烏日根達(dá)來，程延彬*，李 偉，張寶輝

(1.海拉爾農(nóng)牧場(chǎng)管理局，內(nèi)蒙古 海拉爾區(qū) 021008；2.特泥河農(nóng)牧場(chǎng)，內(nèi)蒙古 陳巴爾虎旗 021024；3.哈達(dá)圖農(nóng)牧場(chǎng)，內(nèi)蒙古 陳巴爾虎旗 021511)

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牛病防治

內(nèi)蒙古呼倫貝爾高寒地區(qū)奶?？谔阋呙庖呖贵w跟蹤檢測(cè)及防控對(duì)策

烏日根達(dá)來1，程延彬1*，李 偉2，張寶輝3

(1.海拉爾農(nóng)牧場(chǎng)管理局，內(nèi)蒙古 海拉爾區(qū) 021008；2.特泥河農(nóng)牧場(chǎng)，內(nèi)蒙古 陳巴爾虎旗 021024；3.哈達(dá)圖農(nóng)牧場(chǎng)，內(nèi)蒙古 陳巴爾虎旗 021511)

呼倫貝爾地區(qū)奶?？谔阋呙庖甙醋灾螀^(qū)的要求，一年進(jìn)行三次免疫，即每四個(gè)月免疫一次。主要對(duì)口蹄疫亞洲I型、A型和O型的免疫?？谔阋叩囊粋€(gè)重要特性是耐寒不耐熱。呼倫貝爾市地處東經(jīng)115°31′～126°04′、北緯47°05′～53°20′。溫帶北部，其氣候特點(diǎn)為大陸性氣候顯著，冬季寒冷漫長(zhǎng)，最冷月(1月)平均氣溫在-18℃～-35℃之間，全市大部分地區(qū)年平均氣溫在0℃以下。1、2月是口蹄疫高發(fā)期，如果免疫密度不夠，抗體水平低下，很可能發(fā)生疫情。通過進(jìn)行抗體檢測(cè)，掌握群體免疫抗體水平，對(duì)補(bǔ)針和下一步進(jìn)行免疫起到關(guān)鍵作用。2015年10、11月和2016年1月，分三期對(duì)兩組180頭牛進(jìn)行了口蹄疫免疫抗體檢測(cè)，對(duì)犢牛第一次免疫應(yīng)答抗體水平的低高時(shí)期及奶牛抗體水平的跟蹤檢測(cè)，分析寒冷時(shí)期牛產(chǎn)生抗體時(shí)間、從低峰到高峰時(shí)間段及衰退時(shí)間的抗體效價(jià)，對(duì)海拉爾墾區(qū)奶牛整體防控提供了寶貴的資料。

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與檢測(cè)方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

從內(nèi)蒙古呼倫貝爾市海拉爾農(nóng)牧場(chǎng)管理局下屬哈達(dá)圖農(nóng)牧場(chǎng)、特泥河農(nóng)牧場(chǎng)兩個(gè)牧場(chǎng)挑選60～80日齡犢牛各45頭；育成奶牛各45頭，共計(jì)180頭牛，分犢牛組和奶牛組，每組90頭牛。

口蹄疫亞洲I型、O型、A型三價(jià)滅活疫苗，內(nèi)蒙古金宇生物制藥廠生產(chǎn)。于2015年9月25日，對(duì)兩組牛注射口蹄疫三價(jià)疫苗，每頭牛1 ml。于2015年10月25日,11月25日，2016年1月10日分別三次采血進(jìn)行抗體檢測(cè)。

1.2 檢測(cè)方法

1)檢測(cè)材料：①亞洲I型口蹄疫抗體液相阻斷ELISA檢測(cè)試劑盒、A型口蹄疫抗體液相阻斷ELISA檢測(cè)試劑盒、O型口蹄疫抗體液相阻斷ELISA檢測(cè)試劑盒(中牧實(shí)業(yè)股份有限公司蘭州生藥廠生產(chǎn))。②移液器:5～50 μL移液器、0.2～10 μL移液器、50～200 μL移液器、50～300 μL 12道移液器各3把；移液槍尖 (若干)；③抗原抗體反應(yīng)板:微量血凝板(U型、V型均可)15塊,本試劑盒配備兩塊,用于被檢血清的稀釋和抗原抗體反應(yīng)。注:抗原抗體反應(yīng)板可重復(fù)使用,實(shí)驗(yàn)后,用水沖洗干凈,然后用無離子水沸水浴30 s,晾干,待用；d、超純水 ,無離子水或蒸餾水；e、被檢血清。

2)試劑準(zhǔn)備

①包被緩沖液的配置

從試劑盒中取出碳酸鹽緩沖液膠囊，并小心打開，將膠囊內(nèi)粉末全部倒入燒杯中，并加入無離子水100 mL，攪拌均勻，使之充分溶解；然后4℃存放，備用。

②洗滌液的配置

從試劑盒取出標(biāo)有25xPBST的濃縮洗液，如有結(jié)晶形成，可微熱溶化，若洗液瓶為2 L容積，可量取濃縮洗液80 mL加入1 920 mL無離子水中(1∶25稀釋)，充分混勻，并用NaOH將pH值調(diào)至7.4。

③底物溶液的配置

用100 mL無離子水將試劑盒中的檸檬酸-磷酸鹽片劑充分溶解，量取溶解后的溶液50 mL，加入鄰苯二胺(OPD)片劑，充分溶解，10 mL每瓶分裝，避光-20℃保存。使用前需避光溶化，在臨用前每10 mL底物溶液加入100 μL的 3%的雙氧水(H2O2)。

3)操作步驟

①包被ELISA板：

將口蹄疫病毒兔抗血清按照1∶1 000的比例加入之前配置的包被緩沖液當(dāng)中進(jìn)行稀釋，制成包被液，充分混勻后，在ELISA板上的每孔內(nèi)加入包被液50 μL，振蕩1分鐘后封板，室溫過夜。

②抗原抗體反應(yīng)：

在U型反應(yīng)板上以每孔50 μL量用1倍的PBST將待檢血清從1:4開始做2倍的連續(xù)稀釋至1∶512。同時(shí)，按圖示A11-H11孔中稀釋陽性對(duì)照血清，于A12、B12孔中稀釋陰性對(duì)照血清，然后將用1倍PBST稀釋至使用濃度的口蹄疫病毒抗原加入到各孔中，被檢血清孔及陰陽性對(duì)照孔每孔50 μL，病毒抗原對(duì)照孔加100μL。振蕩1分鐘，充分混勻后，封板，4℃過夜。加入病毒抗原后，被檢血清的稀釋度變?yōu)閺?:8開始的2倍稀釋(O型口蹄疫抗體檢測(cè)時(shí)，稀釋度比亞洲I型低一個(gè)滴度)。

③第二日，將ELISA板中的液體棄去，并用1倍的PBST對(duì)ELISA反應(yīng)板進(jìn)行5次洗板，在吸水紙上拍干，然后，將U型板(抗原抗體反應(yīng)板)從4℃取出室溫放置5分鐘后，將每孔血清病毒混合物依次轉(zhuǎn)移至拍干的ELISA板上的相對(duì)應(yīng)孔，每孔50 μL，封板，置入37℃恒溫培養(yǎng)箱中溫育1 h。

④1 h后，再將ELISA板中的液體棄去，并用1倍的PBST對(duì)ELISA反應(yīng)板進(jìn)行5次洗板，在吸水紙上拍干。用豚鼠抗血清稀釋液將口蹄疫病毒豚鼠抗血清稀釋至1∶1 000濃度，并在ELISA反應(yīng)板中每孔加入50 μL，封板，置入37℃恒溫培養(yǎng)箱中溫育1小時(shí)。

⑤1 h后，再將ELISA板中的液體棄去，并用1倍的PBST對(duì)ELISA反應(yīng)板進(jìn)行5次洗板，在吸水紙上拍干。用1倍的PBST稀釋兔抗豚鼠酶結(jié)合物至1∶1 000濃度(O型為1∶500)，并在ELISA反應(yīng)板中每孔加入50μL，封板，置入37℃中溫育1小時(shí)。

⑥1h后，再將ELISA板中的液體棄去，并用1倍的PBST對(duì)ELISA反應(yīng)板進(jìn)行5次洗板，拍干后，在ELISA反應(yīng)板中每孔加50μL底物溶液(加雙氧水)，置入37℃恒溫培養(yǎng)箱中避光溫育15分鐘。到時(shí)間后，每孔直接再加入50μL終止液，終止反應(yīng)，并立即在492 nm波長(zhǎng)下讀取光吸收值(OD492 nm值)。

2 檢測(cè)結(jié)果

2.1 犢牛組檢測(cè)結(jié)果

1)第一次檢測(cè)結(jié)果(30 d)

亞洲I型：效價(jià)(抗體滴度)1∶32～1：64為42份，1∶64～1∶90為48份，平均效價(jià)為(保護(hù))43%。

O型：效價(jià)(抗體滴度)1∶32～1∶64為36份，1∶64～1∶90為54份，平均效價(jià)為(保護(hù))51%。

A型：效價(jià)(抗體滴度)1∶32～1∶46為27份，1∶46:～1∶64為53份，平均效價(jià)為(保護(hù))40%。

2)第二次檢測(cè)結(jié)果(60 d)

亞洲I型：效價(jià)(抗體滴度)1∶32為6份，1∶64為23份，1∶90為25份，1∶108為36份，平均效價(jià)為(保護(hù))63%。

O型：效價(jià)(抗體滴度)1∶32～1∶64為17份，1∶64～1∶90為46份，1∶90～1∶108為27份，平均效價(jià)為(保護(hù))60%。

圖1 犢牛組抗體接觸結(jié)果

A型：效價(jià)(抗體滴度)1∶32～1∶64為15份，1∶64～1∶90為45份，1∶90～1∶108為30份，平均效價(jià)為(保護(hù))65%。

3)第三次檢測(cè)結(jié)果(100 d)

亞洲I型：效價(jià)(抗體滴度)1∶32～1∶64為41份，1∶64～1∶90為32份，1∶90～1∶108為17份，平均效價(jià)為(保護(hù))53%。

O型：效價(jià)(抗體滴度)1∶32～1∶64為24份，1∶64～1∶90為32份，1∶90～1∶108為34份，平均效價(jià)為(保護(hù))51%。

A型：效價(jià)(抗體滴度)1∶32～1∶64為19份，1∶64～1∶90為51份，1∶90～1∶08為20份，平均效價(jià)為(保護(hù))52%。

2.2 奶牛組檢測(cè)結(jié)果

1)第一次檢測(cè)結(jié)果(30 d)

亞洲I型：效價(jià)(抗體滴度)1∶32～1∶64為4份，1∶64～1∶90為23份，1∶90～1∶128為63份，平均效價(jià)為(保護(hù))73%。

O型：效價(jià)(抗體滴度)1∶32～1∶64為10份，1∶64～1∶90為18份，1∶90～1∶128為62份，平均效價(jià)為(保護(hù))71%。

A型：效價(jià)(抗體滴度)1∶32～1∶64為7份，1∶64～1∶90為26份，1∶90～1∶128為57份，平均效價(jià)為(保護(hù))69%。

圖2 奶牛組抗體檢測(cè)結(jié)果

2)第二次檢測(cè)結(jié)果(60 d)

亞洲I型：效價(jià)(抗體滴度)1∶90～1∶128為8份，1∶128以上為82份，平均效價(jià)為(保護(hù))95%。

O型：效價(jià)(抗體滴度)1∶90～1∶128為3份，1∶128以上為87份，平均效價(jià)為(保護(hù))97%。

A型：效價(jià)(抗體滴度)1∶90～1∶128為11份，1∶128以上為79份，平均效價(jià)為(保護(hù))93%。

3)第三次檢測(cè)結(jié)果(100 d)

亞洲I型：效價(jià)(抗體滴度)1∶64～1∶90為22份，1∶90～1∶128為58份，1∶128以上10份，平均效價(jià)為(保護(hù))75%。

O型：效價(jià)(抗體滴度)1∶32～1∶64為17份，1∶64～1∶90為49份，1∶90～1∶128為21份，1∶128以上為3份，平均效價(jià)為(保護(hù))63%。

A型：效價(jià)(抗體滴度)1∶32～1∶64為19份，1∶64～1∶90為51份，1∶90～1∶128為19份，1∶128以上為1份，平均效價(jià)為(保護(hù))60%

3 討論

1)對(duì)犢牛初次注射疫苗，產(chǎn)生初次應(yīng)答反應(yīng)，所產(chǎn)生的抗體量不多。犢牛組30、60、100天三種疫苗平均抗體效價(jià)為45%、62%、52%。最高峰60天時(shí)的效價(jià)才為62%，然后逐漸下降。100天之內(nèi)的平均保護(hù)率為50%左右，遠(yuǎn)低于疫病抗感染抗體效價(jià)的70%以上水平。如果一旦遭遇口蹄疫流行，很難保證不發(fā)生疫情。因此，應(yīng)該于第一次免疫注射30天時(shí)再進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫，刺激原有的體內(nèi)留下的免疫記憶細(xì)胞，使機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)抗體。

2)奶牛組的90頭牛是在1月、5月份注射過疫苗，實(shí)驗(yàn)注射疫苗后，機(jī)體產(chǎn)生抗原的再次應(yīng)答反應(yīng)。機(jī)體在特異性回憶反應(yīng)下迅速產(chǎn)生強(qiáng)抗體，并使抗體持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)。在本次實(shí)驗(yàn)中30、60、100天三種疫苗平均抗體效價(jià)為71%、95%、66%。強(qiáng)抗體持續(xù)時(shí)間為90天左右，到100天后開始逐漸衰退。這時(shí)候應(yīng)該考慮進(jìn)行加強(qiáng)免疫。

3)口蹄疫病毒的一個(gè)特性是耐寒不耐熱，在夏季很少流行，在冬季氣候寒冷時(shí)候流行比較多見。呼倫貝爾地區(qū)的1、2月是最寒冷的時(shí)候，平均溫度達(dá)零下30～40℃左右，是口蹄疫病毒活躍期和疫病流行的危險(xiǎn)時(shí)期。對(duì)奶牛進(jìn)行計(jì)劃免疫時(shí)，一年的第三次免疫應(yīng)該安排在11月末進(jìn)行，從12月末開始產(chǎn)生強(qiáng)抗體，到第二年1月中旬抗體水平達(dá)到高峰，能有效抵抗疫病的侵害，能安全渡過1、2月份危險(xiǎn)期。疫苗注射1個(gè)月時(shí)，進(jìn)行采血抗體檢測(cè)，監(jiān)測(cè)產(chǎn)生抗體情況，評(píng)估整群牛的抗體水平，如抗體水平達(dá)不到立即進(jìn)行加強(qiáng)免疫。

2016-06-10

2016-06-15

烏日根達(dá)來(1966-)，男，高級(jí)獸醫(yī)師，本科，主要從事動(dòng)物疫病防控及診治。

*通訊作者：程延彬(1976-)，男，內(nèi)蒙古呼倫貝爾市人，畜牧師，碩士研究生，主要從事反芻動(dòng)物營養(yǎng)研究及畜牧業(yè)規(guī)劃管理等工作。

S823

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1001-9111(2016)05-0086-03