袁建菱，李萍，文琦琪，劉麗，陳小麗，王艷

(湖南中醫(yī)藥大學,湖南長沙410208)

婦科千金片對盆腔炎大鼠TLR2/4-NF-κB信號通路影響的研究

袁建菱，李萍，文琦琪，劉麗，陳小麗，王艷

(湖南中醫(yī)藥大學,湖南長沙410208)

目的觀察婦科千金片對盆腔炎大鼠子宮Toll樣受體2（TLR2）、Toll樣受體4（TLR4）、核轉(zhuǎn)錄因子kappaB（NF-κB）mRNA表達的影響,探討婦科千金片調(diào)控TLR2/4-NF-κB信號通路對盆腔炎大鼠的抗炎機制。方法通過子宮注射混合菌液建立盆腔炎大鼠模型，將60只雌性SD大鼠隨機分為5組,每組12只,即:空白組、假手術組、模型組、婦科千金片組、羅紅霉素組，分別予以相應藥物干預，運用免疫組化檢測子宮組織中TLR2、TLR4、NF-κB的灰度值；運用實時熒光定量PCR檢測子宮組織中TLR2、TLR4、NF-κB的mRNA表達變化。結果與空白組、假手術組比較，模型組的TLR2、TLR4、NF-κB灰度值顯著降低（P＜0.01），TLR2、TLR4、NF-κBmRNA的表達均顯著升高（P＜0.01），表明模型成功；與模型組比較，婦科千金片組、羅紅霉素組TLR2、TLR4、NF-κB灰度值均顯著升高（P＜0.01），TLR2、TLR4、NF-κBmRNA均顯著降低（P＜0.01）。結論婦科千金片對盆腔炎大鼠抗炎的作用機制，可能是通過調(diào)控TLR2/4-NF-κB炎性介質(zhì)變化信號通路的傳導而實現(xiàn)的。

婦科千金片；盆腔炎；Toll樣受體2；Toll樣受體4；核轉(zhuǎn)錄因子kappaB

婦科千金片是國家中藥保護品種，由千斤拔、金櫻根、穿心蓮、單面針、十大功勞、雞血藤、當歸、黨參組成，具有清熱祛濕、補血益氣的功效。近10年來研究發(fā)現(xiàn)婦科千金片具有抑菌、抗炎、鎮(zhèn)痛、補益氣血、提高免疫力等作用。研究表明：婦科千金片對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、乙型溶血性鏈球菌和白色念珠菌均有抑菌作用，對環(huán)磷酰胺所致免疫低下的小鼠，具有增加血清溶血抗體、提高細胞吞噬百分率和吞噬指數(shù)的作用[1]。本課題組前期研究顯示：婦科千金片能提高機體免疫能力，調(diào)節(jié)炎癥機體血清中細胞因子，促進Ig分子生成[2]，調(diào)節(jié)盆腔組織中炎性因子的表達，抑制核轉(zhuǎn)錄因子kappaB（NF-κB）所引起的級聯(lián)反應，減輕機體組織炎癥損傷[3]。

TLR2、TLR4在炎癥反應中起著重要的信號轉(zhuǎn)導作用，可通過TLR受體信號通路調(diào)控炎癥免疫反應，從而達到調(diào)節(jié)炎癥的目的[4]。由此可以提出以下假說：婦科千金片抑制TLR基因表達可以作為抗炎免疫的靶點，其機制是通過TLR2/4-NF-κB-信號通路調(diào)控炎性介質(zhì)變化。

本研究在課題組以往臨床、動物研究工作的基礎上采用婦科千金片，以盆腔炎模型大鼠為受試對象，運用免疫組化和熒光定量PCR技術，從細胞和分子水平探討婦科千金片對盆腔炎大鼠抗炎的作用機制，現(xiàn)將結果報道如下。

1　材料

1.1動物

SPF級成年雌性Sprague Dawley大鼠60只,體質(zhì)量200～220 g,由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供,許可證號:SYXK2013(湘)-0005。

1.2試劑與藥物

PBS、BSA、SABC、DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋生物工程有限公司）；TLR2、TLR4、NF-κB抗體（Proteintech公司），DAB顯色試劑盒（武漢博士德生物公司）；引物（南京金斯瑞公司）；TLR2、TLR4、NF-κB總RNA提取試劑盒（Invitrogen公司）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（vazyme公司）；PCR試劑盒（Fermentas公司）；婦科千金片：批號：201412054（株洲千金藥業(yè)有限公司）；羅紅霉素分散片：150 mg/片，批號：1502121（江蘇神龍藥業(yè)有限公司）。

1.3主要儀器

TGL16M臺式高速冷凍離心機（湖南長沙市科威實業(yè)有限公司）；MIASE圖像分析系統(tǒng)（北航公司）；紫外分光光度計（麥克奧迪實業(yè)集團有限公司）；480型DNA熱循環(huán)儀（Perkin Elmer公司）；DYCP-31C型電泳儀（北京六一儀器）；7500熒光定量PCR儀（ApplidBiosystems公司）。

2　方法

2.1動物分組

將60只雌性SD大鼠,按照隨機數(shù)字表分為5組,即:空白組、假手術組、模型組、婦科千金片組、羅紅霉素組（西藥對照組)，每組12只。

2.2造模方法[5]

除空白組與假手術組外，將實驗大鼠分別稱質(zhì)量，腹部常規(guī)消毒，用10%水合氯醛350 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，腹部分別用碘伏和75%酒精消毒，下腹部正中切口約2 cm，暴露子宮，用1 mL注射器針頭在子宮分叉處分別向左右兩側(cè)子宮向卵巢方向緩慢注入0.2 mL含3×109個/mL的混合菌液，注畢，分層縫合傷口，消毒術區(qū)。大鼠造模術后第4天隨機分為婦科千金片組、羅紅霉素組。按大鼠與人等效劑量換算方法計算出各大鼠給藥劑量：婦科千金片組1.89 g/kg；羅紅霉素組：羅紅霉素82.74 mg/kg。各藥均配成10 mL/kg給藥溶液，每天定時經(jīng)口灌胃給藥治療，每日1次,連續(xù)21 d。假手術組，手術操作同上，朝卵巢方向注射等量0.9%生理鹽水，空白組不予任何處理。模型成功標準：采用HE染色,光鏡下觀察子宮組織病理改變情況,以確定造模是否成功。

2.3取材方法

大鼠給藥治療結束后的第2天清晨禁食，10%水合氯醛350 mg/kg腹腔注射麻醉。剖開腹腔后,取雙側(cè)子宮，一側(cè)組織于10%中性甲醛固定于4℃保存，用于免疫組化檢測；一側(cè)組織放置于凍存管中，標號后存于-80℃冰箱中，用于Real-time PCR檢測。

2.4檢測方法

2.4.1免疫組化圖像采集與分析把所截取的子宮進行石蠟包埋，制成厚約5μm的切片。操作應嚴格按照試劑盒說明書的步驟實施：（1）切片常規(guī)脫蠟至水化（步驟:每15 min用純二甲苯清洗1次，共清洗2次；100%、95%、80%梯度酒精水化各5 min；自來水清洗5 min；每隔5 min蒸餾水清洗1次，共2次）；（2）將1份30%H2O2和10份蒸餾水倒入一起，室溫下靜置10 min，以滅活內(nèi)源性酶。蒸餾水洗3次。熱修復抗原：把切片放入0.01M枸櫞酸鹽緩沖液（PH6.0）后，用微波爐加熱至沸騰3次，每次間隔5 min。冷卻后PBS（PH7.2）洗滌2次；（3）加入5%的BSA封閉液，室溫20 min。甩去多余液體，不洗；（4）滴加適當稀釋一抗大鼠TLR2、TLR4、NF-κB單克隆抗體（1∶100），37℃1 h。PBS（PH7.2）洗2分鐘×3次；（5）滴加適量生物素化山羊抗兔IgG，37℃溫箱20 min。PBS（PH7.2）洗2 min×3次；（6）滴加試劑SABC，37℃20 min。PBS（PH7.2）洗5 min×4次；（7）DAB顯色:使用DAB顯色試劑盒。取試劑盒中A、B、C試劑各1滴,加入到1 mL蒸餾水中,搖勻后滴在切片上。

免疫組化圖像分析所有圖像均采用MIAPS醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)進行分析，用陽性細胞的數(shù)量表示灰度值，再以灰度值來表示抗原的表達量。每個切片重復測量3次，然后取平均值進行統(tǒng)計。

2.4.2Real-time PCR法檢測大鼠子宮組織TLR2、TLR4、NF-κBmRNA表達Trizol提取細胞總RNA，操作步驟按試劑盒說明書執(zhí)行，RNA純度運用紫外分光光度計測定。引物在NCBI上搜索目的基因的序列，經(jīng)Blast進行同源性分析，分析結果顯示引物特異性好，無明顯非特異性擴增。本實驗用β-action作為內(nèi)參照。（該引物及內(nèi)參照β-action引物均委托南京金斯瑞合成，運用primer5.0軟件設計）。NF-κB-F：GCTCACGTACATCTCAGAGGGTTGG，NF-κB-R：TCCTCATTCTCATCGGCTGCTTTT，產(chǎn)物長度：138 bp；TLR4-F：CATTGCTGCCAACATCATCC，TLR4-R：CCAGAGCGGCTACTCAGAAACT，產(chǎn)物長度：144bp；TLR2-F：TTCTCAATGGGTTCCAGCAAA，TLR2-R：ACGCAGTGAGTGGTGCAAGTAT，產(chǎn)物長度：102 bp；β-action-F：GAACGGGAAGCTGGTCATCAA，β-action-R：TGATGACCCTTTTGGCTCCG，產(chǎn)物長度：174 bp。PCR反應條件為：95℃10 min；95℃10 s，59℃50 s，讀板，40個循環(huán)；熔解曲線60~95℃，結束反應。PCR儀器自動生成標準曲線和熔解曲線。

選擇數(shù)據(jù)分析方式：本檢測采用相對定量法檢驗基因的表達變化。本實驗中目的基因與內(nèi)參的擴增效率基本一致，故應用△△CT法進行相對定量分析。比較5組子宮中TLR2、TLR4、NF-κBmRNA的表達量,以空白組子宮中TLR2、TLR4、NF-κBmRNA的表達量作為標準對照。按照下列公式計算各組樣本中TLR2、TLR4、NF-κBmRNA的相對表達量[6]。2-△△CT表示的是實驗組目的基因的表達相對于空白組的變化倍數(shù)，△△CT=（目的基因CT值-內(nèi)對照基因CT值）實驗組-（目的基因CT值-內(nèi)對照基因CT值）對照組，目的基因的相對含量=2-△△CT。

2.5統(tǒng)計方法

所有數(shù)據(jù)均輸入計算機，用SPSS 17.0軟件進行處理。各檢測指標統(tǒng)計數(shù)據(jù)均以“±s”表示，組間兩兩比較若方差齊時選擇LSD法，方差不齊時選擇Tamhane法進行方差分析。

3　結果

3.1動物死亡情況

在實驗過程中，共有8只大鼠死亡，其中3只死于麻醉意外，2只死于術后感染，3只在干預治療過程中不明原因猝死。（空白組死亡1只，假手術組2只，模型組死亡2只，婦科千金片組2只，羅紅霉素組1只)。

3.2婦科千金片對盆腔炎大鼠子宮TLR2、TLR4、NF-κB抗原活性的影響

與空白組、假手術組比較，模型組TLR2、TLR4、NF-κB灰度值均顯著降低（P＜0.01），與模型組比較，婦科千金片組、羅紅霉素組TLR2、TLR4、NF-κB灰度值均顯著升高（P＜0.01），表明婦科千金片、羅紅霉素均對盆腔炎大鼠具有一定的治療作用；且婦科千金片組與羅紅霉素組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），顯示婦科千金片、羅紅霉素對盆腔炎的療效相當。見圖1-3、表1。

圖1　各組免疫組化TLR2表達光鏡圖（×200倍）

圖2　各組免疫組化TLR4表達光鏡圖（×200倍）

圖3　各組免疫組化NF-κB表達光鏡圖（×200倍）

3.3婦科千金片對盆腔炎大鼠子宮TLR2、TLR4、NF-κBmRNA表達的影響

與空白組、假手術組比較，模型組TLR2、TLR4、NF-κBmRNA的表達均顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，婦科千金片組、羅紅霉素組TLR2、TLR4、NF-κBmRNA均顯著降低（P＜0.01），表明婦科千金片、羅紅霉素治療藥物均對盆腔炎大鼠子宮的TLR2、TLR4、NF-κBmRNA表達具有一定下調(diào)作用；且婦科千金片組與羅紅霉素組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），顯示婦科千金片、羅紅霉素對盆腔炎的療效相當。見表2。

表1　各組大鼠子宮TLR2、TLR4、NF-κB表達的灰度值比較（±s）

表1　各組大鼠子宮TLR2、TLR4、NF-κB表達的灰度值比較（±s）

注：與空白組比較，#P＜0.05,##P＜0.01；與假手術組比較，▲P＜0.05,▲▲P＜0.01；與模型組比較，※※P＜0.01。

組別空白組假手術組模型組婦科千金組羅紅霉素組F值P值n 11 10 10 10 11 TLR2灰度值179.50±22.15 164.95±9.34 82.21±6.34##▲▲145.27±4.81#▲※※139.53±7.64#▲※※8.59＜0.05 TLR4灰度值162.54±17.47 153.48±7.25 91.27±6.64##▲▲137.74±8.62#▲※※127.59±4.34#▲※※4.43＜0.05 NF-κB灰度值155.62±14.61 147.54±7.71 86.94±5.62##▲▲131.48±11.76#▲※※121.37±4.59#▲※※5.57＜0.05

表2　各組大鼠子宮TLR2、TLR4、NF-κBmRNA表達的比較（±s）

表2　各組大鼠子宮TLR2、TLR4、NF-κBmRNA表達的比較（±s）

注：與空白組比較，##P＜0.01；與假手術組比較，▲▲P＜0.01；與模型組比較，※※P＜0.01。

組別空白組假手術組模型組婦科千金組羅紅霉素組F值P值n 11 10 10 10 11 TLR2mRNA 1.45±0.67 1.67±0.326 3.86±0.43##▲▲2.25±0.27##▲▲※※2.43±0.32##▲▲※※31.52＜0.01 TLR4mRNA 1.37±0.24 1.49±0.38 3.64±0.43##▲▲1.93±0.31##▲▲※※1.97±0.27##▲▲※※35.14＜0.01 NF-κBmRNA 1.24±0.23 1.49±0.16 2.98±0.26##▲▲2.21±0.32##▲▲※※2.14±0.29##▲▲※※36.98＜0.01

4　討論

Toll樣受體（TLR）首先在果蠅中發(fā)現(xiàn)。已經(jīng)證實哺乳動物也存在TLR同源域,被命名為TLR家族。TLR是一組跨膜受體蛋白質(zhì),包括胞外豐富的亮氨酸序列和胞內(nèi)與白介素-1（IL-1）受體信號域顯著同源的尾狀結構域,稱為Toll/IL-1同源域。配體與TLR聚合活化后,接頭蛋白髓樣因子(myeloid differentiation factor 88,MyD88)與TLR胞內(nèi)尾狀結構結合,激活絲裂原激活蛋白激酶和NF-κB通路。這樣,TLR介導的信號誘導了編碼促炎因子的基因大量表達。目前為止，人類TLR家族有12名成員已被發(fā)現(xiàn)，其中以表達TLR4為主，尚有少量的TLR2。研究表明,TLR可能是細菌感染與炎癥形成的一個橋梁,TLR在炎癥形成中的信號通路有條主線：TLRNF-κB信號通路調(diào)控炎性介質(zhì)變化[4]。

NF-κB作為一種普遍存在的轉(zhuǎn)錄因子，是多種信號轉(zhuǎn)導途徑的匯聚點，不僅參與介導了免疫應答病毒復制、細胞凋亡和增殖的多種基因的表達，而且在調(diào)節(jié)炎癥反應的基因表達中起關鍵作用。已證實NF-κB可高效誘導多種細胞因子(如IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α)、黏附分子(如ICAM1、VCAM1、ELAM1)、趨化因子和急性期反應蛋白的基因蛋白的基因表達，同時對參與炎癥級聯(lián)瀑布效應的多種酶的基因表達具有重要的調(diào)控作用[7]。

有研究[8-9]取三七提取物(含三七總皂苷和三七氨酸)進行治療用大腸桿菌、金黃色葡萄球菌及消化性鏈球菌的混合菌液復制出恒河猴子宮內(nèi)膜炎出血模型，發(fā)現(xiàn)三七復合有效成分可以抑制：阻斷NF-κB的信號通路，降低TNF-αmRNA的表達，抑制炎性細胞因子TNF-α的生成。丁青[10-11]等用三七復合成分治療子宮內(nèi)膜炎患者，發(fā)現(xiàn)三七復合成分可以調(diào)節(jié)MMP-1和TIMP-1系統(tǒng)的平衡；有效降低炎癥因子TNF-α、IL-1β的含量，降低NF-κB p65的轉(zhuǎn)錄及蛋白表達量，抑制NF-κB p65的核因子DNA結合活性。從而促進子宮內(nèi)膜細胞炎癥的修復，三七復合有效成分能促使炎癥細胞轉(zhuǎn)歸，有效保護細菌脂多糖對培養(yǎng)細胞的損傷，有長效持續(xù)性保護細胞形態(tài)完整性功能。本課題組前期已研究證實，婦科千金片能改善盆腔炎大鼠盆腔組織的炎癥病變，有保護盆腔組織作用[12-13]，減少細胞凋亡，降解細胞外基質(zhì)抑制炎癥反應[14]。

本實驗通過免疫組化檢測證實婦科千金片能使盆腔炎大鼠子宮的TLR2、TLR4、NF-κB的灰度值顯著升高，灰度值的高低與蛋白表達的強弱成反比關系，表明盆腔炎模型大鼠子宮的TLR2、TLR4、NF-κB表達水平顯著降低。運用實時熒光定量PCR技術檢測結果表明，婦科千金片對盆腔炎大鼠模型的干預，使TLR2/4-NF-κB信號通路中TLR2、TLR4、NF-κBmRNA表達明顯下降，抑制了因NF-κB激活而產(chǎn)生的一系列炎癥反應，從而表明婦科千金片對盆腔炎大鼠抗炎的作用，其機制可能是通過調(diào)控TLR2/4-NF-κB炎性介質(zhì)變化信號通路的傳導而實現(xiàn)的。

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（本文編輯 楊瑛）

Effect of Fuke Qianjin Tablets on TLR2/4-NF-κB Signaling Pathway in Pelvic Inflammatory Model Rats

YUAN Jianling,LI Ping,WEN Qiqi,LIU Li,CHEN Xiaoli,WANG Yan
(Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,China)

Objective To observe the effect of Fuke Qianjin tablets on the expression of TLR2,TLR4,NF-κB in pelvic inflammatory model rats,and to investigate its anti-inflammatory mechanism of TLR2/4-NF-κB signaling pathway on the pelvic inflammatory rats.Methods The 60 female SD rats were injected with the mixture of the uterus to establish the model of the rats with pelvic inflammatory disease.Then the rats were randomly divided into 5 groups,12 rats in each group,namely:blank group,sham operation group,model group,Fuke Qianjin tablets group,roxithromycin group,which were given corresponding drug intervention.The gray values of TLR2,TLR4,NF-κB were detected by immunohistochemistry, and the expression of TLR2，TLR4,NF-κB mRNA of uterus was detected by real-time fluorescence quantitative PCR.Results Compared with the blank group,sham operation group,the gray values of TLR2,TLR4 and NF-κB in model group were decreased significantly(P＜0.01),the expression of TLR2,TLR4 and NF-κB mRNA were significantly increased(P＜0.01).Compared with the model group,the gray values of TLR2,TLR4 and NF-κB in Fuke Qianjin tablets group and roxithromycin group were significantly increased(P＜0.01),the TLR2,TLR4 and NF-κB mRNA were significantly lower(P＜0.01).Conclusion Mechanism of anti-inflammation of Fukeqianjin tablets on pelvic inflammatory model rats may be through the regulation of TLR2/4-NF-κB inflammatory medium signaling pathway.

Fukeqianjin tablets;pelvic inflammatory disease;TLR2;TLR4;NF-κB

R285.5；R271

A

10.3969/j.issn.1674-070X.2016.11.004

2015-11-30

湖南省科技廳資助項目（2014SK3005）。

袁建菱，女，碩士，講師，主要從事中藥新藥的研究與開發(fā)，E-mail：jly888666@163.com。