包怡紅，郭 陽

（東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040）

響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化超聲波輔助水酶法提取松籽油工藝及其氧化穩(wěn)定性

包怡紅，郭 陽

（東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040）

以紅松松籽為原料，經(jīng)超聲波預(yù)處理后，利用水酶法提取松籽油，通過單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面試驗(yàn)研究松籽油提取工藝，并對(duì)其氧化穩(wěn)定性進(jìn)行分析。結(jié)果表明，松籽油提取的優(yōu)化工藝條件為超聲強(qiáng)度0.28 W/cm2、超聲時(shí)間40 min、超聲溫度50 ℃、料液比1∶5（g/mL）、堿性蛋白酶加酶量1 427 U/g、酶解時(shí)間4.08 h、酶解溫度44 ℃，在此條件下松籽油得率可以達(dá)到73.01%。溫度、光照對(duì)松籽油氧化有顯著促進(jìn)作用，3 ℃以下避光貯藏松籽油可使其有良好的氧化穩(wěn)定性。

超聲波；水酶法；響應(yīng)面；松籽油

紅松（Pinus koraiensis Sivb. ct Zucc），松科、松屬植物，主要分布在我國(guó)東北長(zhǎng)白山以及小興安嶺地區(qū)，紅松籽是紅松成熟種子去皮后得到的種仁[1]。紅松籽含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分，含油脂60%～69%、蛋白質(zhì)13%～20%，還有多種維生素及生理活性物質(zhì)等[2]。松籽油中含不飽和脂肪酸高達(dá)93.2%，包括亞麻酸、亞油酸、二十碳五烯酸、花生四烯酸及一種獨(dú)特的脂肪酸-皮諾斂酸，對(duì)于便秘、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的治療有一定療效，同時(shí)具有降低血脂、抑制食欲的功效，近一步達(dá)到減肥效果[3-4]。松籽油含有的總酚與VE使其具有較強(qiáng)的抗氧化能力，此外還含有角鯊烯、芝麻素、谷甾醇、蝦青素等甾醇類物質(zhì)，具有優(yōu)良的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[5-6]。松籽油的風(fēng)味獨(dú)特，可直接作為食用油來源，國(guó)外已將松籽油作為開發(fā)保健食品以及保健飲料等功能性食品的原料[7]。

目前常見的松籽油提取方法有壓榨法、有機(jī)溶劑浸提法、超臨界CO2萃取法、水酶法等。與其他提取方法

相比，水酶法的作用條件溫和，操作安全，能耗低，不使用有機(jī)試劑，更加環(huán)保、經(jīng)濟(jì)，所提取出的油脂品質(zhì)高，具有松籽的清香味[8]。水酶法是油料在機(jī)械破碎后，采用對(duì)植物細(xì)胞壁或者脂蛋白、脂多糖等復(fù)合體有水解作用的酶對(duì)油料進(jìn)行酶解，使油脂易于從油料釋放，利用非油成分對(duì)油和水的親和力差異、油水密度差異將油分離[9]。已有花生、玉米胚芽、米糠、大豆等油料水酶法提油的報(bào)道[10-11]。超聲波在液體中產(chǎn)生的空化作用可以在一定程度上使油料細(xì)胞壁遭到破壞，細(xì)胞壁內(nèi)的物質(zhì)得到釋放，從而提高提取率[12-14]。本實(shí)驗(yàn)采用超聲波輔助水酶法提取松籽油，利用響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化其工藝參數(shù)，旨在獲得一種品質(zhì)好、得率高的松籽油提取條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅松籽 黑龍江省伊春市林業(yè)局。

木瓜蛋白酶（活力0.87×105U/g）、中性蛋白酶（活力1.35×105U/g）、堿性蛋白酶（活力1.4×105U/g）、胃蛋白酶（活力3 000 U/g）、纖維素酶（活力30 000 U/g）北京博奧拓達(dá)科技有限公司；果膠酶（活力1.0×106U/g）、高溫淀粉酶（活力4000 U/g） 上海源葉生物科技有限公司；2-硫代巴比妥酸、正丁醇、冰乙酸、異辛烷、硫代硫酸鈉、氫氧化鈉、鹽酸（均為分析純） 天津東麗試劑公司。

1.2 儀器與設(shè)備

KQ-600GVDV超聲波清洗儀 昆山市超聲儀器有限公司；FW100型高速萬能粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司；DK-8D電熱恒溫水浴槽、DHG-9240電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、TDL-40B-W型離心機(jī) 上海標(biāo)儀儀器有限公司；磁力攪拌器 上海精科儀器公司；pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 原料基本成分的測(cè)定

水分含量的測(cè)定：參考GB 5009.3—2010《食品中水分的測(cè)定》；粗脂肪含量的測(cè)定：參考GB/T 14772—2008《食品中粗脂肪的測(cè)定》；蛋白質(zhì)含量的測(cè)定：參考GB 5009.5—2010《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》；灰分含量的測(cè)定：參考GB 5009.5—2010《食品中灰分的測(cè)定》。

1.3.2 松籽油提取工藝

1.3.2.1 工藝流程

1.3.2.2 操作要點(diǎn)

將松籽置于70 ℃鼓風(fēng)干燥箱中，干燥4 h后破碎過18 目篩。取10 g破碎松籽按一定料液比加入蒸餾水，混合均勻后置于超聲波清洗儀中超聲處理。經(jīng)一定的超聲條件處理后，調(diào)節(jié)混合物至最適pH值和溫度，添加酶，酶解一段時(shí)間后，升溫至100 ℃滅酶8 min，8000 r/min離心30 min[15]，小心吸取上層清油Ⅰ，將乳狀液二次離心，分離上層清油Ⅱ，將二次離心后得到乳狀液置于-20 ℃冷凍24 h，油相結(jié)晶可以刺入水相，從而大幅度降低乳狀液穩(wěn)定性，達(dá)到破乳的目的[16]。解凍分離上層清油Ⅲ，合并三部分清油，低溫烘干至質(zhì)量恒定，計(jì)算松籽油得率。

1.3.2.3 松籽油得率的計(jì)算

式中：A為總游離油質(zhì)量/g；B為松籽質(zhì)量/g；m為松籽含油量/%。

1.3.3 酶種類對(duì)松籽油得率的影響

以1∶5的料液比加入蒸餾水，分別在各種酶最適pH值、最適溫度條件下，加酶量均為1 500 U/g，酶解時(shí)間3 h。按1.3.2.2節(jié)操作，計(jì)算得率。分別考察纖維素酶、高溫淀粉酶、果膠酶以及胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶對(duì)松籽油得率的影響。

1.3.4 超聲預(yù)處理?xiàng)l件對(duì)松籽油得率的影響

1.3.4.1 超聲強(qiáng)度對(duì)松籽油得率的影響

取一定量已破碎松籽，以1∶5的料液比加入蒸餾水，超聲時(shí)間30 min，超聲溫度50 ℃，經(jīng)超聲強(qiáng)度分別為0.07、0.14、0.21、0.28、0.35 W/cm2的條件超聲預(yù)處理；調(diào)節(jié)pH 10.5，堿性蛋白酶加酶量為1500 U/g，40 ℃條件下酶解3 h，提取清油，稱量并計(jì)算松籽油得率。

1.3.4.2 超聲時(shí)間對(duì)松籽油得率的影響

取一定量已破碎松籽，以1∶5的料液比加入蒸餾水，超聲強(qiáng)度0.28 W/cm2，超聲溫度50 ℃，經(jīng)超聲時(shí)間分別為10、20、30、40、50 min的條件預(yù)處理；調(diào)節(jié)pH 10.5，堿性蛋白酶加酶量為1 500 U/g，40 ℃條件下酶解3 h，提取清油，稱量并計(jì)算松籽油得率。

1.3.4.3 超聲溫度對(duì)松籽油得率的影響

取一定量已破碎松籽，以1∶5的料液比加入蒸餾水，超聲強(qiáng)度0.28 W/cm2，超聲時(shí)間40 min，經(jīng)超聲溫度分別為40、45、50、55、60 ℃的條件預(yù)處理；調(diào)節(jié)pH 10.5，堿性蛋白酶加酶量為1 500 U/g，40 ℃條件下酶解3 h，提取清油，稱量并計(jì)算松籽油得率。

1.3.5 酶解條件對(duì)松籽油得率的影響

1.3.5.1 料液比對(duì)松籽油得率的影響

取一定量已破碎松籽，分別以1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7的料液比加入蒸餾水，經(jīng)超聲強(qiáng)度0.28 W/cm2、超聲時(shí)間40 min、超聲溫度50 ℃的條件預(yù)處理；調(diào)節(jié)pH 10.5，堿性蛋白酶加酶量為1 500 U/g，40 ℃條件下酶解3 h，提取清油，稱量并計(jì)算松籽油得率。

1.3.5.2 加酶量對(duì)松籽油得率的影響

取一定量已破碎松籽，以1∶5的料液比加入蒸餾水，經(jīng)超聲強(qiáng)度0.28 W/cm2、超聲時(shí)間40 min、超聲溫度50 ℃條件預(yù)處理；調(diào)節(jié)pH10.5，堿性蛋白酶加酶量分別為500、1 000、1 500、2 000、2 500 U/g，40 ℃條件下酶解3 h，提取清油，稱量并計(jì)算松籽油得率。

1.3.5.3 酶解時(shí)間對(duì)松籽油得率的影響

取一定量已破碎松籽，以1∶5的料液比加入蒸餾水，經(jīng)超聲強(qiáng)度0.28 W/cm2、超聲時(shí)間40 min、超聲溫度50 ℃條件預(yù)處理；調(diào)節(jié)pH 10.5，堿性蛋白酶加酶量為1 500 U/g，40 ℃條件下分別酶解1、2、3、4、5 h，提取清油，稱量并計(jì)算松籽油得率。

1.3.5.4 酶解溫度對(duì)松籽油得率的影響

取一定量已破碎松籽，以1∶5的料液比加入蒸餾水，經(jīng)超聲強(qiáng)度0.28 W/cm2、超聲時(shí)間40 min、超聲溫度50 ℃條件預(yù)處理；調(diào)節(jié)pH 10.5，堿性蛋白酶加酶量為1 500 U/g，分別在30、35、40、45、50 ℃條件下酶解4 h，提取清油，稱量并計(jì)算松籽油得率。

1.3.6 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化松籽油提取工藝條件

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選擇料液比、加酶量、酶解時(shí)間、酶解溫度4 個(gè)因素，設(shè)計(jì)四因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，試驗(yàn)因素和水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table1 Factors and levels used for response surface methodology

1.3.7 松籽油氧化穩(wěn)定性分析

1.3.7.1 溫度對(duì)松籽油氧化穩(wěn)定性影響

分別取20 g松籽油置于具塞比色管中，置于-20、 3、15、25、35 ℃環(huán)境中，每隔2 d測(cè)定其過氧化值（peroxide，POV）及硫代巴比妥酸（2-thiobarbituric acid，TBA）值。研究溫度對(duì)松籽油氧化穩(wěn)定性的影響。

1.3.7.2 光照對(duì)松籽油氧化穩(wěn)定性影響

分別取20 g松籽油置于具塞比色管中，置于室溫避光（遮光紙遮擋）與室溫自然光環(huán)境中，每隔2d測(cè)定其POV及TBA值。研究光照條件對(duì)松籽油氧化穩(wěn)定性的影響。

1.3.8 松籽油指標(biāo)測(cè)定

酸值測(cè)定：參考GB/T 5530—2005《動(dòng)物油脂酸值和酸度的測(cè)定》；碘值測(cè)定：參考GB/T 5532—2008《動(dòng)植物油脂：碘值的測(cè)定》；POV值測(cè)定：參考GB/T 5538—2005《動(dòng)植物油脂：過氧化值的測(cè)定》；TBA值測(cè)定：參照Mohammadi等[17]的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 松籽主要成分

經(jīng)測(cè)定，本實(shí)驗(yàn)所用松籽由含量高達(dá)（68.06±0.23）%的脂肪、（16.12±0.12）%的蛋白質(zhì)、（4.40±0.14）%的水分及（2.62±0.25）%的灰分組成，說明松籽是適合制取油脂的植物油料。

2.2 酶種類對(duì)水酶法提取松籽油得率的影響

圖1 酶種類對(duì)松籽油得率的影響Fig.1 Effects of enzyme type on the yield of pine nut oil

由圖1可知，在加酶量相同的條件下，松籽油得率最高的為堿性蛋白酶，這是由于松籽中蛋白質(zhì)被堿性蛋白酶水解成肽或者氨基酸，并且其中與蛋白相關(guān)的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)以及子葉細(xì)胞中包裹在油脂外的蛋白膜在堿性蛋白酶作用下，結(jié)構(gòu)崩壞，釋放出游離油脂，實(shí)現(xiàn)油水分離[18-19]。因此，在后續(xù)試驗(yàn)中選擇堿性蛋白酶為試驗(yàn)用酶。

2.3 超聲預(yù)處理對(duì)松籽油得率的影響

2.3.1 超聲強(qiáng)度對(duì)松籽油得率的影響

由圖2可知，隨著超聲強(qiáng)度的增大，松籽油得率上升趨勢(shì)顯著，當(dāng)超聲強(qiáng)度為0.28 W/cm2時(shí)松籽油得率達(dá)到最大69.09%，這是由于超聲波產(chǎn)生的機(jī)械振動(dòng)加速細(xì)胞壁裂解，增加細(xì)胞內(nèi)容物分子碰撞概率，利于后續(xù)酶解提

取松籽油；超聲強(qiáng)度大于0.28 W/cm2后，松籽油得率下降，這可能是因?yàn)楫?dāng)超聲波的強(qiáng)度過大時(shí)，超聲的空化作用加速分子運(yùn)動(dòng)強(qiáng)烈，使物料分解為極小顆粒，乳狀油部分增多，不利于油脂的分離[20-21]。因此，確定超聲強(qiáng)度為0.28 W/cm2。

圖2 超聲強(qiáng)度對(duì)松籽油得率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic intensity on the yield of pine nut oil

2.3.2 超聲時(shí)間對(duì)松籽油得率的影響

圖3 超聲時(shí)間對(duì)松籽油得率的影響Fig.3 Effect of ultrasonication time on the yield of pine nut oil

由圖3可知，松籽油得率隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，當(dāng)超聲時(shí)間為40 min時(shí)達(dá)到最高值；繼續(xù)延長(zhǎng)超聲時(shí)間，松籽油得率變化不顯著。這與方芳等[22]研究超聲輔助水酶提取葫蘆籽油時(shí)得出結(jié)論類似，時(shí)間過長(zhǎng)并無實(shí)際意義。因此，確定超聲時(shí)間為40 min。

2.3.3 超聲溫度對(duì)松籽油得率的影響

圖4 超聲溫度對(duì)松籽油得率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic pretreatment temperature on the yield of pine nut oil

由圖4可知，隨著超聲溫度的升高松籽油得率逐漸增大到最高點(diǎn)，當(dāng)溫度繼續(xù)升高，松籽油得率逐漸下降并趨于穩(wěn)定，這與物料在高溫條件下發(fā)生結(jié)構(gòu)變化有關(guān)。這與胡濱等[23]在超聲波和微博輔助水酶法提取葡萄籽油的工藝研究中得到的結(jié)論類似。在此條件下松籽油得率達(dá)到70.5%，因此確定超聲溫度為50 ℃。

2.4 酶解條件對(duì)松籽油得率的影響

2.4.1 料液比對(duì)松籽油得率的影響

圖5 料液比對(duì)松籽油得率的影響Fig.5 Effect of solid/liquid ratio on the yield of pine nut oil

由圖5可知，料液比對(duì)松籽油得率有顯著影響，隨著溶劑用量的增大，松籽油得率升高，于1∶5時(shí)達(dá)到最大值；再增大提取液用量，得率開始下降。這可能是因?yàn)楫?dāng)溶劑用量低時(shí)，反應(yīng)體系中底物質(zhì)量濃度大，黏度高，流動(dòng)性低，影響酶對(duì)底物的作用效果；當(dāng)溶劑用量增多時(shí)，水量的增大降低了整個(gè)反應(yīng)體系中底物質(zhì)量濃度，使酶分子與底物分子的作用幾率降低，酶的作用效果下降。

2.4.2 加酶量對(duì)松籽油得率的影響

圖6 加酶量對(duì)松籽油得率的影響Fig.6 Effect of enzyme dosage on the yield of pine nut oil

由圖6可知，隨著加酶量的增大，松籽油得逐漸升高；當(dāng)加酶量達(dá)到1 500 U/g時(shí)，松籽油得率最高為70.35%，當(dāng)加酶量繼續(xù)增加時(shí)，松籽油得率逐漸趨于穩(wěn)定。這是由于酶量的增加，酶與底物作用的更加充分，酶滲透到脂質(zhì)體膜內(nèi)，脂蛋白脂多糖從復(fù)合體中釋放出來，使蛋白酶作用效果更充分[24]；當(dāng)加酶量繼續(xù)增加，體系中過多的酶附著在松籽表面，影響油脂的釋放。

2.4.3 酶解時(shí)間對(duì)松籽油得率的影響

由圖7可知，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，松籽油得率呈現(xiàn)

先快速上升后緩慢上升的趨勢(shì)，在4 h處得率達(dá)到最大。這是由于隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)逐步被打開，酶與底物作用越來越充分，油脂的釋放量相應(yīng)增多，從而得率升高；當(dāng)酶解時(shí)間為5 h時(shí)，松籽油得率較4 h相比稍有下降并不顯著，這是由于底物逐漸減少，酶解趨于充分，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，乳化油部分逐漸增多，影響油脂分離及品質(zhì)。

圖7 酶解時(shí)間對(duì)松籽油得率的影響Fig.7 Effect of hydrolysis time on the yield of pine nut oil

2.4.4 酶解溫度對(duì)松籽油得率的影響

圖8 酶解溫度對(duì)松籽油得率的影響Fig.8 Effect of hydrolysis temperature on the yield of pine nut oil

由圖8可知，當(dāng)溫度較低時(shí)，酶活力不能完全發(fā)揮，不利于酶解反應(yīng)的進(jìn)行，隨著溫度的升高，逐漸接近酶的最適溫度，對(duì)底物的作用效果明顯，因此松籽油得率升高顯著；當(dāng)溫度達(dá)到45 ℃時(shí)，得率達(dá)到最高；隨之溫度繼續(xù)升高得率降低但并不顯著，這是由于溫度超過酶的最適溫度，使酶的活性中心結(jié)構(gòu)被破壞，導(dǎo)致酶變性或失活，不利于松籽油的提取[25]。

2.5 松籽油提取響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.5.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，綜合顯著性分析確定超聲預(yù)處理?xiàng)l件為超聲強(qiáng)度0.28 W/cm2、超聲時(shí)間40 min、超聲溫度50 ℃，對(duì)酶解條件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，模型共進(jìn)行29 次試驗(yàn)，24 組析因試驗(yàn)，試驗(yàn)號(hào)2、9、17、18、24為5 組中心試驗(yàn)，用以估計(jì)試驗(yàn)誤差。每組試驗(yàn)重復(fù)3 次以估計(jì)誤差。響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table2 Experimental program and results for response surface analysis

2.5.2 模型的建立及顯著性分析

表3 二次響應(yīng)面回歸模型方差分析Table3 Analysis of variance for the fitted quadratic response surface regression model

運(yùn)用Design-Expert 8.0得到松籽油得率（Y）對(duì)自變量料液比（A）、加酶量（B）、酶解時(shí)間（C）、酶解溫度（D）的二次多項(xiàng)回歸模型：

Y=73.05+0.072A-0.43B+0.25C-0.39D-0.39AB+ 0.26AC-0.38AD-0.32BC+1.41BD+0.10CD-0.85A2-2.41B2-1.95C2-2.19D2

利用分析軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步分析，顯著性結(jié)果及多元回歸模型的方差分析結(jié)果見表3。

由表3可以看出，模型P＜0.000 1，說明模型極顯著；失擬項(xiàng)P=0.198 4＞0.05，說明失擬項(xiàng)差異不顯著；確定系數(shù)R2=0.981 1，說明響應(yīng)值的變化中有98.11%是來自于所選因素的變化；模型修正決定系數(shù)說明模型能解釋96.21%的響應(yīng)值變化；離散系數(shù)表示試驗(yàn)的精確度，數(shù)值越大，表明試驗(yàn)的可靠性越差[26]，離散系數(shù)為0.48%說明該試驗(yàn)的可靠性較好。綜上，該模型的可信度和擬合度均很高。因此可用該模型回歸方程預(yù)測(cè)超聲波輔助酶法提取松籽油得率的工藝條件優(yōu)化。由F值可以得到4 個(gè)因素對(duì)松籽油得率影響大小順序?yàn)椋築（加酶量）＞D（酶解溫度）＞C（酶解時(shí)間）＞A（料液比）。

由表3還可看出，因素B、D對(duì)響應(yīng)值Y的影響極顯著，因素C對(duì)Y值影響顯著，交互項(xiàng)BD極顯著，交互項(xiàng)AB、AD影響顯著，說明加酶量、酶解溫度之間交互作用極顯著，料液比與加酶量、料液比與酶解溫度之間交互作用顯著。

2.5.3 交互作用分析

圖9 各因素交互作用的響應(yīng)面和等高線圖Fig.9 Response surface and contour plots showing the interactive effects of four extraction parameters on the yield of pine nut oil

響應(yīng)面圖能直接反應(yīng)各因素與響應(yīng)值的關(guān)系及各個(gè)因素間的交互作用，響應(yīng)曲面坡度越陡、等高線密集成橢圓形表示兩因素交互作用的影響越大[27]，而圓形表示交互作用不顯著。由圖9e可以看出，加酶量（B）與酶解溫度（D）交互作用對(duì)松籽油得率的影響極顯著，隨著加酶量和酶解溫度水平的增加，松籽油得率逐漸升高，酶解溫度上升較緩慢。由圖9a可知，料液比（A）與加酶量（B）的交互作用顯著，隨著料液比與加酶量水平的增加，松籽油得率先上升后下降；由圖9c可以看出，料液比（A）與酶解溫度（D）的交互作用顯著，隨著料液比與酶解溫度水平的增加，松籽油得率逐漸增加，但較前兩個(gè)交互作用較為平緩。

2.5.4 松籽油最佳提取條件的確定及驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

對(duì)工藝進(jìn)行的響應(yīng)面優(yōu)化得到松籽油最佳的提取工藝條件為：料液比1∶5.1、加酶量1 427.06 U/g、酶解時(shí)間4.08 h、酶解溫度44.27 ℃，在此條件下松籽油得率的理論值為73.12%。為檢驗(yàn)試驗(yàn)設(shè)計(jì)的可靠性，對(duì)上述工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證，為方便實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行，將工藝參數(shù)設(shè)定為料液比1∶5、加酶量1427 U/g、酶解時(shí)間4.08 h、酶解溫度44 ℃，進(jìn)行3 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，取平均值。所得松籽油得率為73.01%，驗(yàn)證值與響應(yīng)面預(yù)測(cè)值相比，相對(duì)誤差為0.15%，表明經(jīng)優(yōu)化后的工藝條件能夠較好地預(yù)測(cè)松籽油提取工藝。

2.6 松籽油氧化穩(wěn)定性分析

2.6.1 溫度對(duì)松籽油氧化穩(wěn)定性影響

2.6.1.1 溫度對(duì)松籽油POV的影響

圖10 溫度對(duì)松籽油POV的影響Fig.10 Effect of different temperatures on the POV of pine nut oil

由圖10可知，不同溫度條件下松籽油的氧化穩(wěn)定性差異顯著。在3 ℃與-20 ℃條件下，松籽油的POV在10 d內(nèi)較為穩(wěn)定，變化平緩；15 ℃條件下在6 d后POV明顯升高；25 ℃以上松籽油POV迅速升高，35 ℃尤為迅速。因?yàn)楦邷貢?huì)促使油脂氧化速率加快，破壞松籽油中的不飽和脂肪酸，加速其分解進(jìn)而酸敗。-20 ℃ POV的變化高于3 ℃，可能是由于-20 ℃時(shí)水分含量低于3 ℃，水分高會(huì)阻止油脂氧化，降低自由水分含量，可提高油脂穩(wěn)定度[28]。因此，松籽油適宜保存在3 ℃以下。

2.6.1.2 溫度對(duì)松籽油TBA值的影響

圖11 溫度對(duì)松籽油TBA值的影響Fig.11 Effect of different temperatures on the TBA value of pine nut oil

由圖11可知，在3 ℃以下松籽油在貯藏過程中的TBA值變化較為平緩，在6 d后迅速升高；15 ℃以上條件下松籽油TBA值變化不大，在2 d后迅速升高。這表明低溫能夠減弱丙二醛的產(chǎn)生，延緩松籽油的氧化過程。由TBA值與POV的變化趨勢(shì)說明松籽油在3 ℃以下保存可以增加松籽油的貯藏穩(wěn)定性。

2.6.2 光照對(duì)松籽油氧化穩(wěn)定性影響

圖12 光照對(duì)松籽油氧化穩(wěn)定性的影響Fig.12 Effect of light on the oxidative stability of pine nut oil

由圖12可知，室溫光照與室溫避光條件下松籽油POV及TBA值呈上升趨勢(shì)，其中POV增幅的差異性在4 d后尤為顯著；說明光照會(huì)加速松籽油的氧化，在長(zhǎng)時(shí)間的貯藏過程中差異明顯。在避光與見光的條件下TBA值于2 d內(nèi)變化平穩(wěn)，2 d后呈明顯上升趨勢(shì)；光照對(duì)TBA值增幅大于避光，說明避光能夠降低丙二醛的生成速度，減緩松籽油的氧化程度。因此，松籽油要避光貯存。

2.7 松籽油的理化指標(biāo)測(cè)定

由表4可知，超聲波輔助水酶法提取的松籽油具有天然松籽清香，酸值、POV、皂化值、碘值均符合GB/T 5009.37—2003《食用植物油衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》，無氧化酸敗，說明了原料的良好品質(zhì)以及提取方法的可靠。馬文君等[29]以水酶法及溶劑法提取松籽油，研究其POV、酸值均達(dá)到國(guó)家食用油標(biāo)準(zhǔn)，這與本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果基本一致。

表4 松籽油主要理化性質(zhì)Table4 Physicochemical properties of the pine nut oil

3 結(jié) 論

利用超聲輔助水酶法進(jìn)行松籽油的提取，通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面分析試驗(yàn)，得到松籽油的最佳提取工藝條件為在超聲強(qiáng)度0.28 W/cm2、超聲時(shí)間40 min、超聲溫度50 ℃的預(yù)處理?xiàng)l件下，選用堿性蛋白酶對(duì)松籽進(jìn)行酶解，料液比1∶5、加酶量1 427 U/g、酶解時(shí)間4.08 h、酶解溫度44 ℃，松籽油得率可以達(dá)到73.01%，是優(yōu)化前的1.17 倍。超聲波輔助水酶法提取松籽油是安全、有效、經(jīng)濟(jì)的方法。

水酶法提取的松籽油品質(zhì)優(yōu)良，有松仁清香，呈淺黃色透明狀，酸值低，不飽和程度高。由于松籽油富有不飽和脂肪酸，易氧化酸敗，溫度與光照對(duì)氧化程度呈正相關(guān)，影響顯著。在3 ℃以下的溫度避光貯存，松籽油具有良好的貯藏穩(wěn)定性。

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Optimization of Ultrasonic-Assisted Aqueous Enzymatic Extraction of Pine Nut Oil and Its Oxidative Stability

BAO Yihong, GUO Yang
(School of Forestry, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China)

The ultrasound-assisted aqueous enzymatic extraction of pine nut oil from Korean pine (Pinus koraiensis) nuts subjected to ultrasonic pretreatment was optimized using one-factor-at-a-time method and response surface methodology. Meanwhile the effects of temperature and light on the oxidative stability of pine nut oil were also analyzed. The optimal extraction conditions were obtained as follows: ultrasonic pretreatment at an intensity of 0.28 W/cm2for 40 min at 50 ℃, followed by 4.08 h of hydrolysis using 1 427 U/g of alcalase with a substrate to water ratio of 1:5 (g/mL) at 44 ℃. Under these conditions, the yield of pine nut oil reached 73.01%. Both temperature and light significantly influenced the oxidative stability of pine nut oil. Storage at 3 ℃ without light could markedly improve the stability of pine nut oil.

ultrasonic; aqueous enzymatic method; response surface methodology; pine nut oil

10.7506/spkx1002-6630-201622009

TS224.4

A

1002-6630（2016）22-0060-09

包怡紅, 郭陽. 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化超聲波輔助水酶法提取松籽油工藝及其氧化穩(wěn)定性[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(22): 60-68. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201622009. http://www.spkx.net.cn

BAO Yihong, GUO Yang. Optimization of ultrasonic-assisted aqueous enzymatic extraction of pine nut oil and its oxidative stability[J]. Food Science, 2016, 37(22): 60-68. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201622009. http://www.spkx.net.cn

2016-04-07

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)（2572014EA02）；哈爾濱市科技創(chuàng)新人才項(xiàng)目（2015RAXXJ010）

包怡紅（1970—），女，教授，博士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)與功能食品。E-mail：baoyihong@163.com