吳燕，田姍，孔健，徐榮

(空軍總醫(yī)院藥學(xué)部，北京 100142)

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以葉酸修飾的乳酸-羥基乙酸共聚物為載體的紫杉醇靶向納米粒的構(gòu)建與評價

吳燕，田姍，孔健，徐榮

(空軍總醫(yī)院藥學(xué)部，北京 100142)

目的 以葉酸修飾的生物可降解材料乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA-PEG-FOL)為載體，構(gòu)建紫杉醇靶向納米粒并進(jìn)行評價。方法 采用乳化-分散法，以溶液穩(wěn)定性、粒徑和包封率為評價指標(biāo)，通過考察乳化劑的用量、有機相種類、水相與有機相比例、聚合物分子量、藥載比、剪切速度等因素對納米粒制備的影響，確定最優(yōu)處方和制備工藝，并對納米粒的形態(tài)、粒徑、Zeta電位、包封率及載藥量進(jìn)行評價。結(jié)果 合成了載體PLGA-PEG-FOL；制備的紫杉醇靶向納米粒為均勻球形粒子，粒徑為(88.2±6.7)nm，Zeta電位為(56.5±4.2)mV，包封率為(92.9±3.2)%，載藥量為(4.8±1.3)%。結(jié)論 納米粒制備方法簡便易行，重現(xiàn)性好。制備的納米粒大小均勻，粒度分布較窄，包封率和載藥量較高。

紫杉醇；乳酸-羥基乙酸共聚物；納米粒；乳化-分散法

腫瘤多藥耐藥(Multi-drug resistance，MDR)和化學(xué)藥物對腫瘤組織的低選擇性是臨床上化療失敗的主要原因[1]。紫杉醇(paclitaxel，PTX)是被美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)及歐洲藥品管理局(EMA)批準(zhǔn)的用于治療乳腺癌和卵巢癌的一線化學(xué)藥物。其難溶于水(<6 mg·L-1)，口服生物利用度差[2]。臨床以聚氧乙烯蓖麻油和乙醇溶解后給藥，給藥后存在嚴(yán)重過敏反應(yīng)、腎毒性、神經(jīng)毒性、心臟毒性等不良反應(yīng)，使其臨床應(yīng)用受到限制[3-4]。為了解決紫杉醇溶解性和探索逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥性的新途徑，我們以葉酸修飾的生物可降解材料乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA-PEG-FOL)為載體，以泊洛沙姆(Pluronic F68)、卵磷脂和雙十二烷基二甲基溴化銨(DDAB)為乳化劑來構(gòu)建紫杉醇靶向納米粒。探索葉酸介導(dǎo)的載藥系統(tǒng)在葉酸主動靶向能力、長循環(huán)納米粒的被動靶向作用、Pluronic F68克服耐藥作用，三者協(xié)同增效后臨床應(yīng)用的可行性；希望在靶向緩釋技術(shù)改善腫瘤治療現(xiàn)狀的應(yīng)用基礎(chǔ)研究方面取得一些重要的創(chuàng)新性成果。

1 儀器與材料

紫外分光光度計(型號：UV-2401，日本島津)；高效液相色譜儀(美國Agilent)；傅里葉變換紅外光譜儀(型號：Nicolet 5700，美國熱電公司)；核磁共振譜儀(BRUKER AV-III-5001H-NMR)；電子分析天平(型號：BS110S,Sartorius)；10K超濾離心管(美國 Millipore)；LC-4016型低速離心機(上海資一儀器設(shè)備有限公司)；冷凍干燥機(北京四環(huán)科學(xué)儀器廠)；納米粒度儀(型號：Winner802，濟南微納)；透射電子顯微鏡(型號：JEM-1400plus，日本JEOL)；B25高速剪切機；紫杉醇(江蘇紅豆杉藥業(yè)有限公司，含量99.4%)；聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA，端羧基，75∶25，Mr=1.1萬，濟南岱罡生物工程有限公司)；H2N-PEG-NH2(Mr=2000，嘉興博美生物技術(shù)有限公司)；雙十二烷基二甲基溴化銨(DDAB，美國Sigma公司)；Pluronic F68(德國BASF公司)；溶血卵磷脂(MSPC，上海艾偉特)；N,N'-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS,Fluka公司)；葉酸(FOL，Sigma)；乙腈為色譜純。

2 方法與結(jié)果

2.1 葉酸修飾載體PLGA-PEG-FOL的合成[5-6]

2.1.1 PLGA-PEG-NH2的合成 取5 g PLGA溶于二氯甲烷中，加入206 mg DCC和115 mg NHS，于室溫在氮氣中活化24 h(PLGA/NHS/DCC摩爾比為1∶2∶2)。將合成溶液加至冰冷的二乙醚中進(jìn)行過濾和沉淀，并將活化的PLGA于真空中完全干燥。將溶有活化的PLGA(1 g)的8 mL二氯甲烷溶液，滴加至2 mL溶有2.1 g H2N-PEG-NH2的二氯甲烷溶液中，邊加邊緩慢攪拌。在氮氣中反應(yīng)6 h(PLGA/H2N-PEG-NH2摩爾比為1∶5)，通過加入冰冷的二乙醚進(jìn)行沉淀。對沉淀的胺端基二嵌段共聚物(PLGA-PEG-NH2)進(jìn)行過濾和干燥。

2.1.2 PLGA-PEG-FOL的合成 取500 mg PLGA-PEG-NH2、13 mg FOL和13 mg DCC，溶于5 mL 二甲基亞砜(DMSO)中，室溫反應(yīng)7 h，然后加入50 mL蒸餾水，3 000 r·min-1離心。棄去沉淀，取上清液進(jìn)行透析和干燥，即得PLGA-PEG-FOL。

2.2 葉酸修飾載體PLGA-PEG-FOL的表征

2.2.1 PLGA-PEG-FOL的紅外光譜檢測 圖1紅外光譜圖顯示：PLGA-PEG-FOL除顯示了乳酸-羥基乙酸共聚物的全部吸收峰以外，還在1 627 cm-1和1 577 cm-1新出現(xiàn)了苯環(huán)骨架振動引起的特征吸收峰[7]，說明葉酸成功連接到乳酸-羥基乙酸共聚物高分子鏈上[8]。

圖1 葉酸修飾PLGA-PEG-FOL的紅外光譜

2.2.2 PLGA-PEG-FOL的1H核磁共振檢測 從圖2及氫質(zhì)子峰歸屬顯示，葉酸修飾乳酸-羥基乙酸共聚物的制備成功[9]。

圖2 葉酸修飾乳酸-羥基乙酸共聚物的1H核磁共振譜圖

2.3 紫杉醇納米粒的制備

2.3.1 乳化劑用量的影響 固定有機相為二氯甲烷，水相與有機相的比例為2∶1(v/v)，藥載比為1∶10(w/w)，考察加入乳化劑的用量對制劑穩(wěn)定性的影響。結(jié)果表明，乳化劑用量分別為MSPC 0.01%(w/v)、Pluronic F68 0.1%(w/v)、DDAB 0.4%(w/v)時，乳化劑用料較少且所制備的納米粒包封率較高、粒徑較小。具體見表1。

2.3.2 有機相種類的影響 固定水相與有機相的比例為2∶1(v/v)，藥載比為1∶10(w/w)，乳化劑用量分別為MSPC 0.01%(w/v)、Pluronic F68 0.1%(w/v)、DDAB 0.4%(w/v)，考察不同有機相種類(二氯甲烷、丙酮、乙酸乙酯)對納米粒包封率和粒徑的影響。結(jié)果表明，相同條件下二氯甲烷制備的制劑包封率較高且粒徑較小，故選擇二氯甲烷作為有機相溶劑。具體見表2。

表1 乳化劑用量對納米粒包封率和粒徑的影響

表2 有機相種類對納米粒包封率和粒徑的影響±s

2.3.3 水相與有機相比例的影響 固定有機相為二氯甲烷，藥載比為1∶10(w/w)，乳化劑用量分別為MSPC 0.01%(w/v)、Pluronic F68 0.1%(w/v)、DDAB 0.4%(w/v)，考察不同水相與有機相比例(W/O分別為1∶1、2∶1、3∶1，v/v)對納米粒包封率和粒徑的影響。結(jié)果表明，隨著W/O的減小，納米粒包封率增加，但同時粒徑明顯增大。綜合考慮，選擇W/O(2∶1，v/v)來制備納米粒。具體見表3。

表3 水相與有機相比例對納米粒包封率和粒徑的影響±s

2.3.4 聚合物分子量的影響 固定有機相為二氯甲烷，水相與有機相的比例為2∶1(v/v)，藥載比為1∶10(w/w)，乳化劑用量分別為MSPC 0.01%(w/v)、Pluronic F68 0.1%(w/v)、DDAB 0.4%(w/v)，考察不同分子量(Mr分別為1.1、2.5、4.5萬)聚合物對納米粒包封率和粒徑的影響。結(jié)果表明，隨著PLGA分子量的增加，包封率無明顯變化，粒徑明顯增大。故選擇Mr=1.1萬的PLGA作為載體材料。具體見表4。

表4 聚合物分子量比例對納米粒包封率和粒徑的影響±s

2.3.5 藥載比的影響 固定有機相為二氯甲烷，水相與有機相的比例為2∶1(v/v)，乳化劑用量分別為MSPC 0.01%(w/v)、Pluronic F68 0.1%(w/v)、DDAB 0.4%(w/v)，考察不同藥載比(1∶8、1∶10、1∶12，w/w)對納米粒徑和包封率的影響。結(jié)果表明，隨著藥載比的減小，包封率逐漸增加，但同時粒徑也逐漸增大。綜合考慮，選擇藥載比(1∶10，w/w)來制備納米粒。具體見表5。

表5 藥載比對納米粒包封率和粒徑的影響±s

2.3.6 剪切速度的影響 固定水相與有機相的比例為2∶1(v/v)，藥載比為1 ∶10(w/w)，乳化劑用量分別為MSPC 0.01%(w/v)、Pluronic F68 0.1%(w/v)、DDAB 0.4%(w/v)，考察不同剪切速度(10 000、13 000、16 000 r·min-1)對納米粒徑和包封率的影響。結(jié)果表明，隨著剪切速度的增大，粒徑逐漸減小，但包封率先增大后減小，故選擇13 000 r·min-1的剪切速度來制備納米粒。具體見表6。

表6 剪切速度對納米粒包封率和粒徑的影響±s

2.4 最優(yōu)處方工藝驗證 根據(jù)上述試驗結(jié)果，確定最優(yōu)處方和制備工藝為：采用乳化-分散法，精密稱取100 mg PLGA-PEG-FOL、10 mg紫杉醇和25 mg Pluronic F68，加入25 mL二氯甲烷，超聲溶解后作為油相；精密稱取5 mg MSPC、25 mg Pluronic F68和2% DDAB水溶液10 mL，加入40 mL蒸餾水，水浴加熱(65 ℃)溶解后作為水相。在高速剪切機攪拌下將油相緩慢加至水相中形成O/W乳液，滴加完畢后繼續(xù)高速剪切3～5 min。將該乳劑在磁力攪拌下加入適量的水，繼續(xù)攪拌過夜使二氯甲烷完全揮發(fā)。將所得納米?；鞈乙合鹊退匐x心(1 000 r·min-1，20 min)除去大顆粒聚集物，再置超濾管中離心(3 500 r·min-1，30 min)，收集沉淀，冷凍干燥即得。

2.5 冷凍干燥工藝考察 為了得到分散性和流動性較好的粉末，分別考察了不加凍干保護(hù)劑、加入甘露醇、蔗糖兩種不同凍干保護(hù)劑，以及加入不同濃度凍干保護(hù)劑(3%、5%、7%，w/v)對凍干產(chǎn)物外觀和流動性的影響。結(jié)果表明，加入5%蔗糖時，得到的凍干產(chǎn)物為流動性較好的淡黃色粉末。

2.6 納米粒形態(tài)觀察 取凍干的納米粒適量，加蒸餾水稀釋至適宜濃度，取1～2滴納米粒膠態(tài)混懸液置于銅網(wǎng)上，用1.5%磷鎢酸溶液染色，室溫晾干，于透射電子顯微鏡下觀察納米粒的形態(tài)并拍照。從圖3中可以看出，制備的納米粒為球形粒子，大小均勻。

圖3 載藥納米粒透射電鏡圖(1.5%磷鎢酸溶液染色)

2.7 納米粒粒徑和Zeta電位測定 稱取適量凍干納米粒，加一定量的蒸餾水稀釋，取1 mL溶液加入納米粒度儀的樣品池中，測定粒徑及粒度分布。結(jié)果表明，納米粒的平均粒徑為(88.2±6.7) nm，粒度分布較窄。見圖4，Zeta電位(56.5±4.2)mV。

2.8 納米粒載藥量和包封率的測定

2.8.1 色譜條件 色譜柱：C18柱(Venusil XBP 150 mm×4.6 mm,5 μm)；流動相：乙腈∶水=50∶50；檢測波長：227 nm；柱溫：25 ℃；流速：1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量：10 μL。

圖4 納米粒的粒徑及粒度分布圖

2.8.2 系統(tǒng)適用性試驗 取本品適量，以流動相配制成100 mg·L-1的溶液，平行配制6份，作為供試品溶液進(jìn)行測定。主峰峰面積的RSD=0.652%，主峰保留時間的RSD=0.069%，主峰的拖尾因子<2.0，主峰的理論塔板數(shù)>3 000，結(jié)果表明，該方法系統(tǒng)適用性良好。

2.8.3 專屬性 在選定的色譜條件下，處方中的輔料不干擾主藥的測定。

2.8.4 方法的精密度 為了驗證方法的精密度進(jìn)行了進(jìn)樣精密度、重復(fù)性和中間精密度試驗。(1)進(jìn)樣精密度:取本品適量，以流動相配制成100 mg·L-1的溶液，作為供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6針。其RSD=0.064%，結(jié)果表明，該方法進(jìn)樣精密度良好。(2)重復(fù)性:取本品適量，以流動相配制成100 mg·L-1的溶液，平行配制6份，作為供試品溶液。分別進(jìn)行HPLC測定，其RSD=0.994%，結(jié)果表明，該方法重復(fù)性良好。(3)中間精密度:取重復(fù)性試驗中所制備的6份同一濃度的供試品溶液作為供試品；分別取6份供試品溶液和1份對照品溶液，在不同時間，由不同的實驗人員連續(xù)進(jìn)行測定，結(jié)果表明本方法具有良好的中間精密度(RSD=0.791%)。

2.8.5 線性范圍 取本品約10 mg，精密稱定，置50 mL量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，配成200 mg·L-1的母液，精密量取母液1、2、3、4、5、6、7 mL，分別置10 mL量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，制成相當(dāng)于檢測濃度的20%、40%、60%、80%、100%、120%、140%溶液，依法測定，記錄峰面積，以峰面積對濃度繪制回歸曲線。結(jié)果表明，濃度在20～140 mg·L-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，其回歸方程為：Y=20.177 4X-4.5143，R2=0.999 9。

2.8.6 溶液穩(wěn)定性 取本品約10 mg，精密稱定，置100 mL量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，配制成100 mg·L-1的供試品溶液，測定了連續(xù)8 h的溶液穩(wěn)定性。結(jié)果表明，溶液在8 h之內(nèi)可保持穩(wěn)定(RSD=0.199%)。

2.8.7 回收率 準(zhǔn)確稱取空白納米粒9份，每份100 mg，依次加入PTX標(biāo)準(zhǔn)溶液配制成濃度為80%、100%、120%的供試品溶液各3份，分別測定其含量，將實測值與理論值比較，計算回收率。結(jié)果表明，三個濃度的平均回收率分別為100.4%、101.1%、100.7%，9個回收率數(shù)據(jù)的RSD為0.431%，回收率良好。具體見表7。

表7 回收率試驗結(jié)果

2.8.8 檢測限和定量限 采用信噪比法對方法的檢測限和定量限進(jìn)行了測評：檢測限為0.2 mg·L-1(信噪比3∶1)；定量限為0.4 mg·L-1(信噪比10∶1)。

2.8.9 載藥量和包封率的測定[10]稱取凍干樣品適量分散于蒸餾水中，加入適量乙腈超聲使納米粒完全溶解，測定PTX含量(W包)，按下式計算納米粒的載藥量(DL%)與包封率(EE%)：

載藥量(DL%)=W包/W總×100%

包封率(EE%)=W包/W藥×100%

式中W包：納米粒中包裹藥物量(mg)；W總：納米粒的總重量(mg)；W藥：投入的總藥量(mg)。

取3批凍干樣品依法測定，包封率為(92.9±3.2)%，載藥量為(4.8±1.3)%。

3 討論

3.1 制備納米粒的方法選擇 預(yù)實驗采用乳化-溶劑揮發(fā)法，用超聲波細(xì)胞粉碎機進(jìn)行探頭超聲制備納米粒。此方法每次制備體積很小(2 mL)，操作繁瑣，且由于超聲探頭在溶液中的位置無法精密控制，導(dǎo)致重現(xiàn)性差。而乳化-分散法制備體積較大(50～100 mL)，簡便易行，重現(xiàn)性好，故選擇此法制備納米粒。

3.2 乳化劑的選擇

3.2.1 MSPC的選擇 MSPC是普通磷脂在磷脂酶A2的作用下失去一分子脂肪酸鏈所得的產(chǎn)物，具有很好的水分散性，適于制備O/W型乳狀液[11]。MSPC乳化油脂的能力是普通磷脂的5倍左右，且在高溫、低溫下的乳化穩(wěn)定性都大于普通磷脂[12],因此本研究選擇MSPC作為乳化劑。

3.2.2 Pluronic F68的選擇 聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯三嵌段共聚物(商品名為Pluronics)，是美國FDA批準(zhǔn)的藥用輔料，在藥物制劑領(lǐng)域通常作為乳化劑[13]。Pluronic嵌段共聚物在體內(nèi)外均能顯著提高多藥耐藥腫瘤細(xì)胞對抗腫瘤藥物的增敏作用，并促進(jìn)藥物跨過血腦屏障和腸屏障[14]。細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)，Pluronic F68是多藥耐藥蛋白P-糖蛋白的有效抑制劑[15]。因此，試驗選擇Pluronic F68作為乳化劑，同時用于逆轉(zhuǎn)腫瘤的多藥耐藥性，以提高藥物的療效。

3.2.3 DDAB的選擇 DDAB作為乳化劑制備的納米粒子帶有陽離子電荷，有利于納米粒與陰離子黏多糖富集的生物組織發(fā)生電荷相互作用，從而有利于對納米粒的滯留和攝取[16]。所以本研究選擇DDAB作為乳化劑來制備納米粒。

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Establishment and evaluation of targeted paclitaxel nanoparticles with PLGA-PEG-FOL as the carrier

WU Yan,TIAN Shan,KONG Jian,et al

(DepartmentofPharmacy，TheAirForceGeneralHospital,Beijing100142,China)

Objective To prepare and evaluate the targeted paclitaxel nanoparticles with biodegradable materials of lactic acid-glycolic acid copolymer modified by folic acid (PLGA-PEG-FOL) as the carrier.Methods The emulsification-dispersion method was used to prepare nanoparticles.The optimum prescription and preparation technology were determined by investigating the influence of the dosage of emulsifiers,the species of organic phase,the proportion of water phase and organic phase,molecular weight of polymer,the proportion of drug particle size and the entrapment efficiency.The nanoparticles were evaluated in terms of the morphology of nanoparticles,particle size,Zeta potential,entrapment efficiency and drug-loading rate.Results PLGA-PEG-FOL was successfully synthesized.The targeted nanoparticle was uniform spherical particle.The particle size was (88.2±6.7) nm,Zeta potential was (56.5±4.2) mV,the entrapment efficiency was (92.9±3.2)%,and the drug-loading rate was (4.8±1.3)%.Conclusions The preparation method of nanoparticles was simple and reproducible.The particle size of nanoparticles was uniform with a narrow size distribution.The entrapment efficiency and drug loadings were high.

Paclitaxel;PLGA-PEG-FOL;Nanoparticles;Emulsification-dispersion method

全軍醫(yī)學(xué)科技青年培育項目(13QNP079)

吳燕，女，副主任藥師，碩士生導(dǎo)師，研究方向：緩控釋及靶向給藥系統(tǒng)研究，E-mail：yanjiushi1010@126.com

徐榮，女，副主任藥師，研究方向：醫(yī)院藥學(xué)管理，E-mail：xurong2008-12@163.com

10.3969/j.issn.1009-6469.2016.10.010

2016-04-27，

2016-07-22)