張楊梅，李海濤，王聰敏，?！≠R，敖俊紅，楊蓉婭

阿薩希毛孢子菌抗氧化酶活性研究

張楊梅，李海濤，王聰敏，祝賀，敖俊紅，楊蓉婭

張楊梅

目的觀察和測定44株不同來源阿薩希毛孢子菌（Trichosporon asahii，T.asahii）抗氧化酶活性。方法收集44株不同來源T.asahii，將其分為環(huán)境組（3株）、臨床組（9株）、體內(nèi)傳代組（20株）和體外耐藥組（12株），分別用羥胺法和可見光法測定其抗氧化酶超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和過氧化氫酶（catalase，CAT）活性，并進(jìn)行比較和分析。結(jié)果環(huán)境組：SOD酶活性均值為（4.01±0.66）U/mgprot，CAT酶活性均值為（48.51±7.60）U/mgprot；臨床組：SOD酶活性均值為（10.45±3.87）U/mgprot，CAT酶活性均值為（110.56±35.77）U/mgprot；體內(nèi)傳代組：至傳代第5代，菌株SOD酶活性均值為（8.65±4.15）U/mgprot，CAT酶活性均值為（71.36±12.19）U/mgprot；耐藥組：至誘導(dǎo)末期第10代菌株SOD酶活性均值為（8.02±1.56）U/mgprot，CAT酶活性均值為（80.43±8.92）U/mgprot。結(jié)論T.asahii具有較強(qiáng)的抗氧化能力。不同來源T.asahii抗氧化能力不同，主要體現(xiàn)在抗氧化酶活性的不同。其中，臨床組菌株抗氧化能力最強(qiáng)，體內(nèi)傳代組菌株和體外耐藥組菌株次之，環(huán)境組菌株最低。

阿薩希毛孢子菌；超氧化物歧化酶；過氧化氫酶

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和過氧化氫酶（catalase，CAT）是保護(hù)真菌免受活性氧遞質(zhì)（reactive oxygen species，ROS）氧化殺傷的兩種最主要的抗氧化酶，近年來主要作為致病真菌的毒力因子而備受關(guān)注，這在白念珠菌[1,2]、煙曲霉[3,4]、新型隱球菌[5,6]等常見致病真菌的研究中均有報道。然而，阿薩希毛孢子菌（Trichosporon asahii，T.asahii）抗氧化酶的研究尚未見報道，因此，本課題收集筆者所在實驗室現(xiàn)有的44株不同來源的T.asahii，測定其SOD和CAT酶活性并進(jìn)行比較和分析，初步探索T.asahii抗氧化酶在其感染宿主以及致病過程中的作用。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗菌株共44株T.asahii，根據(jù)其不同來源分為環(huán)境組、臨床組、體內(nèi)傳代組、體外耐藥組。

環(huán)境組： 3株環(huán)境分離株。CBS8904、CBS7137、CBS8520均購自荷蘭真菌生物多樣性中心（CBS）。

臨床組： 9株臨床分離株。其中1株標(biāo)準(zhǔn)株（CBS2479）購自CBS；6株（BZP07001、BZP 07002、BZP 07003、BZP 07004、BZP 09001、BZP 09002）分別由華中科技大學(xué)、河北醫(yī)科大學(xué)、解放軍307醫(yī)院、北京大學(xué)第一醫(yī)院惠贈；2株（BZP07005、BZP07005R）為我科臨床分離株。

體內(nèi)傳代組：20株小鼠體內(nèi)傳代菌株。將1株臨床標(biāo)準(zhǔn)株CBS2479和3株環(huán)境分離株CBS8904、CBS7137、CBS8520分別于小鼠體內(nèi)依次傳代1～5代，由小鼠腎臟組織分離培養(yǎng)[7]，分別對應(yīng)編號：CBS2479 P1-5、CBS8904 P1-5、CBS7137 P1-5、CBS8520 P1-5。

體外耐藥組：12株菌。其中，氟康唑高耐藥誘導(dǎo)及回復(fù)菌株各6株（分別將1株臨床標(biāo)準(zhǔn)株CBS2479和1株環(huán)境分離株CBS8904在氟康唑濃度逐漸梯級倍增的PDA培養(yǎng)基中分別轉(zhuǎn)種傳代，獲得耐藥菌株；將耐藥菌株在不含氟康唑的PDA培養(yǎng)基上連續(xù)傳代，獲得回復(fù)菌株[8]）。前期研究[8]表明T.asahii氟康唑耐誘導(dǎo)第6代后，其耐藥性逐漸升高，因此，分別選擇誘導(dǎo)及回復(fù)中期、末期菌株各6株，對應(yīng)編號：CBS2479 F6、F9、F10、R7、R8、R9，CBS8904 F6、F9、F10、R7、R8、R9（其中，F(xiàn)6為誘導(dǎo)中期菌株，F(xiàn)9、F10為誘導(dǎo)末期菌株；R7為回復(fù)中期菌株，R8、R9為回復(fù)末期菌株）。

上述菌株經(jīng)API 20C AUX生物鑒定及ITS序列分析驗證（AS2.2174）。

質(zhì)控株1株：標(biāo)準(zhǔn)菌株近平滑念珠菌ATCC 22019，由北京大學(xué)第一醫(yī)院真菌研究中心惠贈。

1.1.2主要試劑 總SOD測試盒、CAT測定試劑盒及總蛋白定量測定試劑盒，均購自南京建成生物工程研究所。直徑425～600 μm玻璃微珠，購自美國Sigma公司。

1.2方法

1.2.1將-80℃保存的T.asahii菌種復(fù)蘇，取新鮮單菌落接種于PDA培養(yǎng)基上，35℃生長48 h。用0.9%無菌生理鹽水配置濃度為1.5×108cfu/ml的T.asahii菌懸液。取1 ml菌懸液添加到50 ml含有4%葡萄糖和1%真菌蛋白胨的SDB液體培養(yǎng)基中，在搖床上震蕩培養(yǎng)（37℃，150 r/min，48 h）。離心機(jī)分離（20℃，3 500 r/min）后，棄上清液，取下層細(xì)胞沉淀，無菌水沖洗3次，用于細(xì)胞裂解。

1.2.2細(xì)胞裂解用玻璃珠溶解法溶解上述細(xì)胞。將細(xì)胞在含有0.5 g直徑425～600 μm玻璃微珠的裂解緩沖液（磷酸鉀50 mmol/L，pH7.0）中重懸?；鞈乙涸贔astprep 核酸提取儀中以4.0 m/s 的速度強(qiáng)振蕩6次，每次40 s，冰上冷卻。離心機(jī)分離（4℃，16 000 r/min，10 min），棄去細(xì)胞碎片和玻璃微珠。上清液用于酶活性的分析。

1.2.3酶活性測定用總SOD測試盒和CAT測定試劑盒分別測定SOD和CAT酶活性，具體操作方法按照說明書執(zhí)行。重復(fù)3遍。 BCA法測定蛋白質(zhì)濃度：用標(biāo)準(zhǔn)血清蛋白作對照。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法

SPSS 13. 0統(tǒng)計軟件分析。采用單樣本K-S方法對各組數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性分析，用兩獨(dú)立樣本t檢驗、配對兩樣本t檢驗進(jìn)行兩個樣本均數(shù)的比較。

2　結(jié)果

2.1環(huán)境組與臨床組抗氧化酶活性結(jié)果

質(zhì)控株近平滑念珠菌ATCC22019 SOD酶活性為41.289 U/mgprot，CAT酶活性為4.208 U/mgprot。T.asahii環(huán)境組：環(huán)境分離株CBS8904、CBS7137、CBS8520的SOD酶活性分別為3.828、3.46、4.75 U/mgprot，均值為（4.01±0.66）U/mgprot，CAT酶活性分別為45.833、42.61、57.082 U/mgprot，均值為（48.51±7.60）U/mgprot。T.asahii臨床組：不同臨床分離來源菌株抗氧化酶活性不同，SOD酶活性變化范圍為6.221～16.826 U/mgprot，均值為（10.45±3.87）U/mgprot；CAT酶活性變化范圍為61.956～164.552 U/mgprot，均值為（110.56±35.77）U/mgprot，詳見表1。

表1　T.asahii 環(huán)境株與臨床株抗氧化酶活性

2.2體內(nèi)傳代組抗氧化酶活性結(jié)果

小鼠體內(nèi)傳代第1～5代后，4株菌株抗氧化酶活性逐漸升高（P＜0.05）（圖1a-1d）。臨床標(biāo)準(zhǔn)株CBS2479 SOD酶活性依次是傳代前的0.98、1.16、1.63、1.70、2.35倍，CAT酶活性依次是傳代前的1.18、1.24、1.25、1.23、1.44倍；其余3株環(huán)境分離株CBS8904、CBS7137、CBS8520至傳代第5代，SOD酶活性分別是傳代前的2.05、1.45、1.5倍，CAT酶活性分別是傳代前的1.34、1.55、1.21倍，其中，CBS8904 SOD酶活性升高幅度最大，約105%，而CBS7137 CAT酶活性升高幅度最大，約55%。 詳見表2。

表2　T.asahii小鼠體內(nèi)傳代株抗氧化酶活性

圖1　不同菌株SOD與CAT酶活性的變化趨勢比較

表3　T.asahii氟康唑耐藥株誘導(dǎo)及回復(fù)菌株SOD和CAT活性

2.3耐藥組抗氧化酶活性結(jié)果

體外氟康唑耐藥誘導(dǎo)后，T.asahii 菌株抗氧化酶活性隨誘導(dǎo)代數(shù)的遞增而逐漸升高（P＜0.05）（圖1e,1f）。臨床標(biāo)準(zhǔn)株CBS2479誘導(dǎo)第6、9、10代SOD酶活性分別是誘導(dǎo)前的1.40、1.44、1.47倍，CAT酶活性分別是誘導(dǎo)前的1.32、1.36、1.40倍，至誘導(dǎo)末期第10代SOD、CAT酶活性分別比誘導(dǎo)前升高了47%、40%；與臨床標(biāo)準(zhǔn)株類似，至誘導(dǎo)末期第10代環(huán)境分離株CBS8904 SOD和CAT酶活性也分別較前升高了81%和62%。而在回復(fù)末期，菌株CBS2479和CBS8904 抗氧化酶SOD和CAT酶活性逐漸恢復(fù)至正常水平，詳見表3。

3　討論

病原微生物侵入機(jī)體后，面臨的第一道防線是機(jī)體吞噬細(xì)胞的氧化殺傷。吞噬細(xì)胞吞噬病原微生物后可產(chǎn)生ROS起到殺傷作用，主要通過破壞核酸、氧化蛋白質(zhì)以及脂質(zhì)過氧化進(jìn)而破壞多種細(xì)胞功能[9,10]。為了生存，病原微生物也進(jìn)化了一系列抗氧化防御和修復(fù)系統(tǒng)來應(yīng)對機(jī)體的氧化殺傷。其中，抗氧化防御酶系統(tǒng)主要包括SOD、CAT、谷胱甘肽系統(tǒng)等[11]，這些物質(zhì)在中和或消除氧化損傷中起重要作用。在白念珠菌、煙曲霉、新型隱球菌等常見致病真菌的研究中，證實抗氧化酶SOD和CAT在保護(hù)真菌免受ROS氧化殺傷中起重要保護(hù)作用，此外，SOD或CAT酶抑制或缺失的菌株可表現(xiàn)出毒力的迅速減弱[1-6]。近年來，由于T.asahii引起的播散性毛孢子菌病的發(fā)病率呈明顯上升趨勢，占深部真菌感染患者的5%～10%[12]，且T.asahii對絕大多數(shù)抗真菌藥均耐藥，一旦該菌在機(jī)體造成播散性、系統(tǒng)性感染，病死率可高達(dá)80%以上[13]，使得該菌的感染機(jī)制與致病機(jī)制越來越受到人們的關(guān)注。在前期的研究中，宗麗娜等[14]發(fā)現(xiàn)了T.asahii可對3種不同的氧化劑（甲萘醌、H2O2、二酰胺）產(chǎn)生不同程度的抵抗作用，其中，對H2O2的抵抗作用最強(qiáng)，二酰胺次之，甲萘醌最小?；谏鲜鲅芯浚P者推測：與其他真菌病原體一樣[1,6]，T.asahii也擁有相應(yīng)的抗氧化防御系統(tǒng)；并且T.asahii能夠入侵宿主體內(nèi)，并造成嚴(yán)重感染與其抵抗或逃避宿主免疫系統(tǒng)攻擊的能力（尤其是抗氧化防御能力）存在一定聯(lián)系。為了驗證這一假設(shè)，筆者收集不同來源T.asahii菌株，測定其SOD和CAT抗氧化酶活性，初步探索其抗氧化防御機(jī)制，為進(jìn)一步研究該菌的感染機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

本研究通過測定環(huán)境組和臨床組T.asahii的抗氧化酶活性發(fā)現(xiàn)：臨床組菌株抗氧化酶活性均顯著高于環(huán)境組（P＜0.01）（圖1a，1b）。其中，臨床組SOD酶活性為（10.45±3.87）U/mgprot，CAT酶活性為（110.56±35.77）U/mgprot，環(huán)境組SOD酶活性為（4.01±0.66）U/mgprot，CAT酶活性為（48.51 ±7.60）U/mgprot，前者SOD酶活性是后者的2～5倍；前者CAT酶活性約是后者的1.5～4倍，且不同臨床分離來源菌株抗氧化酶活性也存在一定差異。由于菌株抗氧化能力的不同，主要體現(xiàn)在抗氧化酶活性的不同，筆者認(rèn)為T.asahii臨床組抗氧化能力高于環(huán)境組。結(jié)合已往研究，筆者發(fā)現(xiàn)：T.asahii 臨床組菌株抗氧化酶SOD酶活性[（10.45±3.87）U/mgprot與隱球菌（12±0.5）U/mgprot][15]相當(dāng)，低于杜氏念珠菌（27.87 ±20.82）U/mgprot（從巴西某大學(xué)附屬醫(yī)院口腔念珠菌病人體上分離出杜氏念珠菌Cd1、Cd2、Cd3、Cd4、Cd5、Cd7、Cd9、Cd11和Cd13 SOD酶活性的均值）[16]，明顯低于白念珠菌（151.83±73.27）U/mgprot（從巴西某大學(xué)附屬醫(yī)院口腔念珠菌病人體上分離出的白念珠菌Ca10、Ca81、Ca119、Ca170和CaATCC44373 SOD酶活性的均值）[16]；T.asahii 臨床組菌株抗氧化酶CAT酶活性[（48.51±7.60）U/mgprot]顯著高于煙曲霉[（1.75±0.75）U/mgprot、土曲霉（3.5±0.8）U/mgprot][17]，因此，推測不同種屬真菌的抗氧化能力不同。

本研究結(jié)果顯示，小鼠體內(nèi)傳代后，T.asahii菌株CBS2479、CBS8904、CBS7137和CBS8520抗氧化酶活性逐漸升高。傳代前T.asahii菌株SOD酶活性為（4.56±1.23）U/mgprot，CAT酶活性為（51.87 ±9.15）U/mgprot；至傳代第5代，菌株SOD酶活性增至（8.65±4.15）U/mgprot，CAT酶活性增至（71.36±12.19）U/mgprot，分別比傳代前升高了90%、34%，且其CAT酶活性高于環(huán)境組（P＜0.05）。提示T.asahii侵入機(jī)體后，通過與機(jī)體免疫系統(tǒng)相互作用，激發(fā)或誘導(dǎo)了其抗氧化機(jī)制，最終使得抗氧化酶活性有不同程度的升高，其抗氧化能力也隨之升高。既往研究發(fā)現(xiàn)，SOD、CAT酶在中和或阻斷巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞釋放ROS引起的氧化殺傷中起重要作用[1,3,6]；此外，在煙曲霉的研究中，Diamond等[18]證實CAT酶還可抑制中性粒細(xì)胞髓過氧化物酶系統(tǒng)對菌絲的損傷。因此，推測T.asahii抗氧化酶在保護(hù)菌株免受宿主免疫系統(tǒng)氧化殺傷中起一定作用，甚至可以協(xié)助菌株逃避宿主免疫系統(tǒng)的攻擊，進(jìn)一步促進(jìn)感染的形成。此外，本組研究數(shù)據(jù)還顯示臨床株SOD酶活性隨傳代數(shù)增加而增加，而CAT酶活性并未隨傳代數(shù)增加有明顯變化。由于病原微生物侵入機(jī)體后面臨吞噬細(xì)胞的氧化殺傷，主要表現(xiàn)在吞噬細(xì)胞質(zhì)膜上的NADPH氧化酶(Nox)被迅速激活，首先與O2相互作用產(chǎn)生大量O2-，進(jìn)而產(chǎn)生其他ROS如H2O2、羥自由基等，在吞噬小體中共同殺傷微生物[9]。因此，筆者推測傳代菌株SOD酶活性升高較CAT酶活性明顯與上述氧化應(yīng)激反應(yīng)過程密切相關(guān)，然而這方面還有待進(jìn)一步研究。

本研究結(jié)果也顯示，T.asahii經(jīng)氟康唑耐藥誘導(dǎo)后，臨床標(biāo)準(zhǔn)株CBS2479和環(huán)境株CBS8904抗氧化酶活性均升高（P＜0.05）。誘導(dǎo)前菌株SOD酶活性為（5.02±1.69）U/mgprot，CAT酶活性為（53.89 ±11.40）U/mgprot；至誘導(dǎo)末期第10代菌株SOD酶活性升高至（8.02±1.56）U/mgprot，CAT酶活性為（80.43±8.92 ）U/mgprot，分別比誘導(dǎo)前升高了60%、49%，且其SOD和CAT酶活性均高于環(huán)境組（P＜0.05）；回復(fù)期，兩組菌株抗氧化酶活性逐漸恢復(fù)至正常水平，至回復(fù)末期菌株SOD酶活性為（3.53 ±0.84）U/mgprot，CAT酶活性為（47.15±25.88）U/mgprot。提示氟康唑也可激活或誘導(dǎo)抗氧化酶活性，使得菌株抗氧化能力進(jìn)一步升高；由于氟康唑暴露去除后，菌株SOD、CAT 酶活性可降至正常水平，說明T.asahii SOD和CAT 酶活性的誘導(dǎo)具有可調(diào)節(jié)性，這與Linares等[16]的研究結(jié)果相一致。Christopher等[19]還通過對白念珠菌暴露于唑類、多烯類、棘白霉素類抗真菌藥時蛋白質(zhì)組學(xué)的研究進(jìn)一步證明，在酮康唑、兩性霉素B、卡泊芬凈3種藥物作用下均可見參與抗氧化機(jī)制的蛋白質(zhì)表達(dá)增高。Blum 等[17]認(rèn)為與煙曲霉相比，土曲霉對兩性霉素B固有耐藥與其較高的過氧化氫酶活性密切相關(guān)，而與麥角固醇含量、細(xì)胞壁成分、脂質(zhì)過氧化水平無明顯相關(guān)性。因此，我們推測氟康唑藥物在殺傷T.asahii過程中，伴隨一定程度的氧化殺傷作用，同時T.asahii抗氧化酶活性的激活或誘導(dǎo)使得其抗氧化能力提高可能是抗真菌藥物氟康唑耐藥機(jī)制之一，這方面還有待深入研究。

T.asahii SOD與CAT兩種酶活性在宿主因素和氟康唑作用下呈協(xié)同性增高，即SOD酶活性升高的同時，CAT酶活性也表現(xiàn)出相同的升高趨勢。由于SOD催化O2-生成H2O2和O2，CAT可催化H2O2生成H2O和O2，筆者認(rèn)為上述協(xié)同作用與SOD的產(chǎn)物是CAT的底物有關(guān)，這與Linares等[16]的研究結(jié)果相一致。

總之，本研究通過測定44株不同來源T.asahii的抗氧化酶活性發(fā)現(xiàn)，與其他大多數(shù)真菌病原微生物一樣[1-6]，T.asahii也擁有較強(qiáng)的抗氧化機(jī)制；不同來源T.asahii抗氧化能力不同，主要體現(xiàn)在抗氧化酶活性的不同。其中，臨床株SOD和CAT酶活性顯著高于環(huán)境株；體內(nèi)傳代第5代菌株SOD和CAT酶活性顯著高于傳代前，且其CAT酶活性明顯高于環(huán)境株；耐藥誘導(dǎo)末期第10代耐藥株SOD和CAT酶活性均高于誘導(dǎo)前，且其SOD和CAT酶活性顯著高于環(huán)境株。此外，宿主因素與氟康唑藥物暴露均可激活或誘導(dǎo)T.asahii 兩種抗氧化酶活性的升高，說明T.asahii抗氧化機(jī)制與其感染機(jī)制以及耐藥機(jī)制之間存在一定的聯(lián)系，這將是今后的研究方向。

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（本文編輯祝賀）

Study on antioxidant enzymatic activities of Trichosporon asahii

ZHANG Yang-mei，LI Hai-tao，WANG Cong-min，et al
Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, China

ObjectiveTo observe and determinate the antioxidant enzymatic activity of 44 Trichosporon asahii (T.asahii) strains from different sources. MethodsTotal 44 T.asahii strains collected from different sources were divided into four groups: environment group (3 strains), clinical group (9 strains), internal passage group (20 strains), fluconazole-resistant group (12 strains), the superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT) activities were compared and analyzed by hydroxylamine method and visible light method, respectively. Results Environment group: SOD activity mean value was (4.01±0.66)U/mgprot, CAT activity mean value was (48.51±7.60)U/mgprot. Clinical group: SOD activity mean value was (10.45±3.87)U/mgprot, CAT activity mean value was (110.56±35.77)U/mgprot. Internal passage group: after the fifth passage, SOD activity mean value was (8.65±4.15) U/mgprot, CAT activity mean value was (71.36±12.19)U/mgprot. Fluconazole-resistant group: after the tenth resistant induce, SOD activity mean value was (8.02±1.56)U/mgprot, CAT activity mean value was (80.43±8.92)U/mgprot. ConclusionT.asahii has strong antioxidant ability. T.asahii strains from different sources have different antioxidant abilities, which mainly manifested in the difference of antioxidant enzymatic activity. Clinical group strains has the strongest antioxidant capacity, internal passage group strains and fluconazole-resistant group are the second, and the environmental group strains is the lowest.

Trichosporon asahii；Superoxide dismutase；Catalase [J Pract Dermatol, 2016, 9(2):84-88]

R379

A

1674-1293(2016)02-0084-05

10.11786/sypfbxzz.1674-1293.20160202

國家自然科學(xué)基金（81472892）；國家自然科學(xué)基金?青年科學(xué)基金（81202136）；全軍醫(yī)學(xué)科技青年培育基金（14QNP010）

030001 太原，山西醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院（張楊梅）；北京軍區(qū)總醫(yī)院全軍皮膚損傷修復(fù)研究所（張楊梅，李海濤，王聰敏，祝賀，敖俊紅，楊蓉婭）

張楊梅，在讀碩士研究生，住院醫(yī)師，研究方向：真菌感染性皮膚病，E-mail: zhangyangmei1990@sina.com

楊蓉婭，E-mail: yangrya@sina.cn

（2015-11-30

2016-01-28）