郭明日，張麗霞，周洪經(jīng)，李玉明，孫海柏，張立

(1天津市海河醫(yī)院，天津300350；2天津市呼吸疾病研究所；3國家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥防治傳染病重點研究室)

?

Xpert MTB/RIF、T-SPOT·TB及BACTEC MGIT960在結(jié)核病診斷中的應(yīng)用

郭明日1,2,3，張麗霞1,2，周洪經(jīng)1,2，李玉明1,2，孫海柏1,2，張立1,2

(1天津市海河醫(yī)院，天津300350；2天津市呼吸疾病研究所；3國家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥防治傳染病重點研究室)

目的 探討Xpert MTB/RIF、T-SPOT·TB及BACTEC MGIT960在結(jié)核病診斷中的應(yīng)用價值。方法 選擇180例受試者，其中肺結(jié)核98例、肺外結(jié)核35例及非結(jié)核病47例。所取受試者痰、支氣管灌洗液、腦脊液等標本分別采用Xpert MTB/RIF、T-SPOT·TB及BACTEC MGIT960單獨檢測及聯(lián)合檢測，用受試者工作特征(ROC)曲線下面積(AUC)評價各檢測方法的診斷效能，采用Kappa檢驗分析Xpert MTB/RIF與BACTEC MGIT960對利福平耐藥性檢測的一致性。結(jié)果 T-SPOT·TB、T-SPOT·TB+MGIT960、Xpert MTB/RIF+MGIT960+T-SPOT·TB對肺結(jié)核與肺外結(jié)核檢測的陽性率高于Xpert MTB/RIF、MGIT 960單獨檢測及二者聯(lián)合檢測(P均<0.05)。T-SPOT·TB、T-SPOT·TB+MGIT960、Xpert MTB/RIF+MGIT960+T-SPOT·TB診斷結(jié)核病的AUC比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)，但均大于Xpert MTB/RIF、MGIT 960、Xpert MTB/RIF+MGIT960的AUC(P均<0.05)。Xpert MTB/RIF與BACTEC MGIT960對利福平耐藥性檢測具有較高的一致性(κ=0.735)。結(jié)論 T-SPOT·TB檢測、T-SPOT·TB聯(lián)合MGIT960檢測、三者聯(lián)合檢測對結(jié)核病診斷有較高價值，三者聯(lián)合檢測的價值最高。

結(jié)核??；結(jié)核分枝桿菌/利福平耐藥基因檢測；結(jié)核感染T細胞斑點試驗；自動分枝桿菌培養(yǎng)及藥敏檢測系統(tǒng)

近年來，分子生物學(xué)技術(shù)及免疫學(xué)技術(shù)的發(fā)展為結(jié)核病的快速診斷及結(jié)核分枝桿菌(MTB)耐藥性檢測提供了新的方法。MTB/利福平耐藥基因檢測(Xpert MTB/RIF)是一種新型的MTB感染及利福平耐藥性分析的分子診斷平臺，由美國Cepheid公司研發(fā)，目前該分子診斷技術(shù)受到廣泛關(guān)注。結(jié)核感染T細胞斑點試驗(T-SPOT·TB)是一種使用MTB特異性抗原刺激外周血單個核細胞分泌干擾素γ(IFN-γ)的量來判斷是否存在MTB感染的免疫學(xué)技術(shù)。自動分枝桿菌培養(yǎng)及藥敏檢測系統(tǒng)(BACTEC MGIT960)采用熒光法原理，感應(yīng)培養(yǎng)管內(nèi)氧濃度的消耗情況來反映MTB生長狀態(tài)，可24 h連續(xù)監(jiān)測。2015年1～6月，本研究探討Xpert MTB/RIF、T-SPOT·TB與BACTEC MGIT960在結(jié)核病診斷中的價值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇同期住院患者180例，男111例、女69例，年齡15～86歲、平均40歲；根據(jù)《內(nèi)科學(xué)》[1]第8版診斷標準，診斷為肺結(jié)核98例、肺外結(jié)核35例(其中結(jié)核性胸膜炎16例、胸/腰椎結(jié)核11例、淋巴結(jié)核3例、結(jié)核性腦膜炎4例，腎結(jié)核1例)、非結(jié)核病47例(肺炎25例、慢性阻塞性肺氣腫9例、胸膜炎6例、支氣管哮喘患者5例、支氣管擴張2例)。標本采集：痰標本：患者清水漱口2次后打開無菌痰瓶，深吸氣用力從肺部深處咳出痰，收集于痰瓶中，擰緊瓶蓋，痰樣本保存于2～8 ℃，及時送檢。支氣管灌洗液、腦脊液、胸腹水、穿刺液標本：按照臨床無菌操作規(guī)程進行采集。尿液：收集24 h尿。其中痰標本89份、支氣管灌洗液47份、腦脊液4份、胸腹水20份、膿液19份、尿液1份。支氣管灌洗液、腦脊液、胸腹水、尿液標本檢測前以3 000 g離心20～30 min，沉淀部分加入磷酸鹽緩沖液1 mL混勻后進行后續(xù)試驗。

1.2 Xpert MTB/RIF檢測 按每1 mL標本加入2 mL標本處理液，旋緊樣本盒蓋，渦旋振蕩20 s，室溫靜置15 min，取處理后樣品2 mL加入Xpert MTB/RIF反應(yīng)盒，置于檢測模塊，儀器自動檢測，2 h后系統(tǒng)自動判讀MTB檢測結(jié)果與利福平耐藥結(jié)果。MTB培養(yǎng)結(jié)果分為陰性和陽性，利福平檢測結(jié)果分為敏感和耐藥。

1.3 T-SPOT·TB試驗 收集患者外周靜脈血5 mL，分離得外周血單個核細胞(PBMCs)，洗滌后細胞計數(shù)；PBMCs和結(jié)核特異抗原早期分泌抗原靶蛋白6及培養(yǎng)濾液蛋白10同時加入預(yù)包被有IFN-γ抗體的反應(yīng)孔中，孵育過夜(37℃、5% CO2)；次日洗板，加入二抗，孵育1 h后再次洗板，加入底物顯色液孵育7 min，蒸餾水終止反應(yīng)，記錄斑點形成細胞(SFCs)數(shù)，1個斑點代表1個效應(yīng)T淋巴細胞。結(jié)果判讀：陰性對照孔斑點數(shù)<6時，ESAT-6或CFP-10抗原孔斑點數(shù)-陰性對照孔斑點數(shù)≥6判定為陽性；陰性對照孔斑點數(shù)≥6時，檢測孔斑點數(shù)≥2倍陰性對照孔斑點數(shù)，判定為陽性。

1.4 BACTEC MGIT960檢測 取菌懸液1 mL用生理鹽水4 mL稀釋，取稀釋后的菌液100 μL加入生理鹽水9.9 mL再次稀釋,取按1∶50稀釋的菌液500 μL加入1支MGIT培養(yǎng)管中混勻。取4支MGIT培養(yǎng)管，分別標記藥物名稱，每管加入OADC營養(yǎng)添加劑500 μL，每管分別加入藥物原液100 μL、1∶5稀釋的待測菌液500 μL，連同生長對照管一起放入儀器孵育培養(yǎng)。MTB培養(yǎng)結(jié)果判讀：BACTEC MGIT960探測儀隔60 min連續(xù)自動測定培養(yǎng)管內(nèi)熒光強度變化，計算機分析判斷管內(nèi)MTB生長情況，出現(xiàn)陽性標本，儀器紅色指示燈閃亮，伴提示音，取出陽性標本經(jīng)抗酸染色為陽性的確定為MTB陽性，該陽性標本再經(jīng)對硝基苯甲酸生長試驗、28 ℃生長試驗、耐熱觸酶試驗、噻吩-2-羧酸肼試驗后判斷為MTB陽性或陰性。藥敏結(jié)果判讀：當生長對照管為陽性時，儀器開始判讀藥敏管，并連續(xù)判讀2 d的結(jié)果。當藥敏管在生長對照管出現(xiàn)陽性后2 d內(nèi)仍未生長則為敏感，有細菌生長則為耐藥。

2 結(jié)果

2.1 三種方法單獨檢測及聯(lián)合檢測結(jié)果比較 T-SPOT·TB、T-SPOT·TB+MGIT960、Xpert MTB/RIF+MGIT960+T-SPOT·TB對肺結(jié)核與肺外結(jié)核檢測的陽性率高于Xpert MTB/RIF、MGIT 960單獨檢測及二者聯(lián)合檢測，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。 見表1。

表1 三種方法單獨檢測及聯(lián)合檢測結(jié)果比較[例(%)]

2.2 三種方法單獨檢測及聯(lián)合檢測診斷結(jié)核病的效能比較 T-SPOT·TB、T-SPOT·TB+MGIT960、Xpert MTB/RIF+MGIT960+T-SPOT·TB診斷結(jié)核病的AUC比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)，但均大于Xpert MTB/RIF、MGIT 960、Xpert MTB/RIF+MGIT960的AUC(P均<0.05)。見表2。

表2 三種方法單獨檢測及聯(lián)合檢測診斷結(jié)核病的AUC比較

2.3 Xpert MTB/RIF與BACTEC MGIT960對利福平耐藥性的檢測結(jié)果比較 兩種方法對利福平耐藥性檢測的一致性比較采用Kappa檢驗，κ=0.735，表明Xpert MTB/RIF和MGIT960對利福平耐藥性的檢測具有較高的一致性。

3 討論

Xpert MTB/RIF試驗是WHO推薦用于檢測結(jié)核病的分子診斷平臺，是以半巢式實時熒光PCR技術(shù)為基礎(chǔ)，rpoB基因利福平耐藥決定區(qū)(RRDR)的81 bp核心區(qū)為靶序列，可在2 h內(nèi)檢出MTB和利福平的耐藥性[2]，由于利福平單藥耐藥非常少，臨床上常將利福平耐藥作為耐多藥結(jié)核病標志物[3,4]。T-SPOT·TB是檢測血液中分泌IFN-γ、抗原特異的T淋巴細胞最為敏感的技術(shù)，很少會受到CD4+T淋巴細胞數(shù)量少的影響。該技術(shù)對于結(jié)核病合并免疫缺陷者，仍是一種較為適宜的診斷方法[5,6]。MGIT960則是目前應(yīng)用最廣的MTB培養(yǎng)和藥敏的試驗方法。

肺結(jié)核與肺外結(jié)核患者采用以上三種檢測方法進行檢測，陽性率均高于非結(jié)核患者。肺結(jié)核與肺外結(jié)核患者經(jīng)T-SPOT·TB檢測陽性率高于Xpert MTB/RIF、MGIT960單獨檢測，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；用T-SPOT·TB、MGIT960或Xpert MTB/RIF、T-SPOT·TB與MGIT960聯(lián)合檢測，陽性率高于Xpert MTB/RIF、MGIT 960單獨檢測及二者聯(lián)合檢測，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。以臨床診斷為參照，三種方法診斷結(jié)核病的AUC均>0.7，T-SPOT·TB與其余兩種方法比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，Xpert MTB/RIF與BACTEC MGIT960比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義；診斷方法聯(lián)用后，T-SPOT·TB、MGIT960聯(lián)合診斷的AUC明顯高于MGIT960，Xpert MTB/RIF、T-SPOT·TB、MGIT 960聯(lián)合診斷的AUC明顯高于單用Xpert MTB/RIF或MGIT 960檢測?？赡芤驗椋琗pert MTB/RIF與MGIT 960均直接檢測樣本中的MTB，因此，對于菌陰結(jié)核病患者，其檢出率將受影響，臨床可根據(jù)具體情況靈活選擇檢測方法。關(guān)于T-SPOT·TB診斷結(jié)核病的價值，不同的文獻報道不一致。Qiu等[7]進行的多中心、大樣本調(diào)查結(jié)果顯示，以臨床診斷為參照，T-SPOT·TB診斷結(jié)核病的靈敏度和特異度分別為78.2%和91.1%。亦有文獻報道，其靈敏度和特異度為83.3%和80.1%，且患者的年齡、性別、免疫抑制狀態(tài)、腫瘤等因素對其試驗結(jié)果均無影響[8]。Yan等[9]報道，T-SPOT·TB診斷肺結(jié)核的靈敏度高于肺外結(jié)核，診斷未經(jīng)治療結(jié)核病的靈敏度高于正在治療中活動性結(jié)核病，故該試驗對于結(jié)核病治療效果的評估有一定價值。此外，T-SPOT·TB亦可用于結(jié)核病與非結(jié)核病的鑒別診斷[10]。研究結(jié)果顯示，Xpert MTB/RIF在肺外結(jié)核病的診斷有較高價值，敏感度為0.78，特異度為0.99[11]。由于Xpert MTB/RIF可在2 h內(nèi)檢出樣本中是否有MTB及對利福平的耐藥性，因此相對于MGIT960需要數(shù)周的時間才能出具培養(yǎng)及藥敏結(jié)果優(yōu)勢非常明顯。夏輝等[12]分析了Xpert 技術(shù)在我國的應(yīng)用前景，建議將其整合入我國結(jié)核病防治規(guī)劃。

Xpert MTB/RIF可直接檢測MTB的核酸并可檢出其對利福平的耐藥性，對耐藥結(jié)核病的快速診斷有重要意義，且其操作簡易，可有效避免基因檢測污染的問題。T-SPOT·TB則是檢測MTB所分泌的ESAT-6和CFP-10所引起的T細胞介導(dǎo)的IFN-γ反應(yīng)，對于早期結(jié)核病及菌陰結(jié)核病患者有較大診斷價值。BACTEC MGIT960則可對MTB進行快速培養(yǎng)并獲得臨床一線抗結(jié)核藥物的藥敏結(jié)果。T-SPOT·TB、T-SPOT·TB+MGIT960、Xpert MTB/RIF+MGIT960+T-SPOT·TB對結(jié)核病的診斷效能高于其他方法，三者聯(lián)合檢測效能最高。

[1] 陳灝珠，鐘南山，陸再英.內(nèi)科學(xué)[M].8版.北京：人民衛(wèi)生出版社,2013:61.

[2] Lawn SD, Nicol MP. Xpert MTB/RIF assay: development, evaluation and implementation of a new rapid molecular diagnostic for tuberculosis and rifampicin resistance[J]. Future Microbiol, 2011,6(9):1067-1082.

[3] Mokrousov I, Otten T, Vyshnevskiy B, et al. Allele-specific rpoB PCR assays for detection of rifampin-resistant mycobacterium tuberculosis in sputum smears[J].Antimicrob Agents Chemother, 2003,47(7):2231-2235.

[4] Stagg HR,White PJ, Riekstina V, et al. Decreased time to treatment initiation for multidrug-resistant tuberculosis patients after use of Xpert MTB/RIF test, latvia[J]. Emerg Infect Dis, 2016,22(3):482-490.

[5] Cai R, Chen J, Guan L, et al. Relationship between T-SPOT·TB responses and numbers of circulating CD4+T-cells in HIV infected patients with active tuberculosis[J]. Biosci Trends, 2014,8(3):163-168.

[6] Sultan B, Benn P, Mahungu T, et al. Comparison of two interferon-gamma release assays(QuantiFERON-TB Gold In-Tube and T-SPOT·TB) in testing for latent tuberculosis infection among HIV-infected adults[J]. Int J STD AIDS, 2013,24(10):775-779.

[7] Qiu Y, Wang Y, Lin N, et al. Multicenter clinical evaluation of three commercial reagent kits based on interferon-release assay for the rapid diagnosis of tuberculosis in China[J]. Int J Infect Dis, 2015(40):108-112.

[8] 盧青純,唐小燕，熊恬園，等.T-SPOT·TB試驗在活動性結(jié)核診斷中的價值及其影響因素分析[J].中國循證醫(yī)學(xué)雜志,2014,14(5):522-526.

[9] Yan L, Xiao H, Han M, et al. Diagnostic value of T-SPOT·TB interferon-γ release assays for active tuberculosis[J]. Exp Ther Med, 2015,10(1):345-351.

[10] 葉麗敏,李嵐,白班俊.T細胞斑點試驗在腸結(jié)核與克羅恩病鑒別診斷中的臨床價值[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報,2015,37(20):2091-2095.

[11] 賈留群,龍虹羽,胡倩倩,等.Xpert MTB/RIF試驗對肺外結(jié)核診斷價值的Meta分析[J].中華臨床醫(yī)師雜志(電子版),2013,7(6):2587-2591.

[12] 夏輝,趙雁林.Xpert MTB/RIF在我國的應(yīng)用前景[J].實用醫(yī)學(xué)雜志,2013,29(23):3799-3880.

天津市衛(wèi)生局科技基金資助項目(2014KZ035)。

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.37.032

R52

B

1002-266X(2016)37-0093-03

2016-01-19)