趙妍嫣，秦新生，朱圣偉，鄭 志*

（合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，安徽省農(nóng)產(chǎn)品精深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230009）

大豆凝集素的超聲波輔助提取工藝優(yōu)化及其性質(zhì)

趙妍嫣，秦新生，朱圣偉，鄭 志*

（合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，安徽省農(nóng)產(chǎn)品精深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230009）

采用響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助提取大豆凝集素的最佳工藝參數(shù)。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以超聲時(shí)間、提取溫度、提取時(shí)間、液料比為自變量，以凝集素提取得率為響應(yīng)值，優(yōu)化得到大豆凝集素的最佳提取工藝為：超聲時(shí)間38 min、提取溫度32 ℃、提取時(shí)間5.6 h、液料比10∶1（mL/g）。在此條件下得到的凝集素提取得率為9.82%。穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果表明：大豆凝集素的最適pH值為7～8，在Ca2+溶液中較穩(wěn)定。D-乙酰葡萄糖胺和D-乙酰乳糖胺對(duì)大豆凝集素的凝集活力影響大，是大豆凝集素的專一性抑制糖。

大豆蛋白；凝集素；超聲波；響應(yīng)面分析；穩(wěn)定性

趙妍嫣, 秦新生, 朱圣偉, 等. 大豆凝集素的超聲波輔助提取工藝優(yōu)化及其性質(zhì)[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(10): 34-39. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201610007. http://www.spkx.net.cn

ZHAO Yanyan, QIN Xinsheng, ZHU Shengwei, et al. Ultrasonic-assisted extraction and properties of lectin from soybean protein[J]. Food Science, 2016, 37(10): 34-39. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201610007. http://www.spkx.net.cn

大豆蛋白具有豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，是一種優(yōu)質(zhì)的植物蛋白源[1]。大豆凝集素是大豆中含有的一類可促使細(xì)胞凝集的高度專一性糖蛋白，含量占到蛋白質(zhì)總量的10%左右[2-5]。大豆凝集素具有凝集細(xì)胞的特性，因此可以結(jié)合血紅細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、細(xì)菌表面的糖結(jié)構(gòu)，從而達(dá)到抵御人體病毒入侵、抑制病毒生長(zhǎng)的生理功效。因此，目前大豆凝集素在免疫學(xué)、食品營(yíng)養(yǎng)學(xué)等領(lǐng)域被較廣泛應(yīng)用[6-9]。

大豆蛋白是獲取凝集素的主要原料，目前從大豆中提取凝集素的研究，主要集中在傳統(tǒng)的加熱制備提取，如黃澤華等[10]用響應(yīng)面法優(yōu)化兔血紅細(xì)胞檢測(cè)綠豆凝集素的凝集活性。冀愛(ài)青等[11]對(duì)比研究了5 種核桃仁凝集素的提取工藝和理化性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)不同品種的核桃仁對(duì)細(xì)胞的凝集活性有所差異。與傳統(tǒng)的加熱提取工藝相比，超聲波輔助提取技術(shù)因其經(jīng)濟(jì)方便、提取時(shí)間短、對(duì)物

質(zhì)結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)影響較小，在植物提取中被廣泛應(yīng)用，但目前采用超聲波輔助提取植物凝集素的研究較少。本實(shí)驗(yàn)以超聲波技術(shù)輔助提取大豆凝集素，減少了提取時(shí)間和成本，通過(guò)對(duì)提取物穩(wěn)定性質(zhì)的研究，為大豆凝集素的活性研究和生物學(xué)應(yīng)用開(kāi)發(fā)提供了理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆蛋白粉 河南省鯤華生物技術(shù)有限公司；新鮮豬血 市售；96孔V型血凝計(jì)數(shù)板、凝集素芯片 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；實(shí)驗(yàn)所用試劑為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

CP114型電子天平 奧豪斯儀器上海有限公司；CR22GⅡ高速冷凍離心機(jī) 日本Hitachi公司；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋 國(guó)華電器有限公司；SB-5200D型超聲波清洗機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 大豆凝集素的超聲波提取

稱取1 g過(guò)篩的大豆蛋白粉，按一定液料比加入浸提液，在恒溫水浴鍋中經(jīng)超聲波處理一定時(shí)間，于3 000 r/min離心15 min，棄去沉淀，取上清液至離心管中3 000 r/min再離心20 min，得到上清液保藏于4 ℃后進(jìn)行凝集素的鹽析純化和蛋白濃度理化性質(zhì)測(cè)定[12-13]。以不同種類的浸提液作為溶劑，分別以超聲時(shí)間、提取溫度、提取時(shí)間、液料比為自變量因素，以大豆凝集素提取得率為指標(biāo)進(jìn)行單因素試驗(yàn)，進(jìn)行3 次試驗(yàn)取平均值。大豆凝集素提取得率的計(jì)算見(jiàn)公式（1）：

1.3.2 大豆凝集素的血凝活性測(cè)定

凝集素活力單位及比活力計(jì)算見(jiàn)公式（2）、（3）[14-16]：

1.3.3 大豆凝集素提取的響應(yīng)面優(yōu)化

通過(guò)單因素試驗(yàn)，分別以A、B、C、D表示超聲時(shí)間、提取溫度、提取時(shí)間、液料比（mL/g）4 個(gè)主要影響因素，并以-1、0、1分別代表因素的水平，以大豆凝集素提取得率為響應(yīng)值，設(shè)置四因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，采用Design-Expert軟件進(jìn)行Box-Behnken設(shè)計(jì)，試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Coded and actual values for the factors used in response surface analysis (RSA)

1.3.4 大豆凝集素的理化性質(zhì)測(cè)定

1.3.4.1 酸堿穩(wěn)定性的測(cè)定[17-18]

在96 孔V型血凝板上倍比稀釋后進(jìn)行血凝實(shí)驗(yàn)，用豬血紅細(xì)胞測(cè)定不同pH值條件下的大豆凝集素的凝集活力。

1.3.4.2 金屬離子穩(wěn)定性的測(cè)定[19]

用豬血紅細(xì)胞測(cè)定不同金屬離子添加后的大豆凝集素的凝集活力。所選金屬離子為Cu2+、Zn2+、K+、Ca2+、Mn2+、Mg2+、Hg2+。

1.3.4.3 糖專一性抑制的測(cè)定[20]

用豬血紅細(xì)胞測(cè)定不同糖添加后的大豆凝集素的凝集活力，以磷酸鹽緩沖液為空白對(duì)照。所用糖分別為D-葡萄糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、D-甘露糖、麥芽糖、D-乙酰葡萄糖胺、D-乙酰乳糖胺。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 浸提液對(duì)凝集素提取得率的影響

圖1 浸提液對(duì)凝集素提取得率的影響Fig. 1 Effect of extraction solvents on the extraction yield of soybean lectin

由圖1可知，在相同的超聲時(shí)間、提取時(shí)間、提取溫度和液料比的條件下，用生理鹽水和磷酸緩沖液得到的凝集素的提取得率較高，生理鹽水作為浸提液時(shí)提取得率最高，達(dá)到9.73%，是最好的大豆凝集素提取溶劑[10]。

2.1.2 超聲時(shí)間對(duì)凝集素提取得率的影響

如圖2所示，超聲時(shí)間40 min大豆凝集素提取得率達(dá)到最高。超聲波可以使大豆蛋白亞基結(jié)構(gòu)解離，凝集素得以大量釋放。隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，提取得率開(kāi)始降低，原因是超聲波引起的空洞效應(yīng)作用力的下降，使得凝集素表面吸附力增加，從而降低得率[21]。

圖2 超聲時(shí)間對(duì)凝集素提取得率的影響Fig. 2 Effect of ultrasonic irradiation time on the extraction yield of soybean lectin

2.1.3 提取溫度對(duì)凝集素提取得率的影響

圖3 提取溫度對(duì)凝集素提取得率的影響Fig. 3 Effect of extraction temperature on the extraction yield of soybean lectin

由圖3可知，隨著提取溫度升高，大豆凝集素提取得率在提取溫度為30 ℃時(shí)達(dá)到最大值，為9.73%。因?yàn)闇囟鹊纳邥?huì)加劇凝集素的擴(kuò)散。當(dāng)溫度高于30 ℃時(shí)，大豆凝集素提取得率有所降低，是由于溫度過(guò)高會(huì)損害凝集素的活力和結(jié)構(gòu)。因此，30 ℃為大豆凝集素最佳提取溫度[18]。

2.1.4 提取時(shí)間對(duì)凝集素提取得率的影響

圖4 提取時(shí)間對(duì)凝集素提取得率的影響Fig. 4 Effect of extraction time on the extraction yield of soybean lectin

由圖4可知，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，凝集素提取得率不斷上升，在6 h達(dá)到最大，隨后開(kāi)始下降。原因在于隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，大豆凝集素在浸提液中不斷被溶解，但隨后時(shí)間越長(zhǎng)卻不再有更多凝集素提取出，而不斷地?cái)嚢钑?huì)使凝集素與空氣過(guò)度接觸而被氧化，導(dǎo)致凝集素提取得率下降。所以選擇6 h作為凝集素提取的最佳時(shí)間[19]。

2.1.5 液料比對(duì)凝集素提取得率的影響

圖5 液料比對(duì)凝集素提取得率的影響Fig. 5 Effect of liquid-to-solid ratio on the extraction yield of soybean lectin

如圖5所示，大豆凝集素的提取得率隨液料比的增加有先上升后下降的趨勢(shì)，剛開(kāi)始隨著溶劑量的增加，溶液中凝集素濃度降低，導(dǎo)致擴(kuò)散的壓力差增加，利于凝集素?cái)U(kuò)散。在液料比為10∶1（mL/g）時(shí)凝集素提取得率達(dá)到最大。后再增加溶劑量，凝集素的溶解量固定，考慮到實(shí)際操作使得提取得率下降，因此選擇10∶1（mL/g）作為凝集素提取的最佳液料比[8]。

2.2 響應(yīng)面分析法優(yōu)化大豆凝集素提取的最優(yōu)條件

2.2.1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

以超聲時(shí)間、提取溫度、提取時(shí)間、液料比為自變量，以凝集素提取得率為響應(yīng)值，響應(yīng)面試驗(yàn)分析及結(jié)果如表2所示。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)分析及結(jié)果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

2.2.2 模型方程的建立及顯著性檢驗(yàn)

采用Design-Expert軟件對(duì)表2所得的大豆凝集素提取得率試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合（表3），得到超聲時(shí)間（A）、提取溫度（B）、提取時(shí)間（C）、液料比（D）為自變量對(duì)大豆凝集素提取得率的回歸方程：凝集素提取得率/%=9.73+0.36A+0.14B+0.077C-0.27D+0.03AB+ 0.02AC-0.012AD-0.012BC+0.007 5CD-0.9A2-0.62B2-1.15C2-0.33D2。通過(guò)回歸模型的方差分析表得出，整體模型的P＜0.01，表明二次模型極顯著，失擬項(xiàng)P=0.527 7＞0.05，不顯著，表明此二項(xiàng)模型擬合有效，可以分析和預(yù)測(cè)各因素與響應(yīng)值的關(guān)系。各影響因素的主次順序?yàn)椋篈超聲時(shí)間＞D液料比＞B提取溫度＞C提取時(shí)間。

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Analysis of variance (ANOVA) of the fi tted quadratic regression model (with extraction yield as response)

2.2.3 各因素的響應(yīng)面分析

圖6 各因素交互作用對(duì)凝集素提取得率的影響Fig. 6 Response surface plots showing the interactive effect of extraction parameters on the yield of soybean lectin

等高線的形狀反映了兩因素的交互效應(yīng)，橢圓形越密集，表明兩因素交互作用越顯著[22-24]。由圖6可得到最佳工藝條件，超聲時(shí)間和提取溫度、超聲時(shí)間和提取時(shí)間、提取溫度和提取時(shí)間3 組圖曲線坡度較大，對(duì)凝集素提取得率影響顯著；超聲時(shí)間和液料比、提取溫度和液料比、提取時(shí)間和液料比3 組圖曲線較平緩，對(duì)凝集素提取得率影響較弱。

2.2.4 大豆凝集素提取的最優(yōu)條件的確定

由Design-Expert軟件可求得回歸方程的極值點(diǎn)，得

到凝集素提取最佳工藝條件為：超聲時(shí)間38.2 min、提取溫度31.6 ℃、提取時(shí)間5.57 h、液料比9.72∶1。所用浸提液為生理鹽水，在此條件下，大豆凝集素的理論預(yù)測(cè)提取得率為9.79%。對(duì)最佳提取條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，考慮到實(shí)際操作，將最佳工藝參數(shù)修正為：超聲時(shí)間38 min、提取溫度32 ℃、提取時(shí)間5.6 h、液料比10∶1。測(cè)得凝集素的提取得率為9.82%，與預(yù)測(cè)值接近。

2.3 大豆凝集素的理化性質(zhì)

2.3.1 酸堿穩(wěn)定性

表4 pH值對(duì)大豆凝集素活力的影響Table 4 Effect of pH on the activity of soybean lectin

由表4可知，大豆凝集素的凝集活力受pH值的影響較大，最適pH值為7～8，在強(qiáng)堿環(huán)境中幾乎喪失活性。在極端pH值環(huán)境下，高靜電推斥能量導(dǎo)致凝集素蛋白分子的膨脹和展開(kāi)，使得蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的巰基和羧基發(fā)生離子化，造成凝集素蛋白多肽鏈的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生不可逆的變性[25]。

2.3.2 金屬離子穩(wěn)定性

表5 金屬離子對(duì)大豆凝集素活力的影響Table 5 Effect of metal ions on the activity of soybean lectin

由表5可知，不同金屬離子對(duì)大豆凝集素的凝集活力影響不同，在含有Ca2+的溶液中大豆凝集素凝集活性最強(qiáng)，穩(wěn)定性最好；Cu2+、Mg2+、Hg2+略微降低了大豆凝集素的凝集活性[10]。

2.3.3 糖專一性抑制

表6 糖溶液對(duì)大豆凝集素活力的影響Table 6 Effect of sugar solutions on the activity of soybean lectin

如表6所示，在所提供的8 種糖中，大豆凝集素可與D-乙酰葡萄糖胺和D-乙酰乳糖胺專一性結(jié)合，凝集活力較低，說(shuō)明大豆凝集素容易與乙?；奶墙Y(jié)合，因此D-乙酰葡萄糖胺和D-乙酰乳糖胺是大豆凝集素的專一性抑制糖。而其他單糖和寡糖對(duì)大豆凝集素的凝集活力影響不大，說(shuō)明大豆凝集素的蛋白結(jié)構(gòu)上含有結(jié)合糖的乙?；苌锏氖荏w[10]。

3 結(jié) 論

本研究通過(guò)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法對(duì)大豆凝集素的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，得到提取最佳工藝參數(shù)為：超聲時(shí)間38 min、提取溫度32 ℃、提取時(shí)間5.6 h、液料比10∶1。在此條件下得到的大豆凝集素的提取得率為9.82%。

對(duì)大豆凝集素的理化性質(zhì)進(jìn)行測(cè)定發(fā)現(xiàn)，大豆凝集素在pH值為7～8的中性環(huán)境中較穩(wěn)定；在含有Ca2+的溶液中大豆凝集素凝集活性最強(qiáng)；D-乙酰葡萄糖胺和D-乙酰乳糖胺是大豆凝集素的專一性抑制糖。

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Ultrasonic-Assisted Extraction and Properties of Lectin from Soybean Protein

ZHAO Yanyan, QIN Xinsheng, ZHU Shengwei, ZHENG Zhi*
(Key Laboratory for Agriculture Products Processing of Anhui Province, School of Biotechnology and Food Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China)

Response surface methodology (RSM) was employed to optimize the ultrasonic-assisted extraction of lectin from soybean protein. A regression model was developed to describe the yield of lectin from soybean protein as a function of 4 independent variables including ultrasonic irradiation time, extraction temperature, extraction time and liquid-to-solid ratio. The optimum extraction parameters were determined as follows: ultrasonic irradiation time, 38 min; extraction temperature, 32 ℃; extraction time, 5.6 h; and liquid-to-solid ratio, 10:1 (mL/g). Under these conditions, the yield of lectin was 9.82%, which was in good agreement with the result predicted by the model. The stability test showed that the optimal pH for the soybean lectin was 7–8. Ca2+played an important role in the agglutination reaction induced by it. The agglutination activity of the lectin could be inhibited by D-acetyl glucosamine and D-acetyl galactose amine.

soybean protein; lectin; ultrasonic; response surface methodology; stability

10.7506/spkx1002-6630-201610007

Q946.1

A

2015-09-07

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863計(jì)劃）項(xiàng)目（2013AA102201）；安徽省科技攻關(guān)項(xiàng)目（1301031031）

趙妍嫣（1972—），女，副教授，博士，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程。E-mail：zhaoyanyan@hfut.edu.cn

*通信作者：鄭志（1971—），男，教授，博士，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程。E-mail：zhengzhi@hfut.edu.cn