,且存在明顯的cpG島。編碼區(qū)序列,全長(zhǎng)為1 128 bp,編碼375個(gè)氨基酸, MSTN蛋白存在信號(hào)肽序列,為分泌性蛋白,疏水性較弱、不穩(wěn)定。遼育白牛不同組織部位MSTN基因具有組織部位差異性表達(dá)模式,且肌肉組織中表達(dá)信號(hào)最強(qiáng)。MSTN基因存在靶miRNAs,且比較保守。因此可將MSTN作為控制肌肉生長(zhǎng)發(fā)育的候選基因,為開(kāi)展遼育白牛分子育種研究奠定理論基礎(chǔ)。

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Liaoyu White Cattle MSTN Gene Molecular Clone And Sequence Analysis

Wang Jiaojiao1,Zhang Shiwei2*,Zhang Li jun2,Wang Zeying1, Luo Guangbin1,Bai Wenlin1
(1.College of Animal Husbandry and Veterinary,Shenyang Agricultural University,Liaoning Shenyang 110886; 2.Liaoning Animal Husbandry Economic Management Stations,Liaoning Shenyang 110032)

Myostatin(MSTN)are negative regulatory factors of muscle development,in order to achieved the molecular breeding of liao white cattle in the future,so this study analysesed the MSTN molecular characteristics and target of micrornas.In this research,Liaoyu white cattle were studied by means of molecular biological technology.By designing the specific primers,Coding regions and regulatory regions of MSTN ge0ne in Liaoyu white cattle were PCR amplified,cloned and sequenced separately.Based on the results of bioinformatics analysis software,to find SNPs in all areas,to analyze molecular characteristics of MSTN gene,expression differences in different tissues and target miRNAs of 3′-UTR.Experimental results showed that the SNPs in 5′regulatory region of MSTN gene could change the promoter position and the transcription factor binding conditions.But,the mutations in the Coding region had no effect on the protein composition.In Liaoyu white cattle,the full-length of Coding region sequences in MSTN gene was 1128 bp,with coding 375 amino acids which was the weak hydrophobic and unstable secreted protein containing signal peptide sequence.In different tissues of Liaoyu white cattle,there were expression differences for MSTN gene,and highest expression was appeared in muscle tissue.Conservative target miRNAs existed in 3′-UTR of MSTN gene.Through this research,the theoretical foundation of molecular breeding for Liaoyu white cattle can be laid.

Liaoyu white cattle;MSTN gene;MicroRNA;Single nucleotide polymorphisms(SNPs)

S823.25

B

1672-9692(2016)10-0021-07

2016-08-06

王嬌嬌(1987-),女,遼寧人,碩士,主要從事動(dòng)物分子遺傳育種研究。

張世偉(1968-),男,本科,研究員級(jí)高級(jí)畜牧師,主要負(fù)責(zé)牛良種繁育體系建設(shè)及技術(shù)推廣等工作。