林詩瑤 叢日琳 李 琦 孫照霞 徐 偉 沙 玫 余麗雙

(福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福州 350122)

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微乳液毛細(xì)管電動(dòng)色譜法測(cè)定大鼠滑膜細(xì)胞中雷公藤甲素的含量

林詩瑤 叢日琳 李 琦 孫照霞 徐 偉 沙 玫 余麗雙*

(福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福州 350122)

建立微乳液毛細(xì)管電動(dòng)色譜法快速測(cè)定大鼠滑膜細(xì)胞內(nèi)外液中雷公藤甲素含量的方法。在雷公藤甲素不同給藥時(shí)間孵育條件下，將滑膜細(xì)胞分為空白對(duì)照組和給藥組，測(cè)定滑膜細(xì)胞內(nèi)外液中雷公藤甲素含量，并比較了細(xì)胞外液中雷公藤甲素在不同給藥時(shí)間的含量變化。毛細(xì)管電泳運(yùn)行緩沖液組成：1%(w/V)SDS，3%(V/V)正丁醇，1%(V/V)乙酸乙酯，96%(V/V)5 mmol/L硼砂-10 mmol/L磷酸鹽溶液, pH 9.0； 運(yùn)行電壓：25 kV； 壓力進(jìn)樣：0.5 psi×6 s；電泳操作溫度：25℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：214 nm。結(jié)果表明，細(xì)胞內(nèi)外液中的雷公藤甲素所呈現(xiàn)的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)分別為0.9995和 0.9991。當(dāng)給藥24 h時(shí)，細(xì)胞內(nèi)外液中的雷公藤甲素濃度分別為0.736和20.745 μg/mL。本方法簡(jiǎn)單準(zhǔn)確、靈敏度高、精密度好，可用于滑膜細(xì)胞內(nèi)外液中雷公藤甲素濃度的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律研究，為進(jìn)一步研究中藥有效成分對(duì)滑膜細(xì)胞功能和活性的影響提供方法學(xué)基礎(chǔ)。

微乳液毛細(xì)管電動(dòng)色譜；滑膜細(xì)胞；雷公藤甲素

1 引 言

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis, RA)是一種以關(guān)節(jié)滑膜炎為特征的慢性全身性自身免疫性疾病，以多關(guān)節(jié)炎癥、滑膜增生和骨侵蝕為基本特征在我國的患病率高，是造成人群?jiǎn)适趧?dòng)力和致殘的主要疾病之一[1]?；ぱ资前l(fā)生在關(guān)節(jié)內(nèi)滑膜組織的一種炎性病變，滑膜炎伴大量血管翳形成是導(dǎo)致RA骨侵蝕、關(guān)節(jié)破壞的主要原因[2]。

現(xiàn)代臨床上治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎主要采用非甾體抗炎藥、慢作用抗風(fēng)濕藥、腎上腺皮質(zhì)激素類藥等。已有文獻(xiàn)報(bào)道，衛(wèi)矛科植物雷公藤(TripterygiumwilfordiiHook.f.)對(duì)治療免疫性炎癥反應(yīng)性疾病具有一定療效[3]。雷公藤甲素(Triptolide，TP，化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1)是從雷公藤中分離出來的活性最高的環(huán)氧化二萜內(nèi)酯化合物，是雷公藤治療RA的主要有效成分之一，其具有抗炎免疫功效。目前，以雷公藤甲素為主要活性成分的多種雷公藤提取物在臨床治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎療效確切，已得到廣泛認(rèn)可[4]。對(duì)TP在RA治療研究主要集中在其作用機(jī)理上，而文獻(xiàn)報(bào)道中，大多是在中藥材[5]、動(dòng)物血液和尿液等體液中對(duì)TP的檢測(cè)，尚未見細(xì)胞液中TP含量測(cè)定的報(bào)道。細(xì)胞內(nèi)、外液中TP的含量直觀反映了其在生物體內(nèi)的代謝情況，為藥代動(dòng)力學(xué)的研究提供更為有利的依據(jù)，因此對(duì)雷公藤甲素在生物細(xì)胞中的含量測(cè)定具有重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

1991年，Watarai首次應(yīng)用微乳液作為毛細(xì)管電泳的分離介質(zhì)，從而形成了一種新的毛細(xì)管電泳技術(shù)-微乳液毛細(xì)管電動(dòng)色譜法(Microemulsion eletrokinetic chromatography，MEEKC)[6～8]。MEEKC是在電滲流的驅(qū)動(dòng)下，對(duì)陰離子、陽離子和中性物質(zhì)同時(shí)進(jìn)行分離的一種CE模式[9]，多用于藥物分析[10,11]、生物樣品或代謝產(chǎn)物分析[12]等方面。相比于HPLC，MEEKC具有分析速度快、試劑消耗少、分析成本低等優(yōu)勢(shì)。

目前，MEEKC在滑膜細(xì)胞液中藥物含量測(cè)定未見報(bào)道，因此本研究以大鼠滑膜細(xì)胞為研究對(duì)象，利用微乳液毛細(xì)管電動(dòng)色譜法，測(cè)定大鼠滑膜細(xì)胞內(nèi)、外液中雷公藤甲素的含量，為雷公藤甲素在臨床治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎研究提供一種快速可行的含量檢測(cè)新方法，亦進(jìn)一步拓寬MEEKC的應(yīng)用范圍，為細(xì)胞中藥物代謝研究提供新方法。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試藥

P/ACETM MDQ型毛細(xì)管電泳儀，配備DAD檢測(cè)器和32 Karat 5.0工作站(美國Beckman公司)；彈性石英毛細(xì)管(內(nèi)徑75 μm，總長(zhǎng)60.5 cm，有效長(zhǎng)度50 cm)；Starter 3C型酸度計(jì)(上海奧豪斯儀器有限公司)；XS105電子分析天平(METTLER TOLEDO); KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司); QL-861型渦旋儀(江蘇海門其林貝爾有限公司)。

RPM DMEM(Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium，美國Gibco公司)； 0.25% 胰蛋白酶-0.02% EDTA消化液(HyClone公司)； 雷公藤甲素標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)：111567-200502，中國藥品生物制品檢定所)； PBS液均按標(biāo)準(zhǔn)配制(pH 7.4); 二甲基亞砜(DMSO，Sigma公司); 十二烷基硫酸鈉(SDS，合肥新恩源生物科技有限公司); 乙酸乙酯、正丁醇為色譜純?cè)噭鹕?、NaH2PO4(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q系統(tǒng)(Millipore公司)處理的超純水。

2.2 對(duì)照品溶液配制

稱取雷公藤甲素對(duì)照品適量，用甲醇溶解并制成1 mg/mL的樣品儲(chǔ)備液。

稱定雷公藤甲素對(duì)照品適量，用含有0.5% DMSO的培養(yǎng)基溶解并制成濃度為1 mg/mL 的溶液，細(xì)胞給藥時(shí)可用培養(yǎng)基稀釋。

2.3 細(xì)胞的復(fù)蘇與培養(yǎng) 從液氮中取出凍存的大鼠滑膜細(xì)胞，將凍存管立即投入37℃水浴鍋中，迅速搖動(dòng)，待凍存液完全溶解后(約1.5 min)，用酒精擦拭凍存管外壁，放于超凈工作臺(tái)。吸取細(xì)胞懸液至裝有5倍體積培養(yǎng)基的離心管中，低速(800 r/min) 離心5 min。棄掉上清液，加1 mL培養(yǎng)基，輕輕將細(xì)胞吹打混勻，傳代至25 cm2的培養(yǎng)瓶中。標(biāo)記后，放到37℃、5% CO2飽和濃度的培養(yǎng)箱中孵育，待細(xì)胞貼壁后換新鮮培養(yǎng)基。每3天換一次培養(yǎng)基，至細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)極佳融合時(shí)開始實(shí)驗(yàn)。

2.4 雷公藤甲素對(duì)滑膜細(xì)胞的處理

在滑膜細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)極佳融合時(shí)，棄去舊培養(yǎng)液，以PBS液沖洗細(xì)胞2次，用0.25%胰酶于室溫條件下消化細(xì)胞，3 min后，加入2倍體積的培養(yǎng)基終止消化。輕輕吹打細(xì)胞，使細(xì)胞脫離培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)壁，吸取出細(xì)胞懸液至離心管中，低速(800 r/min) 離心5 min。棄上清液，加入2 mL培養(yǎng)基吹打混勻，并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。以PBS液將細(xì)胞調(diào)整為終密度1×105cell/mL的細(xì)胞懸液，接種于24孔板中，置培養(yǎng)箱孵育24 h，使細(xì)胞貼壁。

實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組與給藥處理組。待細(xì)胞完全貼壁后棄掉舊培養(yǎng)基，給藥處理組分為4組，分別用含25 μg/mL雷公藤甲素的培養(yǎng)液處理0, 6, 10和24 h?？瞻讓?duì)照組加入相同濃度配藥所用的DMSO和培養(yǎng)基。然后各實(shí)驗(yàn)組均于37℃、5% CO2濃度培養(yǎng)孵育。

2.5 樣品的處理方法

2.5.1 細(xì)胞外液中雷公藤甲素的處理 取各實(shí)驗(yàn)組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞的培養(yǎng)液，以1∶2的體積比加入甲醇渦旋混勻后，離心10 min (14000 r/min ) 以除去蛋白，待上清液氮?dú)獯蹈珊螅?0%的甲醇渦旋1 min復(fù)溶，離心10 min (14000 r/min )，取上清液進(jìn)行分析。

2.5.2 細(xì)胞內(nèi)液中雷公藤甲素的處理 吸掉培養(yǎng)液后，每孔加入300 μL裂解液，冰浴裂解1 h，取各實(shí)驗(yàn)組裂解后的細(xì)胞液，參照“2.5.1項(xiàng)”中細(xì)胞外液的處理方法進(jìn)行操作，然后分析。

3 結(jié)果與討論

3.1 MEEKC分離及工作條件

未涂層毛細(xì)管： 60.5 cm×75 μm (有效長(zhǎng)度為50 cm)；電泳運(yùn)行緩沖液組成： 1%(w/V)SDS，3%(V/V)正丁醇，1%(V/V)乙酸乙酯，96%(V/V)5 mmol/L硼砂-10 mmol/L磷酸鹽溶液, pH 9.0, 超聲30 min得到的透明、穩(wěn)定的微乳液(使用前需過0.22 μm微孔濾膜)；運(yùn)行電壓：25 kV；電泳實(shí)驗(yàn)操作溫度：25℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：214 nm，壓力進(jìn)樣0.5 psi× 6 s。新的毛細(xì)管使用前需要活化，即分別用水、0.1 mol/L HCl、水、0.1 mol/L NaOH、水各沖洗20 min；每次進(jìn)樣前，需用分離緩沖溶液沖洗2 min，每次更換樣品時(shí)需同時(shí)更換新鮮分離緩沖溶液，以保證遷移時(shí)間和峰面積的重現(xiàn)性。

在上述條件下，雷公藤甲素標(biāo)準(zhǔn)品的電泳色譜圖如圖1所示。

圖1 雷公藤甲素結(jié)構(gòu)及其對(duì)照品的電泳譜圖Fig.1 Structure and electropherogram of standard triptolide

3.2 MEEKC方法特性

3.2.1 線性關(guān)系實(shí)驗(yàn) 取適量雷公藤甲素對(duì)照品溶液用超純水依次稀釋成25, 20, 15, 10, 5和1 μg/mL 的雷公藤甲素標(biāo)準(zhǔn)溶液。按“3.1項(xiàng)”電泳工作條件進(jìn)行MEEKC分析，以雷公藤甲素濃度為橫坐標(biāo)(x)，雷公藤甲素的峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，進(jìn)行線性回歸。細(xì)胞內(nèi)液在1.0～15.0 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，其標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=420.95x-156.14(r=0.9995)；細(xì)胞外液在5.0～25.0 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，其標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=282.83x+261.5(r=0.9991)。

3.2.2 專屬性試驗(yàn) 取給藥處理組的細(xì)胞內(nèi)液和外液，分別加入適量濃度的雷公藤甲素對(duì)照品溶液，按照“2.5項(xiàng)”的樣品處理方法操作，并進(jìn)行MEEKC分析，并與空白對(duì)照組樣品和給藥處理組樣品進(jìn)行比較，結(jié)果如圖2和圖3所示。實(shí)驗(yàn)表明，細(xì)胞內(nèi)、外液中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾目標(biāo)成分的測(cè)定，專屬性良好。

圖2 細(xì)胞內(nèi)液樣品的電泳譜圖(1為雷公藤甲素峰)Fig.2 Electropherogram of intracellular samples (Peak 1 was assigned as triptolide)a： 細(xì)胞內(nèi)液空白樣品； b： 細(xì)胞內(nèi)液樣品； c： 細(xì)胞內(nèi)液加標(biāo)樣品。a: Control sample; b. Intracellular sample; c. Sample spiked with standard solution.

圖3 細(xì)胞外液樣品的電泳譜圖(1為雷公藤甲素峰)Fig.3 Electropherogram of extracellular samples (Peak 1 was assigned as triptolide)d. 細(xì)胞外液空白樣品；e. 細(xì)胞內(nèi)液樣品；f. 細(xì)胞內(nèi)液加標(biāo)樣品。d. Control sample, e. Intracellular sample, f. Sample spiked with standard solutions

3.2.3 精密度實(shí)驗(yàn) 取一定濃度的雷公藤甲素標(biāo)準(zhǔn)品溶液，連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定5次，記錄峰面積和遷移時(shí)間。結(jié)果表明，雷公藤甲素峰面積的RSD為3.4%，遷移時(shí)間的RSD為1.0%，RSD均小于5%，說明方法的精密度良好。

3.3 細(xì)胞內(nèi)/外液中雷公藤甲素含量的測(cè)定

采用MEEKC法分別測(cè)定空白對(duì)照組和給藥處理0, 6, 10和24 h細(xì)胞內(nèi)液、外液樣品，以標(biāo)準(zhǔn)加入法定性，其譜圖(給藥處理24 h)如圖2和3所示，細(xì)胞內(nèi)液、外液樣品中的雷公藤甲素均可進(jìn)行定性分析。通過外標(biāo)法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)液、外液樣品中雷公藤甲素的含量，不同給藥時(shí)間的細(xì)胞外液中雷公藤甲素的含量如表1所示，其濃度與給藥時(shí)間的關(guān)系如圖4所示；給藥處理24 h細(xì)胞內(nèi)外液樣品中雷公藤甲素的含量見表2。

3.4 回收率實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確吸取一定濃度的給藥處理24 h細(xì)胞內(nèi)、外液樣品，分別加入適量的雷公藤甲素標(biāo)準(zhǔn)品溶液，利用已建立的MEEKC方法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)、外液中雷公藤甲素的峰面積，平行測(cè)定3次，根據(jù)當(dāng)天所建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算平均回收率，結(jié)果如表2所示。

表1 不同給藥時(shí)間的細(xì)胞外液中雷公藤甲素對(duì)應(yīng)的峰面積和含量

Table 1 Peak area and concentration of triptolide of various delivery time in extracellular samples

給藥時(shí)間Deliverytime(h)峰面積Peakarea濃度Concentration(μg/mL)0247125.006233923.5010231223.2024209520.74

表2 細(xì)胞內(nèi)外液樣品中雷公藤甲素含量的測(cè)定結(jié)果

Table 2 Results of triptolide determination in synoviocyte samples

樣品Samples(24h)峰面積Peakarea濃度Concentration(μg/mL)回收率Recovery(%,n=3)細(xì)胞內(nèi)液Intracellularsamples3080.736119.0細(xì)胞外液Extracellularsamples209520.74103.8

圖4 細(xì)胞外液中雷公藤甲素濃度與給藥時(shí)間的關(guān)系Fig.4 Relationship of triptolide concentration and delivery time inextracellular samples

3.5 甲醇用量對(duì)雷公藤甲素分離的影響討論

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，復(fù)溶雷公藤甲素的甲醇含量直接影響毛細(xì)管電泳的檢測(cè)效果。甲醇百分比含量過高，易造成電泳進(jìn)樣時(shí)堵管，基線不穩(wěn)定，影響測(cè)定；甲醇含量太低，則易造成復(fù)溶時(shí)雷公藤甲素?zé)o法全部溶到甲醇溶液中，導(dǎo)致檢測(cè)成分喪失，影響檢測(cè)結(jié)果。綜合上述因素及檢測(cè)效果，本實(shí)驗(yàn)選擇50%甲醇溶液復(fù)溶雷公藤甲素。

4 結(jié) 論

利用微乳液毛細(xì)管電動(dòng)色譜法對(duì)大鼠滑膜細(xì)胞內(nèi)外液中的雷公藤甲素進(jìn)行了定性定量分析。在所建立的分離檢測(cè)條件下，雷公藤甲素在6 min內(nèi)出峰，并且出峰穩(wěn)定。方法學(xué)考察表明，本方法重現(xiàn)性好，精密度高，能快速有效地實(shí)現(xiàn)目標(biāo)成分的分離，避免了其它內(nèi)源性物質(zhì)的干擾，樣品含量測(cè)定和回收率結(jié)果令人滿意，可用于滑膜細(xì)胞中雷公藤甲素的藥物濃度測(cè)定。本方法為測(cè)定滑膜細(xì)胞中藥物代謝過程的殘留含量提供方法學(xué)基礎(chǔ)，其可與其它藥理研究方法相互補(bǔ)充，為雷公藤甲素在臨床上治療滑膜炎奠定相關(guān)理論基礎(chǔ)。

1 ZHANG Qian-De, SHI Yan-Biao, TAN Wen-Feng, WANG Fang.ACTAUniversitatisMedicinalisNanjing(NaturalScience), 2008, 28(7): 902-905

張前德, 時(shí)彥標(biāo), 談文峰, 王 芳. 南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2008, 28(7): 902-905

2 HE Guan, DENG Xiu-Qin, JIANG Qing.MedicalAestheticsandCosmetology, 2013, (9): 111-113

何 冠, 鄧秀琴, 江 慶. 醫(yī)學(xué)美學(xué)美容(中旬刊), 2013, (9): 111-113

3 ZHAO Tai-Ping, XU Yu-Dong, ZHU Yong-Jie.GuideofChinaMedicine, 2012, 10(10): 476-477

趙太平, 徐玉東, 朱勇杰. 中國醫(yī)藥指南, 2012, 10(10): 476-477

4 LI Guang-Tao.JournalofChinaTraditionalChineseMedicineInfornation, 2010, 2(35): 69, 94

李廣濤. 中國中醫(yī)藥咨訊, 2010, 2(35): 69, 94

5 JIANG Yin-Yan, GUO Li-Juan, CUI Xiao-Ying, WANG Cui-Qiong, HU Xiao-Jian, LI Jian-Ming.JournalofInstrumentalAnalysis, 2015, 34(2): 189-193

蔣銀燕, 郭麗娟, 崔小瑩, 王翠瓊, 胡小建, 李建明. 分析測(cè)試學(xué)報(bào), 2015, 34(2): 189-193

6 CHEN Jian-Hong, XIA Pei-Yuan, WANG Zhang-Yang, WU Nan, DAI Qing, SUN Feng-Jun, YANG Bo, XIANG Rong-Feng.Chin.Hosp.Pharm.J., 2010, 30(5): 353-356

陳劍鴻, 夏培元, 王章陽, 吳 南, 戴 青, 孫鳳軍, 楊 波, 向榮鳳. 中國醫(yī)院藥學(xué)雜志, 2010, 30(5): 353-356

7 ZHANG Ting.ChemicalEngineer, 2011, (11): 25-27

張 婷. 化學(xué)工程師, 2011, (11): 25-27

8 LIU Wei-Lin, ZHANG Lin-Jing.ChineseJournalofEthnomedicineandEthnopharmacy, 2012, 21(3): 11-14

劉偉林, 張琳婧. 中國民族民間醫(yī)藥, 2012, 21(3): 11-14

9 Yu L S, Chu K D, Ye H Z, Liu X X, Yu L S, Xu X Q, Chen G N.TRACTrendsAnaly.Chem., 2012, 34: 140-151

10 Suonan Yuzhen.Tibet′sScience&Technology, 2009, (5): 45-49

索南玉珍. 西藏科技, 2009, (5): 45-49

11 Yu L S, Xu X Q, Huang L, Lin J M, Chen G N.J.Chromatogr.A, 2008, 1198-1199: 220-225

12 ZHANG Yu, LI Qin, LU Ming-Hua, ZHANG Lan, CHEN Guo-Nan, CAI Zong-Wei.ChineseJournalofChromatography, 2011, (8): 791-797

張 雨, 李 琴, 盧明華, 張 蘭, 陳國南, 蔡宗葦. 色譜, 2011, (8): 791-797

(Received 13 June 2015; accepted 12 September 2015)

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (No.81202913)

Determination of Triptolide in Rat Synoviocytes by Microemulsion Electrokinetic Chromatography

LIN Shi-Yao, CONG Ri-Lin, LI Qi, SUN Zhao-Xia, XU Wei, SHA Mei, YU Li-Shuang*

(CollegeofPharmacy,FujianUniversityofTraditionalChineseMedicine,Fuzhou350122,China)

A method was established for the determination of triptolide in rat synoviocytes by microemulsion electrokinetic chromatography (MEEKC). Synoviocytes were divided into control groups and treatment groups by the different administration time of triptolide, and the concentrations of triptolide in intercellular and extracellular fluid were determined. The determination of triptolide by MEEKC was performed at 25℃ under the conditions including running buffer of 5 mmol/L borate-10 mmol/L phosphate (96%,V/V, pH 9.0) with 1% SDS (w/V), 3% 1-butanol (V/V) and 1% ethyl acetate (V/V), 25 kV of running voltage, 3.45 kPa×6 s of inject pressure and 214 nm of test wavelength. The results showed that triptolide was baseline separation, and there was a good linearity for triptolide in intercellular and extracellular of synoviocytes and the correlation coefficients were 0.9995 and 0.9991, respectively. The concentrations of triptolide in intercellular and extracellular of synoviocytes were 0.736 μg/mL and 20.745 μg/mL, respectively. The present method is simple, accurate, sensitive and precise, and can be used to study dynamic change of the triptolide concentration in rat synoviocytes and provide methodology basis for further study the influence of effective compounds of TCM on synoviocytes' function and activity.

Microemulsion electrokinetic chromatography; Synoviocytes; Triptolide

10.11895/j.issn.0253-3820.150393

本文系由國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.81202913)；福建省科技廳社會(huì)發(fā)展重點(diǎn)項(xiàng)目(No.2013Y0057)、福建省衛(wèi)生系統(tǒng)中青年骨干人才培養(yǎng)項(xiàng)目(No.2014-ZQN-JC-27)、福建中醫(yī)藥大學(xué)校管科研課題-重點(diǎn)學(xué)科專項(xiàng)(No.X2014133-學(xué)科)資助

2015-06-13收稿; 2015-09-12接受

* E-mail: sly2018@126.com