梁爭(zhēng)文 張鐵鷹* 李 爽 劉俊麗

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100193；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，蘭州730070)

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植物角質(zhì)降解菌的種屬鑒定、發(fā)酵條件優(yōu)化及酶學(xué)性質(zhì)研究

梁爭(zhēng)文1張鐵鷹1*李 爽1劉俊麗2

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100193；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，蘭州730070)

本試驗(yàn)旨在通過(guò)角質(zhì)降解菌株X8P的種屬鑒定、發(fā)酵條件優(yōu)化和酶學(xué)性質(zhì)研究，探討降解植物表面角質(zhì)層，進(jìn)一步改善動(dòng)物對(duì)植物纖維利用的可能新方案。試驗(yàn)通過(guò)形態(tài)觀察和16S rDNA測(cè)序鑒定菌株X8P種屬，并對(duì)其產(chǎn)酶所需碳源、氮源、發(fā)酵溫度與時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，其發(fā)酵液經(jīng)硫酸銨鹽析沉淀獲得其胞外蛋白粗酶，并對(duì)其粗酶催化的適宜pH和pH穩(wěn)定性、溫度和溫度穩(wěn)定性，以及有機(jī)溶劑、表面活性劑和金屬離子對(duì)其活性的影響進(jìn)行研究。結(jié)果表明：1)菌株X8P經(jīng)形態(tài)觀察和分子鑒定為東方醋桿菌(Acetobacterorientalis)。2)菌株X8P適宜產(chǎn)酶發(fā)酵條件為溶菌肉湯(LB)培養(yǎng)基中37 ℃發(fā)酵4 d，1%橄欖油和1%葡萄糖明顯促進(jìn)菌株產(chǎn)酶，而1%可溶性淀粉明顯抑制菌株產(chǎn)酶。3)該菌株胞外粗酶催化適宜pH和溫度分別為6.5和45 ℃，且表現(xiàn)出一定pH穩(wěn)定性，但在有機(jī)溶劑中不穩(wěn)定，僅甘油中可保留全部活性，在二甲基亞砜(50%)中活性可保留66%。吐溫(Tween)-20(1 mmol/L)、Tween-80(1 mmol/L)和聚乙二醇辛基苯基醚(1和10 mmol/L)可使菌株X8P粗酶活性提高3%～35%。金屬離子鉀離子(K+)、錳離子(Mn2+)(1和10 mmol/L)可使菌株X8P粗酶活性提高2%～20%。由此可見(jiàn)，菌株X8P具有一定的產(chǎn)角質(zhì)酶潛力和應(yīng)用前景，可進(jìn)一步深入研究。

角質(zhì)；角質(zhì)酶；角質(zhì)降解菌；發(fā)酵條件優(yōu)化；酶學(xué)性質(zhì)

植物葉片和籽實(shí)表面均覆蓋有角質(zhì)層，厚度約為0.1 μm[1-2]。角質(zhì)層主要組成成分為角質(zhì)，此外還含有約0.6%蠟質(zhì)、0.9%果膠、1.3%蛋白質(zhì)、2.0%非纖維多糖、灰塵及雜質(zhì)等組分[3]。角質(zhì)層化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，且耐酸堿、耐氧化，這可能使反芻動(dòng)物瘤胃中和豬、兔等單胃動(dòng)物后腸微中生物及其酶與飼料原料纖維的有效接觸減少，也可能使黏附在植物纖維顆粒上的微生物數(shù)量減少，從而影響動(dòng)物消化道對(duì)植物纖維材料的降解[4]。近年來(lái)，食品加工副產(chǎn)品如酒糟、麩皮、玉米皮等越來(lái)越多用于豬、禽飼糧中。這些原料富含角質(zhì)，可能是限制動(dòng)物尤其是單胃動(dòng)物后腸微生物對(duì)纖維降解的主要障礙之一。破壞植物角質(zhì)層，會(huì)使其滲透性增加，機(jī)械強(qiáng)度降低[5]。

角質(zhì)降解菌產(chǎn)生的角質(zhì)酶可水解角質(zhì)層屏障，利于其侵染植物。經(jīng)角質(zhì)酶處理的植物性飼料亦同樣利于動(dòng)物消化道內(nèi)微生物及酶快速與植物內(nèi)部組織結(jié)合，增加表面微生物及酶的活性，提高纖維降解速率。因此，采用生物技術(shù)手段破壞植物角質(zhì)層可能是提高飼料植物纖維消化利用的關(guān)鍵之一。目前，人們對(duì)真菌角質(zhì)酶的研究最為廣泛，來(lái)自鐮刀菌屬(Fusarium)、炭疽菌屬(Colletotrichum)、鏈核盤(pán)菌屬(Monilinia)等14屬20多種真菌的角質(zhì)酶已得到深入研究[6]。其中茄病鐮孢菌(Fusariumsolanipisi)角質(zhì)酶研究最為透徹，且其三維結(jié)構(gòu)已解析[7]。相反，人們對(duì)細(xì)菌和放線菌角質(zhì)酶了解較少[8]，且對(duì)細(xì)菌來(lái)源角質(zhì)酶編碼基因信息了解也十分有限[4]。目前僅對(duì)假單胞菌(Pseudomonas)和嗜熱裂胞菌(Thermobifida)來(lái)源的角質(zhì)酶進(jìn)行了純化和生化特征分析，并獲得其角質(zhì)酶編碼信息[9]。因此，本研究擬通過(guò)對(duì)角質(zhì)降解菌X8P種屬鑒定、發(fā)酵條件優(yōu)化和酶學(xué)性質(zhì)研究，以探討其所產(chǎn)酶特點(diǎn)及在畜牧業(yè)中應(yīng)用潛質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌株來(lái)源

菌株X8P為本實(shí)驗(yàn)室分離保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

溶菌肉湯(LB)培養(yǎng)基：酵母提取物5 g，胰蛋白胨10 g，氯化鈉10 g，去離子水1 000 mL，自然pH，121 ℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：橄欖油10 g，硫酸銨5 g，牛肉膏5 g，酵母粉5 g，蛋白胨10 g，氯化鈉10 g，去離子水1 000 mL，自然pH，121 ℃滅菌20 min。

1.1.3 試劑

α-乙酸萘酯(α-naphthyl acetate)、2-(N-嗎啡啉)乙磺酸[2-(N-morpholino) ethanesulfonic acid,MES]，購(gòu)自Sigma公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株鑒定

形態(tài)特征：將菌株X8P劃線于LB平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)，觀察單菌落形態(tài)。

16S rDNA序列測(cè)定和系統(tǒng)發(fā)育分析：提取菌株基因組DNA，采用16S rDNA擴(kuò)增通用引物(27 F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492 R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)，擴(kuò)增菌株16S rDNA。PCR純化產(chǎn)物測(cè)序由博邁德科技發(fā)展有限公司完成。將測(cè)序結(jié)果在NCBI上用BLAST程序與GenBank中16S rDNA序列進(jìn)行同源性分析，用MEGA5.2中的鄰接(neighbor-joining)法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.2 菌株發(fā)酵條件優(yōu)化

1.2.2.1 制種

將甘油保存的菌株X8P在LB培養(yǎng)基上劃線活化后，從平板上挑取單菌落到種子培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)制備種子液。

1.2.2.2 碳源對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響

以LB培養(yǎng)基為對(duì)照，分別研究1%橄欖油、堿處理角質(zhì)、角質(zhì)、麩皮、玉米芯、秸稈、蔗糖、葡萄糖和可溶性淀粉等碳源對(duì)菌株X8P胞外酶活性影響。在30 ℃、150 r/min下，發(fā)酵培養(yǎng)4 d，獲得粗酶液。

1.2.2.3 氮源對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響

在LB培養(yǎng)基和最佳碳源基礎(chǔ)上，分別研究0.5%胰蛋白胨、酵母粉、牛肉膏、酪蛋白、氯化銨和硫酸銨等氮源對(duì)菌株X8P胞外酶活性影響。在30 ℃、150 r/min下，發(fā)酵培養(yǎng)4 d，獲得粗酶液。

1.2.2.4 發(fā)酵溫度對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響

在LB培養(yǎng)基添加最佳碳源和最佳氮源基礎(chǔ)上，分別研究不同發(fā)酵溫度(25、30、37、40和45 ℃)對(duì)菌株X8P胞外酶活性的影響。150 r/min發(fā)酵培養(yǎng)4 d，獲得粗酶液。

1.2.2.5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響

在單一因素優(yōu)化基礎(chǔ)上，研究發(fā)酵時(shí)間(1、2、3、4、5和6 d)對(duì)菌株X8P胞外酶活性影響。在37 ℃、150 r/min下培養(yǎng)獲得粗酶液。

上述發(fā)酵條件優(yōu)化每個(gè)處理均為3個(gè)重復(fù)。

1.2.3 菌株X8P胞外酯酶酶學(xué)性質(zhì)

1.2.3.1 菌株X8P胞外粗酶液制備及粗純化

將菌株X8P發(fā)酵粗酶液經(jīng)超濾濃縮、硫酸銨沉淀和透析除鹽，獲得該菌株角質(zhì)酶粗酶。

1.2.3.2 菌株X8P胞外粗酶適宜pH和pH穩(wěn)定性

適宜pH測(cè)定：在不同pH(pH 2.5～9.5，每隔0.5設(shè)1個(gè)測(cè)試點(diǎn))測(cè)定菌株粗酶活性，反應(yīng)溫度50 ℃。

pH穩(wěn)定性測(cè)定：將菌株X8P粗酶液按1∶9的比例與不同pH(pH 2.5～9.5，每隔0.5設(shè)1個(gè)測(cè)試點(diǎn))緩沖液稀釋混勻，將稀釋粗酶液于50 ℃水浴處理30 min后，迅速冰水冷卻(30 min)，測(cè)定稀釋液酶活性。

1.2.3.3 菌株X8P胞外粗酶適宜溫度和溫度穩(wěn)定性

適宜溫度測(cè)定：將菌株X8P粗酶液適當(dāng)稀釋于50 mmol/L、pH 6.5 MES緩沖液后，分別在30～80 ℃(每隔5 ℃為1個(gè)測(cè)試點(diǎn))下測(cè)定酶活性。

溫度穩(wěn)定性測(cè)定：將菌株X8P粗酶液分別在不同溫度(0～80 ℃，每隔10 ℃為1個(gè)測(cè)試點(diǎn))處理30 min，緩沖液為50 mmol/L、pH 6.5 MES緩沖液，冰水浴30 min，測(cè)定殘余酶活性。

1.2.3.4 有機(jī)試劑對(duì)菌株X8P胞外粗酶活性影響

將甲醇、乙醇、甘油、異丙醇、丙酮、二甲基亞砜、乙腈等有機(jī)試劑分別以50%(v/v)和80%(v/v)終濃度與菌株X8P粗酶液在30 ℃保溫60 min后，迅速冰水浴30 min，測(cè)定殘余酶活性。以未加有機(jī)試劑的對(duì)照酶活性為100%。

1.2.3.5 表面活性劑和金屬離子對(duì)菌株X8P胞外粗酶活性影響

表面活性劑影響：將吐溫(Tween)-20、Tween-80、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)、聚乙二醇辛基苯基醚(Triton-100)等表面活性劑(1和10 mmol/L)和菌株X8P粗酶液在30 ℃保溫60 min后，迅速冰水浴30 min，測(cè)定殘余酶活性，以未加表面活性劑對(duì)照酶活性為100%。

金屬離子影響：將溶于50 mmol/L、pH 6.5 MES緩沖液的1和10 mmol/L金屬離子[鈉離子(Na+)、鎂離子(Mg2+)、錳離子(Mn2+)、鈣離子(Ca2+)、鋇離子(Ba2+)、二價(jià)鐵離子(Fe2+)、鋅離子(Zn2+)、銅離子(Cu2+)、鉀離子(K+)、鎳離子(Ni2+)、三價(jià)鐵離子(Fe3+)]與菌株粗酶液在30 ℃保溫60 min，冰水浴30 min，測(cè)定殘余酶活性。以未加金屬離子對(duì)照酶活性為100%。

上述酶學(xué)性質(zhì)試驗(yàn)結(jié)果取3次平均值。

1.2.4 酯酶活性測(cè)定方法

酯酶活性測(cè)定參照劉春紅等[10]方法，并進(jìn)行少許改進(jìn)：移取50 μL酶液, 加入pH 6.5緩沖液800 μL，然后加入50 μL α-乙酸萘酯溶液，50 ℃恒溫水浴反應(yīng)10 min，加入50 μL 3%SDS水溶液終止反應(yīng)，再加入50 μL 0.03%固蘭B鹽溶液顯色，混勻計(jì)時(shí)30 s后，再加入50 μL 1∶1(v/v)鹽酸溶液混勻使其顯色穩(wěn)定，將酶液換為蒸餾水作為空白對(duì)照，檢測(cè)并記錄535 nm吸光度數(shù)據(jù)，酶活性(U)定義為在以上條件下，每分鐘反應(yīng)生成1.0 μmol/L α-乙酸萘酚所需要酶量。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Excel 2007統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行初步整理和統(tǒng)計(jì)，并用繪圖軟件Graphpad Prism 5繪制折線圖和柱狀圖。

2 結(jié) 果

2.1 菌株鑒定

菌株X8P單菌落形態(tài)：圓形點(diǎn)狀凸起，顏色微黃，黏稠，邊緣平滑，有光澤，不透明，表面光滑無(wú)褶皺。菌株16S rDNA Blast結(jié)果顯示菌株X8P與東方醋桿菌(Acetobacterorientalis)21F-2同源性可達(dá)99%，通過(guò)菌株菌落形態(tài)特征、遺傳距離初步判定并命名為AcetobacterorientalisX8P。

菌株X8P 16S rDNA序列測(cè)序結(jié)果如下：

菌株X8P系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)見(jiàn)圖1。

2.2 菌株X8P產(chǎn)酯酶發(fā)酵條件優(yōu)化

2.2.1 碳源對(duì)菌株X8P產(chǎn)酯酶的影響

由圖2可知，1%橄欖油、堿處理角質(zhì)、角質(zhì)、葡萄糖和蔗糖促進(jìn)菌株X8P產(chǎn)酶，橄欖油促進(jìn)作用最明顯，使活性提高11倍左右。1%玉米芯、麩皮和秸稈對(duì)菌株X8P產(chǎn)酶影響不大，而1%可溶性淀粉對(duì)菌株X8P產(chǎn)酶有明顯抑制作用。菌株X8P以橄欖油為適宜碳源。

2.2.2 氮源對(duì)菌株X8P產(chǎn)酯酶的影響

由圖3可知，在LB培養(yǎng)基和適宜碳源基礎(chǔ)上，再添加無(wú)機(jī)氮和有機(jī)氮均明顯抑制菌株X8P產(chǎn)酶。

2.2.3 發(fā)酵溫度對(duì)菌株X8P產(chǎn)酯酶的影響

由圖4可知，菌株X8P在37 ℃發(fā)酵產(chǎn)酶量最大，室溫不利于產(chǎn)酶，超過(guò)適宜溫度后，產(chǎn)酶量急劇下降。

2.2.4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)菌株X8P產(chǎn)酯酶的影響

由圖5可知，菌株X8P在第1～2天發(fā)酵產(chǎn)酶量較少，自第3天開(kāi)始產(chǎn)酶量急劇增加，至第4天時(shí)達(dá)到最高，此后酶活性呈下降趨勢(shì)。因此，菌株X8P適宜發(fā)酵時(shí)間為4 d。

圖1 菌株X8P系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

圖2 碳源對(duì)菌株X8P產(chǎn)酯酶的影響

圖3 氮源對(duì)菌株X8P產(chǎn)酯酶的影響

2.3 菌株X8P胞外酯酶粗酶酶學(xué)性質(zhì)

2.3.1 菌株X8P胞外酯酶粗酶適宜pH和pH穩(wěn)定性

由圖6可知，菌株胞外粗酶適宜pH 6.5，在pH 4.0以下，酶活性幾乎全部喪失。在堿性環(huán)境時(shí)，酶活性急劇喪失。具有一定的pH穩(wěn)定性，在pH 6.5～7.5內(nèi)30 min，活性可保留60%以上。

2.3.2 菌株X8P胞外酯酶粗酶適宜溫度和溫度穩(wěn)定性

由圖7可知，菌株酶活性在45 ℃時(shí)最高，動(dòng)物體溫下酶活性約為適宜溫度的80%，具有較好的溫度適應(yīng)性，在30～65 ℃有較高活性(50%以上)，超過(guò)65 ℃時(shí)，酶活性急劇下降(殘余活性10%左右)。在20～45 ℃處理30 min，酶活性保留50%以上。

圖4 發(fā)酵溫度對(duì)菌株X8P產(chǎn)酯酶的影響

圖5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)菌株X8P產(chǎn)酯酶的影響

圖6 pH對(duì)菌株X8P胞外酯酶粗酶活性的影響及pH穩(wěn)定性

圖7 溫度對(duì)菌株X8P胞外酯酶粗酶活性的影響及溫度穩(wěn)定性

2.3.3 有機(jī)試劑對(duì)菌株X8P胞外酯酶粗酶活性影響

由圖8可知，菌株X8P粗酶僅在甘油(50%和80%)中保留全部活性，在二甲基亞砜(DMSO)(50%)中活性可保留66%，在其他有機(jī)溶劑中，活性均喪失。

2.3.4 表面活性劑對(duì)菌株X8P胞外酯酶粗酶酶活性影響

由圖9可知，SDS強(qiáng)烈抑制菌株酶活性，濃度越高，抑制作用越明顯。Tween-20(1 mmol/L)和Tween-80(1 mmol/L)使菌株酶活促進(jìn)2%～3%，而Tween-20(10 mmol/L)和Tween-80(10 mmol/L)抑制酶活性。Triton-100(1和10 mmol/L)使酶活性提高30%～35%。

2.3.5 金屬離子對(duì)菌株X8P胞外酯酶粗酶活性的影響

由圖10可知，K+、Mn2+(1和10 mmol/L)使菌株酶活性提高2%～20%，F(xiàn)e2+和Ni2+對(duì)酶活性影響不大。Zn2+明顯抑制酶活性。Mg2+、Ca2+、Ba2+、Na+、Fe3+、Cu2+(1 mmol/L)使酶活性提高10%～20%，Mg2+、Ca2+、Ba2+、Na+、Fe3+、Cu2+(10 mmol/L)對(duì)酶活性有抑制作用。

圖8 有機(jī)溶劑對(duì)菌株X8P胞外酯酶粗酶活性的影響

圖9 表面活性劑對(duì)菌株X8P胞外酯酶粗酶活性的影響

圖10 金屬離子對(duì)菌株X8P胞外酯酶粗酶活性的影響

3 討 論

目前，已知植物角質(zhì)降解菌來(lái)源有真菌、放線菌和細(xì)菌。角質(zhì)降解真菌研究最為廣泛，而角質(zhì)降解細(xì)菌了解不多。本實(shí)驗(yàn)室篩選獲得1株細(xì)菌，經(jīng)鑒定命名為AcetobacterorientalisX8P，目前尚無(wú)關(guān)于醋酸桿菌產(chǎn)角質(zhì)降解酶的報(bào)道。

角質(zhì)降解菌所產(chǎn)角質(zhì)酶為高度誘導(dǎo)酶[11]，其產(chǎn)酶量受發(fā)酵條件和培養(yǎng)基成分影響較大[5,12]。在本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，菌株X8P在37 ℃發(fā)酵4 d，酶活性達(dá)到最高，這與前人研究結(jié)果[5,12-13]一致。Yang等[13]研究發(fā)現(xiàn)，太瑞斯梭孢殼(Thielaviaterrestris)CAU709適宜產(chǎn)酶溫度50 ℃。Fett等[5]研究的銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)1499A和DAR41352發(fā)酵24～48 h達(dá)到最大活性。這與本試驗(yàn)結(jié)果不同，可能是菌株差異所致。油脂常被用作發(fā)酵產(chǎn)酯酶的碳源[14-15]。橄欖油作為碳源可強(qiáng)烈誘導(dǎo)菌株X8P產(chǎn)酶，其酯酶活性增加11倍左右?？扇苄缘矸垡种凭闤8P產(chǎn)酶，這與之前報(bào)道結(jié)果[16]一致。葡萄糖促進(jìn)菌株X8P產(chǎn)酶，這與以往多數(shù)報(bào)道結(jié)果[11,15-16]不同。Sebastian等[17]發(fā)現(xiàn)，在發(fā)酵過(guò)程中補(bǔ)充添加葡萄糖不會(huì)抑制谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumsp)產(chǎn)角質(zhì)酶，說(shuō)明葡萄糖是否抑制菌株產(chǎn)酯酶仍需探討。此外，角質(zhì)水解產(chǎn)物可誘導(dǎo)菌株X8P產(chǎn)酶，這與真菌類似[11,17-18]。添加無(wú)機(jī)氮和有機(jī)氮均對(duì)菌株X8P產(chǎn)酶有明顯抑制作用。Kleeberg等[16]發(fā)現(xiàn)，礦物質(zhì)培養(yǎng)基中添加蛋白胨時(shí)，嗜熱放線菌(Thermobifidafusca)DSM 43793生物量增加，但聚酯膜降解酶未增加。所以添加無(wú)機(jī)氮和有機(jī)氮抑制菌株X8P產(chǎn)酶的可能原因是LB培養(yǎng)基中氮源物質(zhì)已可滿足菌株X8P發(fā)酵產(chǎn)酶，額外添加的氮源使菌株X8P持續(xù)生長(zhǎng)傳代，使同時(shí)期時(shí)處于產(chǎn)酶階段微生物量減少，從而導(dǎo)致酶產(chǎn)量降低。

酶蛋白適宜pH和pH穩(wěn)定性是其重要性質(zhì)之一。目前，文獻(xiàn)報(bào)道的大部分角質(zhì)酶適宜pH均在6.0～10.0內(nèi)[7,18-20]。本研究發(fā)現(xiàn)，菌株X8P胞外粗酶適宜pH 6.5，這與來(lái)源于Thermobifidafusca和花粉角質(zhì)酶適宜pH一致[16-17]，在pH 4.5～8.5之間，菌株X8P酶活性可保留50%以上。此外，菌株X8P胞外粗酶在pH 6.5～7.5內(nèi)30 min，酶活性可保留60%以上。菌株X8P胞外粗酶適宜溫度45 ℃，與已知角質(zhì)酶適宜溫度一致[7,19-20]，在30～60 ℃均有較高活性(50%以上)，在0～50 ℃處理30 min，酶活性保留60%以上。不同來(lái)源角質(zhì)酶溫度穩(wěn)定性存在一定差異。Fett等[11]發(fā)現(xiàn)通高溫放線菌(Thermoactinomycesvulgaris)NRRL B-16117角質(zhì)酶在50～60 ℃條件下1 h，酶活性幾乎不變，在70 ℃半衰期30 min，而真菌Fusariumsolanipisi角質(zhì)酶在40 ℃條件下85 h、60 ℃條件5 min，活性喪失50%[20]。這說(shuō)明角質(zhì)酶的溫度穩(wěn)定性與菌種來(lái)源存在較大關(guān)系。

本試驗(yàn)中，菌株X8P粗酶在甘油(50%和80%)中可保留全部活性，在DMSO(50%)中活性保留66%，在其他有機(jī)溶劑中，活性全部喪失，這與已有文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果[15,21]一致。SDS強(qiáng)烈抑制菌株X8P粗酶活性，這與已有文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果[21-22]一致。酶蛋白活性易受金屬離子影響。本研究發(fā)現(xiàn)，K+、Mn2+(1和10 mmol/L)使菌株X8P粗酶活性提高2%～20%，F(xiàn)e2+和Ni2+對(duì)粗酶活性影響不大。Zn2+明顯抑制粗酶活性。Mg2+、Ca2+、Ba2+、Na+、Fe3+、Cu2+(1 mmol/L)使粗酶活性提高10%～20%，Mg2+、Ca2+、Ba2+、Na+、Fe3+、Cu2+(10 mmol/L)對(duì)粗酶活性有抑制作用。Sebastian等[23]研究表明，Ca2+、Mg2+和Cu2+等金屬離子及螯合物不會(huì)影響細(xì)菌和真菌角質(zhì)酶的活性，而會(huì)影響花粉角質(zhì)酶的活性[17]。

4 結(jié) 論

① 角質(zhì)降解菌X8P經(jīng)鑒定為AcetobacterorientalisX8P，其適宜發(fā)酵條件為37 ℃、發(fā)酵4 d，1%橄欖油強(qiáng)烈促進(jìn)菌株X8P產(chǎn)酶，1%可溶性淀粉抑制菌株X8P產(chǎn)酶。

② 菌株胞外粗酶適宜溫度45 ℃，適宜pH 6.5，且具有一定的pH穩(wěn)定性，在甘油(50%和80%)中可保留全部活性，而在DMSO(50%)中活性可保留66%，Triton-100、K+、Mn2+(1和10 mmol/L)及Mg2+、Ca2+、Ba2+、Na+、Fe3+、Cu2+(1 mmol/L)對(duì)菌株X8P粗酶活性有部分促進(jìn)作用。

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*Corresponding author, associate professor, E-mail: zhty999@163.com

(責(zé)任編輯 武海龍)

Identification, Fermentation Conditions Optimization and Enzymatic Properties of Cutin Degrading Bacteria

LIANG Zhengwen1ZHANG Tieying1*LI Shuang1LIU Junli2

(1. State Key Laboratory of Animal Nutrition, Institute of Animal Science, Chinese Academy of Agricultural Science, Beijing 100193, China; 2. College of Animal Science and Technology, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China)

The present study was designed to identify the cutin degrading strain X8P, their fermentation conditions and enzymatic properties were also explored, to investigate the degradation of plant cuticular surface, and to improve the possible new schemes for the utilization of plant fiber. The strain X8P was identified by morphology observation and 16S rDNA sequencing, and the optimal fermentation conditions of carbon source, nitrogen source, fermentation temperature and fermentation time for enzyme production were investigated. After precipitating crude extracellular enzyme protein by ammonium sulfate, we studied the optimum pH and pH stability and temperature and temperature stability of crude extracellular enzyme, and the effect of organic solvents, surfactants and metal ions on crude enzyme. The results showed as follows: 1) the strain X8P was successfully identified asAcetobacterorientalisby colony morphological characteristic observing and 16S rDNA sequencing. 2) The optimal fermentation conditions of the strain X8P were temperature 37 ℃ and fermentation time for 4 days in the lysogeny broth (LB) medium. The LB medium supplemented with 1% olive oil and glucose was significantly promoted enzyme production, and supplemented with 1% soluble starch inhibited the enzyme production. 3) The optimum temperature and pH of the strain X8P’s extracellular esterase with good pH stability were 45 ℃ and pH 6.5. In tested organic solvents, the enzyme exhibited part of cutinolytic esterase activity only in dimethyl sulfoxide (DMSO)(50%). Tween-20 (1 mmol/L), Tween-80 (1 mmol/L) and Triton-100 (1 and 10 mmol/L) could improve the extracellular enzyme activity as 3% to 35%. Metal ions such as K+, Mn2+(1 and 10 mmol/L) could improve extracellular enzyme activity as 2% to 20%. Therefore, the strain X8P has certain enzyme potential and application prospects, worthy of further study.[ChineseJournalofAnimalNutrition, 2016, 28(11)：3567-3575]

cutin; cutinase; cutin degrading bacteria; fermentation conditions optimization; enzymatic properties

2016-05-01

梁爭(zhēng)文(1991—)，男，河南洛陽(yáng)人，碩士研究生，動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)專業(yè)。E-mail： 13126664873@163.com

*通信作者：張鐵鷹，副研究員，碩士生導(dǎo)師，E-mail： zhty999@163.com

10.3969/j.issn.1006-267x.2016.11.025

S811.6

A

1006-267X(2016)11-3567-09