李敏惠，陳 瑜，蔣玉亮，李 艷，余 赟，毛明星，林定彪，楊亞瓊，楊 平△

1.成都醫(yī)學(xué)院 科研實(shí)驗(yàn)中心(成都，610083)；2.成都醫(yī)學(xué)院 生物醫(yī)學(xué)系(成都，610083)；3.成都醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院(成都，610083)

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·論 著·

納豆激酶檢測(cè)體系的建立及其跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)途徑初探*

李敏惠1，陳 瑜2，蔣玉亮2，李 艷2，余 赟3，毛明星2，林定彪2，楊亞瓊3，楊 平3△

1.成都醫(yī)學(xué)院 科研實(shí)驗(yàn)中心(成都，610083)；2.成都醫(yī)學(xué)院 生物醫(yī)學(xué)系(成都，610083)；3.成都醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院(成都，610083)

目的 建立納豆激酶(nattokinase，NK)酶聯(lián)檢測(cè)體系，探討其跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制。方法 采用雜交瘤技術(shù)篩選抗NK的單克隆抗體，競(jìng)爭(zhēng)抑制法鑒定單抗識(shí)別的抗原表位，Western Blot測(cè)定單抗特異性，雙抗夾心ELISA法進(jìn)行單抗靈敏度測(cè)定，Caco-2細(xì)胞模型探討NK跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，生物信息學(xué)預(yù)測(cè)NK穿膜相關(guān)序列。結(jié)果 篩選得到穩(wěn)定分泌抗體且特異性識(shí)別NK的雜交瘤細(xì)胞6株，其中3株單抗識(shí)別相近的抗原表位，其余單抗識(shí)別不同的抗原表位；6株單抗檢測(cè)NK的最小靈敏度分布為0.78～20.00 ng/mL；Caco-2細(xì)胞模型顯示，胞吞作用不是NK跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的主要途徑；生物信息學(xué)提示，NK中含有3段穿膜相關(guān)序列。結(jié)論 基于NK單抗建立的酶聯(lián)檢測(cè)體系，可有效監(jiān)控NK跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程，NK可能是依據(jù)蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域直接介導(dǎo)而實(shí)現(xiàn)其腸道吸收轉(zhuǎn)運(yùn)。

納豆激酶；單克隆抗體；跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)；蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域

藥物在體內(nèi)的生物利用度與藥物胃腸粘膜通透性相關(guān)聯(lián)，蛋白質(zhì)、肽類等大分子藥物因其膜透過(guò)性不甚理想，影響其生物利用度，限制了該類藥物的應(yīng)用[1]。此外，很多具有應(yīng)用前景的藥物受到人體內(nèi)各種天然屏障(如血腦屏障)的限制也難以到達(dá)靶器官或靶細(xì)胞發(fā)揮藥效，可見(jiàn)藥物的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)是藥理學(xué)研究中一個(gè)不可忽視的重點(diǎn)[2]。

納豆激酶(nattokinase，NK)是具有纖溶活性的絲氨酸蛋白酶，對(duì)交聯(lián)纖維蛋白具有高效、特異的水解活性。更為重要的是，NK在胃腸道內(nèi)穩(wěn)定，可保留活性經(jīng)腸道粘膜上皮細(xì)胞吸收入血，具有穿越腸絨毛膜屏障的特性[3-4]。作為潛在的溶栓藥，NK可降低血栓患者出血風(fēng)險(xiǎn)，口服生物利用度高，具有很好的應(yīng)用前景[5]。然而，盡管既往研究已明確NK可以經(jīng)腸道吸收入血，卻未對(duì)NK穿越腸壁屏障的分子機(jī)制進(jìn)行研究。本研究擬基于NK的單克隆抗體建立檢測(cè)體系，利用Caco-2細(xì)胞模型探討NK跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)途徑，為NK臨床藥用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

雌性6～8 w齡BALB/c小鼠及新西蘭兔購(gòu)自四川達(dá)碩公司；小鼠骨髓瘤細(xì)胞Sp2/0-Ag14、人Caco-2細(xì)胞為成都醫(yī)學(xué)院科研實(shí)驗(yàn)中心傳代保存；弗氏佐劑、胸腺嘧啶核苷(T)、次黃嘌呤(H)、氨基蝶呤(A)、聚乙二醇4000(PEG4000)購(gòu)自Sigma公司。RPMI 1640及胎牛血清購(gòu)自GIBCO公司；HRP標(biāo)記試劑盒(EZ-Link?Plus Activated Peroxidase，31489)，抗體亞型鑒定試劑盒(Rapid Isotyping Kit，37503)購(gòu)自Pierce公司；HRP化學(xué)發(fā)光底物購(gòu)自Millipore公司；HRP-Goat anti Mouse IgG抗體購(gòu)自CST公司；Protein A/G 親和柱、β-巰基嘧啶親和柱購(gòu)自GE公司；NK由成都地奧九泓制藥廠提供。

1.2 抗NK鼠雜交瘤細(xì)胞的篩選

以2 mL完全弗氏佐劑乳化等體積的NK(NK溶解于PBS，濃度為0.5 mg/mL)作為抗原，以50 μL/只腹腔注射免疫BALB/c小鼠；2 w后，用不完全弗氏佐劑乳化抗原加強(qiáng)免疫；頜下靜脈取血，間接ELISA法檢測(cè)血清免疫效價(jià)，當(dāng)血清效價(jià)>1∶105時(shí)，抗原直接免疫，3 d后取免疫鼠脾細(xì)胞與SP2/0-Ag14細(xì)胞在PEG4000介導(dǎo)下融合；融合細(xì)胞用間接ELISA法及有限稀釋克隆法篩選HAT抗性的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞。秋水仙素法對(duì)雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行染色體分析：秋水仙素(0.4 μg/mL)特異破壞紡錘絲而獲得中期分裂相細(xì)胞；再用0.075 mol/L KCl 溶液等低滲處理，使細(xì)胞膨脹，體積增大，染色體松散；經(jīng)甲醇-冰醋酸溶液固定，即可觀察。

1.3 NK兔多抗的制備、純化及鑒定

以2 mL完全弗氏佐劑乳化等體積的NK(NK溶解于PBS，濃度為0.5 mg/mL)作為抗原，以500 μL/只皮下多點(diǎn)免疫新西蘭兔；2 w后加強(qiáng)免疫(不完全弗氏佐劑乳化抗原)；耳靜脈取血，間接ELISA法檢測(cè)血清效價(jià)；當(dāng)血清效價(jià)>1∶105時(shí)，收集血清，Protein A親和柱純化IgG抗體；HRP標(biāo)記試劑盒用于HRP與抗體的偶聯(lián)，標(biāo)記兔多抗。

1.4 單克隆抗體的鑒定

1.4.1 抗體亞型鑒定及抗體純化 雜交瘤細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)上清用于抗體鑒定。亞型鑒定試劑盒檢測(cè)抗體亞型：將抗體稀釋液以50 μL/孔加入已包被的酶聯(lián)板，再加入HRP標(biāo)記的Goat Anti-Mouse IgG/IgA/IgM，室溫1 h，TMB顯色，450 nm測(cè)定吸光度，判定抗體重鏈及輕鏈類型。根據(jù)抗體亞型選擇純化體系純化抗體：IgG用Protein A親和柱，IgM用β-巰基嘧啶親和柱純化?？贵w純化效果以SDS-PAGE電泳檢測(cè)，檢測(cè)還原樣品時(shí)加二硫蘇糖醇(DTT)還原。

1.4.2 Western blot檢測(cè)抗體特異性 以抗原NK做SDS-PAGE電泳，分離膠濃度為15%，轉(zhuǎn)印于PVDF膜，封閉后與檢測(cè)單抗4 ℃孵育過(guò)夜，再加入HRP標(biāo)記的兔抗鼠二抗，37 ℃孵育2 h，HRP化學(xué)發(fā)光底物顯色、成像。

1.4.3 NK酶聯(lián)檢測(cè)體系的建立及單抗檢測(cè)靈敏度測(cè)定 NK雙抗夾心酶聯(lián)體系建立：以表位單抗為包被抗體，加入NK或檢測(cè)樣品，PBS為空白對(duì)照，以檢測(cè)樣品Buffer為陰性對(duì)照，HRP-兔抗NK的多抗為檢測(cè)抗體。測(cè)定單抗靈敏度時(shí)，用表位抗體包被過(guò)夜，洗滌、加入倍比稀釋的NK，37 ℃孵育2 h，以HRP-兔抗NK的IgG為檢測(cè)抗體，TMB顯色，450 nm測(cè)定吸光度。以測(cè)定值與對(duì)照值之比[(OD樣品-OD陰性)/OD陰性]≥2.1時(shí)的最大稀釋度為NK最小檢測(cè)靈敏度。

1.4.4 抗體HRP標(biāo)記及單克隆抗體識(shí)別位點(diǎn)的比較 HRP標(biāo)記試劑盒用于HRP和單抗的偶聯(lián)，競(jìng)爭(zhēng)抑制法測(cè)定抗體識(shí)別位點(diǎn)。NK包被過(guò)夜，洗滌，抗體(倍比稀釋)與酶標(biāo)抗體等體積混合，37 ℃孵育，洗滌，TMB顯色，測(cè)定450 nm的OD值。競(jìng)爭(zhēng)抑制率=(1-加入競(jìng)爭(zhēng)抗體孔/對(duì)照)×100%。以抗體自身競(jìng)爭(zhēng)抑制率50%對(duì)應(yīng)的未標(biāo)記抗體濃度為標(biāo)準(zhǔn)，比較未標(biāo)記抗體與該酶標(biāo)抗體競(jìng)爭(zhēng)時(shí)50%抑制率對(duì)應(yīng)的濃度，二者水平越接近說(shuō)明兩者的識(shí)別位點(diǎn)越相似甚至相同。

1.5 Caco-2細(xì)胞模型構(gòu)建及鑒定

成熟的Caco-2細(xì)胞即可形成與腸上皮細(xì)胞相同的細(xì)胞極性和致密的單細(xì)胞層組織，是研究藥物吸收轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制、預(yù)測(cè)體內(nèi)吸收的一個(gè)較理想的體外模型，本研究選用Caco-2細(xì)胞模型研究NK的轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程[6]。

1.5.1 建立Caco-2細(xì)胞模型 以2×105/mL的密度接種Caco-2細(xì)胞于Transwell小室內(nèi)，加入1 640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。采用激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞微絨毛結(jié)構(gòu)及細(xì)胞間緊密連接情況，確定是否建立Caco-2單細(xì)胞層；跨膜電阻(trans-epithelial electrical resistance，TEER)值驗(yàn)證單細(xì)胞層的完整性(滿足TEER為300～500 Ω/cm2)。

1.5.2 AKP檢測(cè)Caco-2細(xì)胞模型的通透性 堿性磷酸酶AKP是腸上皮細(xì)胞的標(biāo)志性酶，測(cè)定刷狀緣(apical side，AP)側(cè)和基底(basolateral side，BL)側(cè)的AKP酶活性并加以比較，可作為衡量單細(xì)胞層極化程度的指標(biāo)。分別從Transwell小室的AP側(cè)和BL側(cè)吸取培養(yǎng)液，按照試劑盒(凱基生物KGT043)檢測(cè)流程，在492 nm處檢測(cè)并計(jì)算出相應(yīng)的AKP活性，當(dāng)AP側(cè)的酶活性遠(yuǎn)大于BL側(cè)時(shí)，表明細(xì)胞生長(zhǎng)已經(jīng)形成了極性，具有通透性，Caco-2細(xì)胞模型可用于藥物吸收實(shí)驗(yàn)。

1.6 NK轉(zhuǎn)運(yùn)途徑初探

經(jīng)典理論認(rèn)為，大分子蛋白保留活性進(jìn)入細(xì)胞，胞吞是主要的途徑[7]。我們利用低溫條件下，細(xì)胞胞吞功能被阻斷的特性，在Caco-2細(xì)胞模型中，觀察NK在4 ℃和37 ℃條件下透過(guò)細(xì)胞膜的情況，并用酶聯(lián)檢測(cè)細(xì)胞模型中AP側(cè)和BL側(cè)NK的含量，探討NK跨膜轉(zhuǎn)移機(jī)制。

2 結(jié)果

2.1 抗NK單克隆抗體制備及鑒定

BALB/c小鼠經(jīng)NK免疫后，通過(guò)細(xì)胞融合及篩選得到穩(wěn)定分泌抗體的細(xì)胞株6株(命名為：C3/G11/F4/A7/H2/E5)。

2.1.1 雜交瘤細(xì)胞的染色體分析 6株細(xì)胞的染色體數(shù)目均在100～120之間，接近脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞染色體數(shù)的總和；細(xì)胞大多數(shù)為端著絲粒染色體，偶可見(jiàn)中部著絲粒染色體，符合雜交瘤細(xì)胞株的特點(diǎn)(圖1)。

圖1 雜交瘤細(xì)胞染色體分析

注：A:C3；B:G11；C:F4；D:A7；E:H2；F:E5

2.1.2 單克隆抗體的抗體類型鑒定及抗體純化 5株單抗的重鏈?zhǔn)荌gG1，1株重鏈?zhǔn)荌gM，輕鏈均為κ型(表1)；根據(jù)抗體亞型選擇純化體系純化抗體，純化結(jié)果如圖2所示。

2.1.3 抗體識(shí)別表位鑒定 當(dāng)競(jìng)爭(zhēng)抑制率為50%時(shí)，H2/A7/E5濃度接近，即它們識(shí)別的位點(diǎn)相似或相同，而H2/G11/C3/F4在競(jìng)爭(zhēng)抑制率為50%時(shí)的濃度差異均大于400倍，說(shuō)明它們識(shí)別表位不同(圖3)。

表1 單克隆抗體亞型鑒定

圖2 NK單抗純度檢測(cè)

注：A.未還原；B.還原；M: Marker；1:C3；2:G11；3:F4；4:A7；5:H2；6:E5

圖3-1 未標(biāo)記單抗對(duì)HRP-H2結(jié)合NK的競(jìng)爭(zhēng)抑制(n=3)

圖3-2 未標(biāo)記單抗對(duì)HRP-G11結(jié)合NK的競(jìng)爭(zhēng)抑制(n=3)

圖3-3 未標(biāo)記單抗對(duì)HRP-C3結(jié)合NK的競(jìng)爭(zhēng)抑制(n=3)

2.1.4 Western Blot檢測(cè)抗體特異性 6株單抗在27.5 KD處都有特異性條帶，說(shuō)明得到的抗體是抗NK的特異性抗體(圖4)。

圖4 單抗特異性檢測(cè)

注：泳道1:C3；泳道2:G11；泳道3:F4；泳道4:A7；泳道5:H2；泳道6:E5；泳道7:Marker

2.2 NK酶聯(lián)檢測(cè)體系的建立及單抗檢測(cè)靈敏度測(cè)定

6株單抗檢測(cè)NK的最小靈敏度不同，分布在0.781～20 ng/mL之間，表明建立的酶聯(lián)體系可以有效檢測(cè)NK，并監(jiān)控其跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程。

2.3 NK跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)途徑初探

Caco-2細(xì)胞模型建立后，激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞微絨毛結(jié)構(gòu)及細(xì)胞間緊密連接情況，結(jié)果顯示，細(xì)胞呈“鋪路石”狀，規(guī)則，多邊形，排列緊密，緊密連接清晰可見(jiàn)；且跨膜電阻TEER為360 Ω/cm2；提示已形成完整的細(xì)胞單層，且細(xì)胞膜完整性良好。AKP檢測(cè)顯示AP側(cè)的酶活性遠(yuǎn)大于BL側(cè)，表明細(xì)胞生長(zhǎng)已形成極性，具有通透性，可用于模擬小腸粘膜上皮細(xì)胞的吸收實(shí)驗(yàn)。經(jīng)典理論認(rèn)為，大分子蛋白保留活性進(jìn)入細(xì)胞，胞吞是主要的途徑。而低溫條件下，細(xì)胞胞吞功能將被阻斷。酶聯(lián)結(jié)果顯示，在Caco-2細(xì)胞模型中，NK在4 ℃ 和37 ℃都能有效穿透細(xì)胞膜屏障；可見(jiàn)，NK腸道吸收過(guò)程中胞吞作用不是主要途徑。我們推測(cè)，NK活性肽段很有可能是通過(guò)分子內(nèi)的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(Protein transduction domain，PTD)直接介導(dǎo)而實(shí)現(xiàn)其腸道吸收轉(zhuǎn)運(yùn)。

2.4 NK蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域PTD預(yù)測(cè)

鑒于PTD在既往大分子蛋白質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中所發(fā)揮的非經(jīng)典胞吞介導(dǎo)作用[8]，我們不禁產(chǎn)生這樣的疑問(wèn)：同樣通過(guò)非經(jīng)典胞吞作用實(shí)現(xiàn)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的NK分子上是否也存在PTD結(jié)構(gòu)域？NK經(jīng)腸吸收的特性是否也與PTD結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)有關(guān)？為探究上述問(wèn)題，課題組對(duì)NK分子的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了生物信息學(xué)檢索和建模工作，借助NCBI、SWISS MODEL、SOFTBERRY等軟件對(duì)NK的三維構(gòu)象、功能結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示：NK至少含有3段穿膜相關(guān)序列(transmembrane segments)，分別位于肽鏈的第72～94 Aas處、第142～156 Aas處和第225～238 Aas處，長(zhǎng)度小于30 Aas，且富含疏水性氨基酸(Ala最多)，空間構(gòu)象多為α螺旋，與穿膜肽的特征相吻合(圖5)[9]。

圖5 NK穿膜肽段預(yù)測(cè)及三維結(jié)構(gòu)圖

注：I：SOFTBERRY預(yù)測(cè)結(jié)果，框內(nèi)為穿膜肽段；II：NK結(jié)構(gòu)域示意圖，箭頭表示催化位點(diǎn)及底物結(jié)合位點(diǎn)，框內(nèi)表示可能的穿膜結(jié)構(gòu)域；III-A：swiss model預(yù)測(cè)的NK三維預(yù)測(cè)圖；III-B：3個(gè)穿膜域；III-C：第1個(gè)和第2個(gè)穿膜域，III-D：第3個(gè)穿膜域(從N端到C端)

3 討論

細(xì)胞穿膜肽(cell-penetrating peptide，CPP)是近年來(lái)備受關(guān)注的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)肽，是一種具有跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)功能的PTD，其長(zhǎng)度小于30個(gè)氨基酸殘基，可通過(guò)巨胞飲而非經(jīng)典胞吞作用攜帶蛋白質(zhì)、多肽、核酸等大分子物質(zhì)，通過(guò)無(wú)受體介導(dǎo)、無(wú)耗能的方式，進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞，轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高且不會(huì)造成細(xì)胞損傷。利用穿膜肽作為靶向?qū)胼d體，將有利于增加蛋白質(zhì)、肽類等大分子藥物的膜透過(guò)性，在細(xì)胞生物學(xué)、基因治療、藥物體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)、臨床藥效評(píng)價(jià)等研究領(lǐng)域，均具有誘人的應(yīng)用前景[8,10]。

本研究以NK單抗為探針，建立其酶聯(lián)檢測(cè)體系，監(jiān)控Caco-2細(xì)胞模型中NK的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程，進(jìn)而探討NK獨(dú)特的跨小腸粘膜吸收機(jī)制。研究已證實(shí)，NK不以經(jīng)典胞吞方式跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，課題組后續(xù)研究將著重篩選及證實(shí)候選NK分子中PTD 是否具有跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)特性及其攜帶大分子蛋白進(jìn)入細(xì)胞的能力，并明確NK 的PTD 定位及其穿膜機(jī)制，獲得來(lái)自NK的CPP。

迄今為止，有關(guān)CPP成功應(yīng)用于肽類口服藥物載體改造的報(bào)道還不多，主要原因在于目前所發(fā)現(xiàn)的天然CPP種類和數(shù)量還很少，限制了它的選擇和應(yīng)用。追溯天然CPP的研發(fā)歷程，不難發(fā)現(xiàn)，CPP大多是從具有跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)功能的天然蛋白質(zhì)的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域PTD中鑒定出來(lái)的，如Tat和VP22等[8]。因此，闡明具有轉(zhuǎn)導(dǎo)特性的天然蛋白NK的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)特性，篩選和鑒定介導(dǎo)蛋白跨膜運(yùn)輸?shù)腜TD就成為獲得新型穿膜肽的有效手段，為研發(fā)以穿膜肽為基礎(chǔ)的高性能藥物運(yùn)輸新載體奠定基礎(chǔ)。

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A Study on the Detection System and Transmembrane Transport Mechanism of Nattokinase

Li Minhui1, Chen Yu2, Jiang Yuliang2, Li Yan2, Yu Yun3, Mao Mingxing2, Lin Dingbiao2, Yang Yaqiong3, Yang Ping3△.

1. Center for Scientific Research, Chengdu Medical College, Chengdu 610083, China; 2. School of Biomedical Sciences, Chengdu Medical College, Chengdu 610083, China;3. School of Basic Medical Sciences, Chengdu Medical College, Chengdu 610083, China

Objective To establish the detection system of nattokinase (NK) and explore its transmembrane transport mechanism. Methods The anti-NK monoclonal antibodies were screened by hybridoma technology. The monoclonal antibody epitopes were identified by competitive inhibition assay. The monoclonal specificity was tested by Western Blot. The monoclonal antibody sensitivities were evaluated by the Sandwich ELISA method. The transmembrane segments of NK were revealed by bioinformatics. Results Six hybridoma cell lines with stable secrete and anti-NK antibodies were obtained, among which three monoclonal antibodies recognize similar antigen epitopes and the others recognize the different antigen epitopes. The minimum detection sensitivity of NK ranged from 0.78 ng/mL to 20.00 ng/mL. Caco-2 cell model results indicated that endocytosis was not the main way of NK transmembrane transport. Bioinformatics showed that NK contained three transmembrane segments. Conclusion The ELISA system for NK based on the monoclonal antibodies could monitor the transmembrane transport process of NK effectively and NK may cause its intestinal absorption with the mediation of the protein transduction domain.

Nattokinase; Monoclonal antibodies; Transmembrane transport; Protein transduction domain

http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1705.R.20160613.1051.012.html

10.3969/j.issn.1674-2257.2016.05.003

四川省教育廳項(xiàng)目(No：13ZB0220)；四川省科技廳項(xiàng)目(No：2015JY0205)；四川省衛(wèi)生廳項(xiàng)目(No：130302,130298) ；成都醫(yī)學(xué)院科研基金(No：CYZ11-005)；國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新項(xiàng)目(No：201313705007，201313705003，201413705005)

R977.3

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△通信作者：楊平，E-mail：920192655@qq.com