江 濤 馬 良 張宇昊 王佳曼

(西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715)

?

光譜法研究黃曲霉毒素B1與人血清白蛋白的結(jié)合反應(yīng)

江 濤 馬 良*張宇昊 王佳曼

(西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715)

黃曲霉毒素B1(AFB1)是目前發(fā)現(xiàn)的致癌能力最強(qiáng)的真菌毒素，嚴(yán)重危害人畜健康。人血清白蛋白(Human serum albumin, HSA)在結(jié)合、運(yùn)輸內(nèi)源性和外源性等小分子物質(zhì)方面具有重要的生理功能。研究AFB1與HSA的相互作用機(jī)理和作用過(guò)程，在分子毒理學(xué)上具有重要意義。本研究模擬在人體血液pH條件(pH 7.4，離子強(qiáng)度 0.1 mol/L), 通過(guò)熒光淬滅、3D熒光法和圓二色譜(Circular dichroism, CD)等光譜方法研究AFB1與人血清蛋白的相互作用。結(jié)果表明, AFB1與HSA的內(nèi)源熒光淬滅屬于靜態(tài)淬滅，AFB1-HSA在298, 303, 308和313 K 4個(gè)溫度條件下，結(jié)合常數(shù)均為104數(shù)量級(jí)，結(jié)合位點(diǎn)都約為1。根據(jù)Van′t Hoff方程，AFB1-HSA體系是熵增焓減的自發(fā)過(guò)程，分子間主要作用力為疏水作用和氫鍵?；贔?rster′s能量轉(zhuǎn)移，得知AFB1與HSA結(jié)合距離為3.31 nm。競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)表明，AFB1結(jié)合在HSA的siteI位點(diǎn)上，靠近色氨酸Trp-214。通過(guò) 3D熒光分析，AFB1的結(jié)合作用導(dǎo)致了HSA氨基酸殘基微環(huán)境和二級(jí)構(gòu)象發(fā)生變化。圓二色譜的分析結(jié)果表明,二者的結(jié)合使得HSA的α-螺旋含量增加。

黃曲霉毒素B1；人血清白蛋白；結(jié)合反應(yīng)；光譜法

1 引 言

霉菌毒素中黃曲霉毒素B1(Aflatoxin B1, AFB1)是目前已知的最強(qiáng)化學(xué)致癌物之一，能通過(guò)多種途徑污染糧油等農(nóng)產(chǎn)品、食品和飼料等，直接或間接進(jìn)入人類(lèi)食物鏈[1]。據(jù)估計(jì)，全球約有50億人暴露于高水平的AFB1中[2]。血清白蛋白占整個(gè)血漿蛋白的52%～60%，是循環(huán)系統(tǒng)中主要的可溶性蛋白組分，能結(jié)合、運(yùn)輸許多內(nèi)源性和外源性的化合物[3]，且可與外源性物質(zhì)在特異性結(jié)合部位形成非共價(jià)復(fù)合物。毒素分子與血清蛋白結(jié)合，不僅會(huì)延長(zhǎng)毒素的半衰期，而且會(huì)更有利于對(duì)器官的定位和形成高劑量毒素。此外，一旦血漿中的毒素濃度比胃腸道高很多，也會(huì)形成對(duì)毒素分子的被動(dòng)吸收[4]。研究人血清白蛋白與AFB1作用的毒代動(dòng)力學(xué)，對(duì)黃曲霉毒素的毒理學(xué)及其安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估具有極大的借鑒意義，對(duì)于尋找低毒性的潛在競(jìng)爭(zhēng)分子及其降低在體內(nèi)吸收提供理論依據(jù)。

熒光光譜是研究小分子與蛋白相互作用的重要手段[5～7]，而圓二色譜技術(shù)可以從蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)變化的層次討論小分子與蛋白質(zhì)作用情況。目前利用熒光、CD技術(shù)研究藥物與蛋白質(zhì)的相互作用已有許多報(bào)道，但研究外源性毒素分子與血清白蛋白作用的報(bào)道還較少。本研究利用多種分析技術(shù)研究了模擬生理?xiàng)l件(pH 7.40,離子強(qiáng)度0.1)下AFB1與人血清白蛋白的相互作用。先對(duì)加入AFB1的各濃度AFB1-HSA的熒光值進(jìn)行校正，再利用修正的雙對(duì)數(shù)方程分別求出反應(yīng)的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)，由F?rster′s能量轉(zhuǎn)移確定了AFB1與色氨酸殘基的距離，并根據(jù)熱力學(xué)參數(shù)確定了它們之間的主要作用力類(lèi)型，以酮洛芬和布洛芬討論了AFB1在人血清白蛋白上的結(jié)合位置，同時(shí)結(jié)合3D熒光和圓二色譜討論了AFB1對(duì)HSA的二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

UV-2450紫外分光光度計(jì)(日本島津公司)； F-4500熒光分光光度計(jì)(日本日立公司)；MOS-450圓二色譜儀(法國(guó)Bio-logic公司)。 人血清白蛋白(Human serum albumin，HAS, Sigma 公司)，使用時(shí)用緩沖液配制成0.1 mmol/L。黃曲霉毒素B1(AFB1，純度≥98%，Sigma公司),使用前用甲醇配置成濃度為4.0 mmol/L, 4℃避光保存。酮洛芬(Ketoprofen，純度≥99%，上海化學(xué)技術(shù)上海有限公司)；布洛芬(Ibuprofen，純度≥98%，北京百靈威科技有限公司)。上述試劑使用前都用無(wú)水乙醇配制成4.0 mmol/L,其它試劑都為分析純。用0.1 mol/L Tris, 0.01 mol/L HCl和NaCl最終配制成含0.1 mol/L NaCl，pH為7.4的緩沖液。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 “內(nèi)濾光效應(yīng)”的校正 由于黃曲霉毒素在熒光激發(fā)波長(zhǎng)280 nm處有吸收，隨著樣品中毒素濃度增加，其淬滅行為存在內(nèi)濾光效應(yīng)，需要按下列操作對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行校正。在1 cm比色皿中加入2.0 mL緩沖液，用微量進(jìn)樣器加入適量4.0 mmol/L AFB1溶液，使AFB1濃度分別為2.0, 4.0, 6.0, 8.0, 10.0, 12.0, 14.0, 16.0, 18.0和20.0 μmol/L，混勻后，掃描紫外波段190～500 nm。按公式(1)對(duì)實(shí)驗(yàn)熒光數(shù)據(jù)進(jìn)行校正[5]：

(1)

式中，F(xiàn)obs和Fcor分別為測(cè)定得到的熒光值和校正后的熒光值； Aex和Aem分別為HSA激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)下相應(yīng)濃度的AFB1吸收值，實(shí)驗(yàn)結(jié)果的熒光數(shù)據(jù)均為校正后的熒光值。

2.2.2 熒光淬滅 和3D熒光的測(cè)定 在1 cm比色皿中加入1.0 mL 2.0 μmol/L HSA溶液，用微量進(jìn)樣器每次加入適量4.0 mmol/L AFB1溶液，使AFB1濃度分別為2.0, 4.0, 6.0, 8.0, 10.0, 12.0, 14.0, 16.0, 18.0和20.0 μmol/L，混勻后，在不同的溫度條件下，固定激發(fā)波長(zhǎng)λex=280 nm，狹縫寬度為5/5 nm，發(fā)射波長(zhǎng)在220～400 nm范圍內(nèi)掃描HSA的熒光光譜及AFB1-HSA作用的熒光光譜。將激發(fā)波長(zhǎng)掃描范圍設(shè)置為200～450 nm，發(fā)射波長(zhǎng)設(shè)置為220～600 nm，激發(fā)波長(zhǎng)每遞增5 nm掃描一次譜圖，可得HSA及作用后AFB1-HSA的三維熒光光譜。

2.2.3 競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn) Site I位點(diǎn)標(biāo)記藥物酮洛芬和AFB1與HSA的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)：在1 cm比色皿中加入1.0 mL 2.0 μmol/L HSA溶液，用微量進(jìn)樣器加入4.0 mmol/L AFB1溶液，使AFB1濃度為30 μmol/L，再分別加入微量4 mmol/L酮洛芬，最終酮洛芬的濃度分別為4.0, 8.0, 12.0, 16.0, 20.0, 24.0, 28.0和32.0 μmol/L，混合均勻，在熒光光譜相同的測(cè)定條件下測(cè)定熒光強(qiáng)度。用相同的方法測(cè)得AFB1和Site II位點(diǎn)標(biāo)記藥物-布洛芬的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合實(shí)驗(yàn)。

2.2.4 圓二色譜掃描 配制1.0 μmol/L HSA和復(fù)合物混合液(1.0 μmol/L HSA和10 μmol/L AFB1)，用光程為1 mm的比色皿，單位掃描間隔設(shè)置為1 nm, 單位掃描時(shí)間為2 s, 掃描波段為190～250 nm。

3 結(jié)果與討論

3.1 結(jié)合常數(shù)與結(jié)合位點(diǎn)數(shù)的研究分析

AFB1與HSA結(jié)合時(shí)，HSA熒光強(qiáng)度和毒素濃度與K和n的關(guān)系滿足方程式(2)[6]：

lg((F0-F)/F)=nlgK+nlg{[Q0]-n[P0](F0-F)/F0}

(2)

其中，F(xiàn)0和F分別是加入毒素前后的HSA熒光強(qiáng)度。[Q0]和[P0]分別是毒素和HSA的總濃度。通過(guò)lg[(F0-F)/F]對(duì)lg{[Q0]-[P0](F0-F)/F0}作圖，得到圖1。通過(guò)線性擬合得到直線的斜率和截距，可測(cè)得AFB1與HSA在不同溫度下的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n和結(jié)合常數(shù)K。從表1可見(jiàn)，AFB1-HSA在4個(gè)溫度下測(cè)定得到的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n值均約為1，表明HSA與AFB1的結(jié)合過(guò)程中只有一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，同時(shí)結(jié)合常數(shù)K值隨著溫度的升高而變小，說(shuō)明淬滅機(jī)制是靜態(tài)淬滅。因靜態(tài)淬滅時(shí)，溫度升高復(fù)合物穩(wěn)定性下降，會(huì)導(dǎo)致結(jié)合率降低，而動(dòng)態(tài)淬滅屬于分子擴(kuò)散過(guò)程，溫度升高，擴(kuò)散系數(shù)增大，K值相應(yīng)增大。另外，AFB1-HSA在4個(gè)溫度下K值的數(shù)量級(jí)均為104，比很多其它的血清蛋白-配體復(fù)合物結(jié)合常數(shù)高很多，表明AFB1與HSA存在較強(qiáng)的親和力，在血漿中有很長(zhǎng)的半衰期, 推測(cè)AFB1-HSA能夠在血液中存儲(chǔ)較長(zhǎng)時(shí)間，能遠(yuǎn)距離運(yùn)輸，持續(xù)發(fā)揮毒性。

3.2 結(jié)合距離的確定

能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象是一個(gè)分子發(fā)射光譜(供體)與另一個(gè)分子吸收光譜(受體)重疊，此時(shí)分子在偶極-偶極共振耦合作用下發(fā)生能量轉(zhuǎn)移，最終供體熒光降低，受體熒光升高。根據(jù)F?rster′s非輻射能量轉(zhuǎn)移，供體和受體之間的轉(zhuǎn)移效率E與臨界距離R0、距離r的關(guān)系式如下[10]：

圖1 不同溫度下的AFB1-HSA的雙對(duì)數(shù)曲線Fig.1 Double logarithmic equation of aflatoxin B-human serum albumin (AFB1-HSA) at different temperatures

表1 不同溫度下AFB1-HSA結(jié)合位點(diǎn)數(shù)(n)和結(jié)合常數(shù)(K)

Table 1 Binding sites (n) and binding constants (K) at different temperatures

T(K)nSD1K(×104L/mol)SD22980.99960.04383.600.03173031.00500.18233.230.07323081.01460.07982.670.03643131.04400.17082.370.0379SD1代表n值的標(biāo)準(zhǔn)偏差,SD2代表K的標(biāo)準(zhǔn)偏差。SD1:Standarddeviationofn;SD2:StandarddeviationofK.

(3)

(4)

(5)

式中，F(xiàn)0和F分別是加入供體前后的HSA熒光值；K2為偶極空間取向因子；Φ為供體的量子產(chǎn)率；N是介質(zhì)折射指數(shù)；J為毒素的吸收光譜與蛋白質(zhì)的熒光發(fā)射光譜之間的重疊積分；F(λ)是供體在波長(zhǎng)為λ時(shí)的熒光強(qiáng)度；ε(λ)是毒素在波長(zhǎng)λ處的摩爾吸光系數(shù)。AFB1紫外光譜與HSA的熒光重疊圖譜見(jiàn)圖2。

圖2 熒光發(fā)射光譜與AFB1紫外吸收光譜重疊圖，HSA和毒素濃度均為4.0 μmol/L。Fig.2 Overlap of fluorescence emission spectra of HSA and absorbance spectra of AFB1, CHSA=CAFB1=4.0 μmol/L

在此實(shí)驗(yàn)條件下，有報(bào)道K2=2/3、N=1.336，Φ=0.118[11]。通過(guò)上述公式得出，在AFB1-HSA體系中：J= 9.37161×10-15cm3L/mol,R0=2.43 nm,r=3.31 nm。結(jié)果表明AFB1與HSA反應(yīng)的結(jié)合距離r<7 nm, 且符合了0.5R0

3.3 作用力類(lèi)型的確定

通常，蛋白質(zhì)與配體形成超分子復(fù)合物主要通過(guò)疏水作用、靜電作用、范德華力及氫鍵等實(shí)現(xiàn)[12]。ΔH(焓變)、ΔS(熵變)、ΔG(自由能變化)可通過(guò)Van′t Hoff方程進(jìn)行計(jì)算，再根據(jù)熱力學(xué)參數(shù)判斷AFB1與HSA主要作用力類(lèi)型，方程如下：

(6)

(7)

式中，R為氣體常數(shù)；K為不同溫度下的結(jié)合常數(shù)。利用lnK對(duì)1/T擬合，關(guān)系如圖3。在298, 303, 308和313 K條件下，HSA的結(jié)構(gòu)并無(wú)很明顯變化或降解，可將焓變視為一個(gè)固定數(shù)值，計(jì)算得到ΔG。通過(guò)公式，得到AFB1-HSA反應(yīng)的ΔH=-22.47 kJ/mol； ΔS=11.94 J/(mol·K)，4個(gè)溫度下的ΔG分別為-26.02, -26.08, -26.14和-26.20 kJ/mol。

圖3 AFB1與HSA相互作用的Van′t Hoff曲線Fig.3 The Van′t Hoff plots for AFB1-HSA

AFB1與HSA反應(yīng)的ΔG<0，說(shuō)明AFB1與HSA反應(yīng)過(guò)程為自發(fā)過(guò)程。通過(guò)大量實(shí)驗(yàn)結(jié)果，Ross等得出了通過(guò)熱力學(xué)參數(shù)確定蛋白與配體作用力類(lèi)型的判斷依據(jù)[13]。結(jié)果表明，在4個(gè)溫度條件下ΔH<0,說(shuō)明反應(yīng)是放熱反應(yīng)；ΔS>0，說(shuō)明AFB1與HSA之間存在疏水作用力，推斷是因AFB1與HSA在體內(nèi)時(shí)，兩者的極性部分狀態(tài)屬于水分子包圍的水合狀態(tài)，當(dāng)兩者進(jìn)一步接近到一定范圍內(nèi)，會(huì)將本來(lái)存在于兩者非極性部分附近的水分子擠開(kāi)，最終使得被擠出來(lái)的水分子進(jìn)一步水合而其狀態(tài)由有序變?yōu)闊o(wú)序，這恰好符合熵增加而焓變減少，且最終使得自由能減小的過(guò)程，穩(wěn)定了非極性區(qū)的相互接觸[14]。由于HSA的復(fù)雜結(jié)構(gòu)，在實(shí)際與配體的反應(yīng)中，常同時(shí)存在幾種相互作用力[15]，而ΔH<0，說(shuō)明反應(yīng)中還存在氫鍵作用。通過(guò)ΔH和ΔS推斷出，AFB1與HSA結(jié)合作用力主要是疏水作用力和氫鍵。而疏水作用主要是由疏水性小分子進(jìn)入HSA的疏水腔引起的作用力，在研究AFB1的降毒過(guò)程中，增加AFB1的親水基團(tuán)，降低其進(jìn)入HSA疏水腔的概率，可以降低其與HSA的親和力，從而達(dá)到降低AFB1對(duì)人體毒性作用的效果。

3.4 AFB1與HSA結(jié)合位點(diǎn)的確定

HSA的高級(jí)結(jié)構(gòu)可分為3個(gè)結(jié)構(gòu)域，從N-端開(kāi)始依次為Domain Ⅰ, Domain Ⅱ和Domain Ⅲ, 這些結(jié)構(gòu)域主要由α-螺旋反向平行形成，每個(gè)域又由槽口相對(duì)的兩個(gè)疏水性亞域(Sub domain A和Sub domain B)空腔形成[3]，且HSA中主要有兩個(gè)疏水性口袋(Site Ⅰ)和(Site Ⅱ)是配體的主要結(jié)合部位，為了確定AFB1在HSA上的結(jié)合位置，使用酮洛芬(Site Ⅰ)和布洛芬(Site Ⅱ)作為位點(diǎn)探針，位點(diǎn)探針通常發(fā)生的反應(yīng)有競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)和非競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)兩種[16]。

競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)：

非競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)：

根據(jù)2.2.3節(jié)實(shí)驗(yàn)操作，依次向AFB1-HSA體系加入不同體積的酮洛芬和布洛芬溶液，根據(jù)體系中HSA和AFB1熒光變化情況(因AFB1與HSA之間存在能量共振，使得毒素?zé)晒鈴?qiáng)度增強(qiáng))，確定AFB1與HSA的結(jié)合位點(diǎn)。Sudlow等[17]提出了計(jì)算取代百分比的表達(dá)式：

(8)

式中，F(xiàn)2和F1分別為存在和不存在探針時(shí)的熒光強(qiáng)度。

在實(shí)驗(yàn)中，為了確保探針產(chǎn)生最小的非特異性結(jié)合，控制AFB1與HSA摩爾比為15∶1。測(cè)得體系的熒光光譜，根據(jù)公式(8)求得取代百分比，以取代百分比對(duì)探針與HSA的濃度之比作圖。從圖4可知，加入布洛芬對(duì)AFB1-HSA體系中HSA、AFB1的熒光強(qiáng)度影響較小，但隨著酮洛芬的加入量，AFB1與HSA的二元體系中HSA和毒素的熒光強(qiáng)度都發(fā)生較大降低，由此可推斷出，酮洛芬取代了AFB1，與HSA發(fā)生結(jié)合。以上結(jié)果表明，AFB1與HSA的結(jié)合反應(yīng)發(fā)生在Site I中，靠近Trp-214位色氨酸。OTA的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，將OTA毒素從血清蛋白中置換出來(lái)，可以加快消除OTA在靶器官中的積累[18], 因此研究在該結(jié)合位點(diǎn)低毒的與AFB1存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系的小分子，可以發(fā)展AFB1中毒的體內(nèi)預(yù)防措施。

3.5 AFB1誘導(dǎo)HSA構(gòu)象發(fā)生的變化

3.5.1 三維熒光掃描 三維熒光光譜表現(xiàn)的是熒光強(qiáng)度隨激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)同時(shí)變化的信息，擁有譜圖特征以及豐富的信息含量，為有機(jī)小分子作為介質(zhì)熒光探針的研究，以及它們與生物大分子血清白蛋白相互作用機(jī)理的研究提供了有力手段。圖5是測(cè)得加入AFB1前后HSA的3D熒光等高線圖，對(duì)應(yīng)的一些參考數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。

圖5 HSA(A)、AFB1-HSA(B)系統(tǒng)的3D熒光等高圖Fig.5 Three-dimensional contour diagrams of HSA(A) and AFB1-HSA (B)CHSA=2.0 μmol/L; CAFB1=10 μmol/L.

表2 HSA與AFB1-HSA系統(tǒng)的三維熒光光譜特征參數(shù)

Table 2 Three-dimensional fluorescence spectral characteristic parameters of HSA and AFB1-HSA system

HSA峰1Peak1峰2Peak2HSA-AFB1峰1Peak1峰2Peak2Peakposotionλex/λem(nm/nm)280/345235/345280/330235/340StokesshiftΔλ(nm)6511050105IntensityF853.8467.2629.1311.9

3.5.2 AFB1與HSA的圓二色譜分析 在蛋白質(zhì)或多肽的規(guī)則的二級(jí)結(jié)構(gòu)中，肽鍵是高度有規(guī)律排列的，排列的方向性決定了肽鍵能級(jí)躍遷的分裂情況。因此，不同二級(jí)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)或多肽所產(chǎn)生的CD譜帶的位置、吸收的強(qiáng)弱都不相同。因此CD譜帶的位置、吸收相關(guān)的變化反映蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)變化。蛋白質(zhì)的典型的α-螺旋結(jié)構(gòu)式在208 nm(肽鍵的π-π*躍遷)和222 nm(肽鍵的n-π*躍遷)處出現(xiàn)負(fù)的吸收峰，α-螺旋結(jié)構(gòu)的含量可用下列公式求得[20]：

(9)

(10)

圖6 AFB1與HSA的圓二色譜圖Fig.6 Circular dichroism spectra of AFB1 and HSA CHSA=1.0 μmol/L; CAFB1=10 μmol/L.

式中，θobs為橢圓度(208 nm)處的橢圓度；MRE為平均殘基的橢圓度；Cp為HSA的摩爾濃度，n為氨基酸殘基數(shù)目(HSA中氨基酸殘基數(shù)目為585)；l為樣品池的光徑(0.1 cm)。實(shí)驗(yàn)中測(cè)得nHSA∶nAFB1=0∶0和1∶10時(shí)體系的CD光譜，結(jié)果見(jiàn)圖6。

4 結(jié) 論

本研究采用了熒光淬滅法、同步、三維熒光光譜3種熒光光譜技術(shù)在模擬人體血液pH值條件下研究AFB1和HSA的相互作用，獲得了AFB1-HSA系統(tǒng)的淬滅機(jī)制、結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)、結(jié)合距離、結(jié)合位置、作用力類(lèi)型、構(gòu)象變化等相關(guān)信息。結(jié)果表明，AFB1對(duì)HSA的主要淬滅機(jī)制為形成靜態(tài)復(fù)合物的靜態(tài)淬滅，且結(jié)合時(shí)只有一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，二者相互作用力主要為疏水作用和氫鍵，結(jié)合位置為靠近Trp-214的疏水腔中，二者的結(jié)合引起了HSA的氨基酸殘基微環(huán)境及其α-螺旋含量的增加。AFB1與HSA較強(qiáng)的結(jié)合常數(shù)說(shuō)明，AFB1能夠通過(guò)HSA被運(yùn)輸?shù)礁鱾€(gè)靶器官中，可在血液中貯存較長(zhǎng)的時(shí)間，存在潛在的毒性。本研究為評(píng)價(jià)黃曲霉毒素的毒性提供了有用信息，且從分子水平上研究了血液運(yùn)輸過(guò)程中黃曲霉毒素的毒理學(xué)效應(yīng)及其對(duì)血清蛋白構(gòu)效影響等。

1 Zhang D H, Li P W, Yang Y.Talanta, 2011, 85(1): 736-742

2 Vineis P, Xun W.Ann.Oncol., 2009, 20:205-212

3 He X M, Carter D C.Nature, 1993, 364: 362

4 Il′Ichev Y V, Perry J L, Rüker F.Chemico-biologicalInteractions, 2002, 141(3): 275-293

5 GONG Xia, SHI Yong-Hui, YUE Guo-Wei.SpectroscopyandSpectralAnalysis, 2005, 25(3): 420-423

宮 霞, 施用暉, 樂(lè)國(guó)偉. 光譜學(xué)與光譜分析, 2005, 25(3): 420-423

6 ZHANG Ai-Mei, SUN Kun, WANG Rong, XIE Hua, XIE Xi-Hui, SHI You-Qin.ChineseJ.Anal.Chem., 2011, 39(12): 1817-1822

張愛(ài)梅, 孫 坤,王 榮, 謝 華, 謝希暉, 施有琴. 分析化學(xué), 2011, 39(12): 1817-1822

7 HUANG Rui, XIA Zhi-Ning, GONG Ping.SpectroscopyandSpectralAnalysis, 2008, 28(1): 161-164

黃 銳, 夏之寧, 龔 萍. 光譜學(xué)與光譜分析, 2008, 28(1): 161-164

8 Cao S N, Liu B S, Li Z Y, Chong B H.J.Lumin., 2014, 145: 94-99

9 van de Weert M.J.Fluoresc., 2010, 20(2): 625-629

10 Ge F, Jiang L X, Liu D Q, Chen C Y.Anal.Sci., 2011, 27(1): 79-84

11 Bertucci C, Domenici E.Curr.Med.Chem., 2002, 9(15): 1463-1481

12 Klotz I M. Ann N Y.Acad.Sci., 1973, 226(1): 18-35

13 Ross P D, Subramanian S.Biochem., 1981, 20(11): 3096-3102

14 Ding F, Liu W, Liu F, Li Z Y.J.Fluoresc., 2009, 19(5): 783-791

15 Lakowicz J R.InstrumentationforFluorescenceSpectroscopy.PrinciplesofFluorescenceSpectroscopy. Springer US, 1999: 25-61

16 Dufour C, Dangles O.Biochim.Biophys.Acta, 2005, 1721:164-173

17 Sudlow G, Birkett D J, Wade D N.Mol.Pharmacol., 1976, 12: 1052-1061

19 Kandagal P B, Ashoka S, Seetharamappa J.J.Pharm.Biomed.Anal., 2006, 41(2):393-399

20 Sano T, Ohno T, Otsuka-Fuchino H, Tsuchiya T.J.FoodSci., 1994, 59(5): 1002-1008

21 ZHOU Juan, JIN Gui-Yun, SUN Ting-Quan, ZHU Li, ZHONG Li-Qin.Chin.J.Anal.Lab, 2014, 33(1): 8

周 娟, 金桂云, 孫婷荃, 朱 麗, 鐘立群. 分析試驗(yàn)室, 2014, 33(1): 8

(Received 19 August 2015; accepted 22 October 2015)

This work was supported by the National Basic Research Program of China(No. 2013CB127803); the National Natural Science Foundation of China (No.31301476) and the Fundamental Research Fund for the Central Universities (No.2362014xk11)

Fluorescence Spectroscopic Study of Interaction between Aflatoxin B1 and Human Serum Albumin

JIANG Tao, MA Liang*, ZHANG Yu-Hao, WANG Jia-Man

(CollegeofFoodScience,SouthwestUniversity,Chongqing400715,China)

Aflatoxin B1 (AFB1) is the most powerful cancer-causing mycotoxins, which is serious harmful to human and animal health. Human serum albumin has important physiological functions in the binding or transporting endogenous and exogenous ligands aspects. It′s great significance in molecular toxicology of researching AFB1and human serum albumin interaction mechanism. The interaction between AFB1and human serum albumin (HSA) was investigated by fluorescence spectroscopy, circular dichroism and 3D fluorescence spectroscopy under the simulative physiological conditions (pH=7.4, Ionic strength 0.1 mol/L). Results showed that the main quenching mechanism between AFB1and HSA was a static quenching process. At four different temperatures (298, 303, 308 and 313 K), all the magnitude binding constants (K) were 104 and the number of binding sites (n) in the binary system was approximate to 1. According to Van′t Hoff equation, the negative enthalpy change (ΔHθ) and postive entropy change (ΔSθ) values indicated that hydrophobic interaction and hydrogen bonding were the mainly interaction and force in the binding process. The binding distance (r) between the AFB1and HSA was calculated to be 3.31 nm based on the theory of F?rster′s non-radiation energy transfer. The site marker displacement experiments suggested the location of AFB1binding to HSA was site I, closely Trp-214. The 3D florescence revealed that the microenvironment of amino acid residues and the conformation of HSA were changed during the binding reaction. CD spectra revealed that the conformations of HSA were changed during the binding reaction with increasing inα-helix.

Aflatoxin B1; Human serum albumin;Binding interaction; Spectroscopy

10.11895/j.issn.0253-3820.150657

本文系國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(973計(jì)劃)項(xiàng)目(No.2013CB127803)；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No.31301476)；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目(No.2362014xk11)

2015-08-19收稿;2015-10-22接受

*E -mail: zhyhml@163.com