馬俊，魯建軍，繆蓉，巫國(guó)勇，羅紅鶴

(中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院，廣州510080)

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食管鱗狀細(xì)胞癌組織中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子C、D的表達(dá)變化及意義

馬俊，魯建軍，繆蓉，巫國(guó)勇，羅紅鶴

(中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院，廣州510080)

目的 觀察食管鱗狀細(xì)胞癌(ESCC)組織中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子C(VEGF-C)、VEGF-D的表達(dá)變化，并探討二者與ESCC轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)的關(guān)系。方法 收集60例ESCC患者的腫瘤組織及癌旁正常組織標(biāo)本。用免疫組化法檢測(cè)組織中VEGF-C、VEGF-D陽(yáng)性表達(dá)率及表達(dá)水平，計(jì)算ESCC組織微血管密度(MVD)、微淋巴管密度(MLVD)；分析VEGF-C、VEGF-D表達(dá)水平與ESCC患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系；采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析VEGF-C、VEGF-D表達(dá)水平與MVD、MLVD的關(guān)系；患者均行CE根治術(shù)，術(shù)后隨訪1年，觀察復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移患者腫瘤組織中VEGF-C、VEGF-D表達(dá)水平；采用Logistic回歸對(duì)ESCC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的影響因素進(jìn)行分析。結(jié)果 ESCC組織與癌旁正常組織中VEGF-C、VEGF-D的陽(yáng)性表達(dá)率、相對(duì)表達(dá)量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。VEGF-C、VEGF-D表達(dá)水平與ESCC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期有關(guān)(P均<0.05)，VEGF-C表達(dá)水平還與腫瘤浸潤(rùn)深度有關(guān)(P均<0.05)。經(jīng)Spearman等級(jí)相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，ESCC組織中VEGF-C表達(dá)水平與MLVD、MVD呈正相關(guān)(r分別為0.521、0.561，P均<0.05)；VEGF-D表達(dá)水平與MLVD呈正相關(guān)(r=0.660，P<0.05)。術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移患者ESCC組織VEGF-C、VEGF-D相對(duì)表達(dá)量高于術(shù)后無(wú)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移患者(P均<0.05)。經(jīng)Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，VEGF-C、VEGF-D及腫瘤浸潤(rùn)程度是ESCC患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(OR分別為8.321、7.683、0.104，P<0.05)。結(jié)論 ESCC組織中VEGF-C和VEGF-D呈高表達(dá)，二者與ESCC轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)有關(guān)。

食管鱗狀細(xì)胞癌；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子C；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子D；微血管密度；微淋巴管密度

食管癌是常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤之一，男性發(fā)病率和病死率為女性的2～4倍[1]。我國(guó)是食管癌高發(fā)國(guó)家之一，以食管鱗狀細(xì)胞癌(ESCC)為主，約占食管癌總數(shù)的90%[2]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)是具有促血管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂活性的一種糖基化堿性蛋白。VEGF家族共有7個(gè)成員：VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、VEGF-F和胎盤生長(zhǎng)因子，均為同源二聚體糖蛋白，具有相似的空間結(jié)構(gòu)，在新生血管生成和淋巴管生成等方面有重要的調(diào)節(jié)作用[3]。目前研究認(rèn)為，VEGF-C、VEGF-D對(duì)促進(jìn)腫瘤組織中新生血管形成及淋巴管生成起重要作用[4，5]，然而其具體作用機(jī)制尚未完全清楚。本研究觀察ESCC組織VEGF-C、VEGF-D的表達(dá)變化，并探討二者與ESCC轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2012年6月～2013年9月本院收治的ESCC患者60例，均經(jīng)病理檢查確診，均行CE根治術(shù)治療，術(shù)前均未接受放療、化療及其他抗腫瘤治療。其中男42例、女18例，年齡(59.37±9.13)歲，通過(guò)手術(shù)切除腫瘤組織及距腫瘤組織4 cm的正常組織制作石蠟標(biāo)本。

1.2 ESCC組織及癌旁正常組織VEGF-C、VEGF-D表達(dá)檢測(cè) 采用免疫組化法。取ESCC組織及癌旁正常組織標(biāo)本，包埋、切片脫蠟至水、抗原修復(fù)、3%過(guò)氧化氫孵育、山羊血清封閉、一抗孵育、二抗孵育、辣根酶標(biāo)記、DAB顯色、蘇木素復(fù)染及脫水、透明、封片、鏡檢。VEGF-C和VEGF-D陽(yáng)性細(xì)胞染色呈淺黃色至棕黃色，定位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，以陽(yáng)性細(xì)胞百分比≥30%為陽(yáng)性表達(dá)。采用Image-proplus 6.0軟件分析5個(gè)視野的光密度值，以平均光密度值作為VEGF-C、VEGF-D的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 ESCC組織微血管密度(MVD)、微淋巴管密度(MLVD)測(cè)算 采用免疫組化法。CD31蛋白染色陽(yáng)性定位于血管內(nèi)膜，呈現(xiàn)黃色至棕黃色顆粒。以CD31染色陽(yáng)性的單個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞簇作為一個(gè)單獨(dú)的可數(shù)微血管。低倍鏡下定位血管高密度區(qū)域，高倍鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)視野微血管數(shù)量，計(jì)算平均值即為MVD[6]。D2-40染色陽(yáng)性定位于腫瘤內(nèi)淋巴管中，呈棕黃色，D2-40染色陽(yáng)性的單個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞簇為一個(gè)陽(yáng)性微淋巴管，低倍鏡下尋找D2-40染色陽(yáng)性密集區(qū)域，高背景下隨機(jī)選擇5個(gè)視野計(jì)數(shù)微淋巴管數(shù)量，以其平均值作為MLVD[7]。

2 結(jié)果

2.1 ESCC組織及癌旁正常組織中VEGF-C、VEGF-D表達(dá)比較 ESCC組織及癌旁正常組織VEGF-C陽(yáng)性表達(dá)率分別為68.33%(41/60)、7.14%(4/60)，VEGF-D陽(yáng)性表達(dá)率分別為56.67%(34/60)、3.45%(2/60)，ESCC組織與癌旁正常組織中VEGF-C、VEGF-D的陽(yáng)性表達(dá)率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。ESCC組織及癌旁正常組織中VEGF-C相對(duì)表達(dá)量分別為0.250±0.043、0.074±0.046，VEGF-D相對(duì)表達(dá)量分別為0.241±0.028、0.075±0.045，ESCC組織與癌旁正常組織VEGF-C、VEGF-D相對(duì)表達(dá)量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。

2.2 VEGF-C、VEGF-D表達(dá)水平與ESCC患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 VEGF-C、VEGF-D表達(dá)水平與ESCC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期有關(guān)(P均<0.05)，VEGF-C表達(dá)水平還與腫瘤浸潤(rùn)深度有關(guān)(P<0.05);二者與性別、年齡、腫瘤分化程度和浸潤(rùn)深度無(wú)關(guān)(P均>0.05)。見(jiàn)表1。

2.3 ESCC組織中VEGF-C、VEGF-D表達(dá)與MLVD、MVD的關(guān)系 ESCC組織中VEGF-C、VEGF-D表達(dá)與MLVD、MVD的關(guān)系見(jiàn)表2。經(jīng)Spearman等級(jí)相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，ESCC組織中VEGF-C表達(dá)水平與MLVD、MVD呈正相關(guān)(r分別為0.521、0.561，P均<0.05)；VEGF-D表達(dá)水平與MLVD呈正相關(guān)(r=0.660，P<0.05)，與MVD無(wú)相關(guān)性(r=0.212，P>0.05)。

2.4 VEGF-C、VEGF-D表達(dá)水平與ESCC患者預(yù)后的關(guān)系 60例患者術(shù)后1年出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移24例。術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移患者ESCC組織中VEGF-C、VEGF-D相對(duì)表達(dá)量(0.274±0.049、0.252±0.032)高于術(shù)后無(wú)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移患者(0.183±0.034、0.189±0.011)，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。

表1 VEGF-C、VEGF-D表達(dá)水平與ESCC患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系±s)

表2 ESCC組織中VEGF-C、VEGF-D表達(dá)與MLVD、MVD的關(guān)系

2.5 ESCC淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的影響因素 經(jīng)Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)，VEGF-C、VEGF-D陽(yáng)性表達(dá)及腫瘤浸潤(rùn)程度(OR分別為8.321、7.683、0.104，P均<0.05)是ESCC患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的影響因素。

3 討論

ESCC早期可通過(guò)淋巴管擴(kuò)散到局部淋巴結(jié)。VEGF家族中的VEGF-C被認(rèn)為能夠促進(jìn)腫瘤新生血管生成。VEGF-C和VEGF-D是主要的淋巴管生成因子，在腫瘤淋巴管生成中起重要作用[8]。VEGF-C在結(jié)直腸癌、胃癌等多種消化道腫瘤組織中高表達(dá)，并被認(rèn)為與腫瘤的浸潤(rùn)程度、淋巴管侵犯及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。VEGF-C在頭頸部鱗癌組織中高表達(dá)，被認(rèn)為可促進(jìn)新生血管生成及淋巴管增生[9]。在非小細(xì)胞肺癌[10]、乳腺癌[11]、黑色素瘤[12]等實(shí)體腫瘤組織中均發(fā)現(xiàn)VEGF-C蛋白表達(dá)明顯高于相應(yīng)部位的正常組織或癌旁正常組織，且其表達(dá)水平與淋巴管形成、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)。在現(xiàn)有的研究中，多數(shù)支持VEGF-D與多種惡性腫瘤淋巴管生成和淋巴道轉(zhuǎn)移相關(guān)。VEGF-D不但可促進(jìn)腫瘤內(nèi)部的淋巴管生成，而且可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞向淋巴結(jié)擴(kuò)散，VEGF-D的特異性抗體可阻斷這種淋巴道播散。VEGF-D在口腔鱗癌中的表達(dá)高提示腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率較高[13]。對(duì)胃癌的研究表明，VEGF-D的陽(yáng)性表達(dá)與胃癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)[14]，這種相關(guān)性甚至出現(xiàn)在早期的淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移中。本研究不僅用了傳統(tǒng)的陽(yáng)性表達(dá)率來(lái)定性表述VEGF的表達(dá)情況，還聯(lián)合應(yīng)用光密度值來(lái)定量描述其表達(dá)情況，使結(jié)果更加具有說(shuō)服力。本研究發(fā)現(xiàn)，ESCC腫瘤組織中VEGF-C、VEGF-D的陽(yáng)性表達(dá)率和相對(duì)表達(dá)量均高于癌旁正常組織，該結(jié)果說(shuō)明VEGF-C、VEGF-D促進(jìn)了ESCC的發(fā)生發(fā)展。

腫瘤組織的淋巴管形成是一個(gè)涉及淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)及包括腫瘤細(xì)胞在內(nèi)的多因素、多步驟的復(fù)雜過(guò)程。本研究發(fā)現(xiàn)，在ESCC組織中，VEGF-C、VEGF-D的表達(dá)水平與有無(wú)淋巴轉(zhuǎn)移、臨床分期以及有無(wú)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期較晚及術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的ESCC組織中，VEGF-C、VEGF-D具有較高的表達(dá)水平；同時(shí)，本研究選用D2-40單克隆抗體對(duì)ESCC組織的MLVD進(jìn)行定量檢測(cè)，在ESCC組織中，VEGF-C、VEGF-D表達(dá)水平與MLVD均呈正相關(guān)。以上結(jié)果證實(shí)VEGF-C、VEGF-D是腫瘤淋巴管生成的誘導(dǎo)劑，促進(jìn)了淋巴管的生成。且VEGF-C表達(dá)水平還與MVD呈正相關(guān)，說(shuō)明VEGF-C還與腫瘤浸潤(rùn)程度有關(guān)。復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移是癌癥的主要特征。也是腫瘤患者預(yù)后的重要不利因素，在Logistic回歸分析中發(fā)現(xiàn)，VEGF-C、VEGF-D陽(yáng)性表達(dá)以及腫瘤浸潤(rùn)程度是ESCC術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的獨(dú)立影響因素，能夠預(yù)測(cè)患者的術(shù)后預(yù)后狀態(tài)。

綜上所述，VEGF-C、VEGF-D在ESCC組織中的表達(dá)水平升高，促進(jìn)了ESCC的腫瘤發(fā)生發(fā)展，并且參與了腫瘤組織中的淋巴管生成，與ESCC的淋巴轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，可以作為患者預(yù)后的重要依據(jù)。

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2016-03-17)