唐金明　王文祥★

缺氧對肺癌細(xì)胞BMPR-1A的表達(dá)及其運(yùn)動(dòng)侵襲能力的影響

唐金明王文祥★

目的 檢測肺癌細(xì)胞A549中BMPR-1A在常氧和缺氧條件下的表達(dá)； 探討兩種不同培養(yǎng)條件下BMPR-1A的不同表達(dá)情況及對肺癌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)侵襲能力的影響。方法 缺氧條件下培養(yǎng)人肺癌細(xì)胞A549，Western blot檢測HIF-1α、BMPR-1A的表達(dá)情況；同時(shí)，劃痕實(shí)驗(yàn)及Transwell實(shí)驗(yàn)檢測在常氧和缺氧條件下由于BMPR-1A 的差異性表達(dá)對肺癌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)侵襲能力的影響。結(jié)果 缺氧條件下刺激肺癌細(xì)胞24h后，HIF-1α蛋白表達(dá)明顯上升，BMPR-1A蛋白表達(dá)明顯下降； 劃痕實(shí)驗(yàn)及Transwell 實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示肺癌細(xì)胞接受缺氧刺激后其運(yùn)動(dòng)侵襲能力顯著增強(qiáng)。結(jié)論 缺氧增加肺癌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)侵襲的能力，該作用機(jī)制可能與缺氧導(dǎo)致BMPR-1A的表達(dá)下降有關(guān)。

缺氧 肺癌 BMPR-1A 運(yùn)動(dòng) 侵襲

骨成型蛋白家族（BMPs）是轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）家族的成員之一，BMPs作為保守蛋白在動(dòng)物及人類胚胎各系統(tǒng)的發(fā)育過程、腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用［1］。BMPs作為一種分泌型蛋白，其家族受體分為Ⅰ型和Ⅱ型，Ⅰ型受體包括BMPR1A、BMPR1B、ACVR1A，Ⅱ型受體包括ACVRIIA、ACVRIIB、BMPR2，不同受體介導(dǎo)特異性的信號通路［2］。BMPR1A在膽囊癌、胰腺癌、胃癌等惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，并且其表達(dá)水平受缺氧環(huán)境的調(diào)節(jié)［3-5］；研究證明BMPR1A在肺癌的發(fā)生中起重要作用，但是其在肺癌的侵襲轉(zhuǎn)移中的作用鮮有報(bào)道［6-7］。本研究檢測常氧與缺氧條件下肺癌細(xì)胞中BMPR1A的差異表達(dá)情況，通過劃痕及Transwell實(shí)驗(yàn)觀察其差異表達(dá)與肺癌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)及侵襲能力的關(guān)系。

1　材料與方法

1.1材料 人肺癌細(xì)胞A549 購自湘雅學(xué)院細(xì)胞中心，BMPR1A抗體（ab38560），HIF-1α抗體（ab51608），β-actin抗體（ab8229）購自Abcam公司，乏氧培養(yǎng)箱購自Thermo公司，Transwell小室購自Corning 公司，Matrigel生物膠購自BD公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法 （1）細(xì)胞培養(yǎng)液：含10%胎牛血清的1640 培養(yǎng)液，常氧培養(yǎng)條件：37℃、20% 氧氣、5%二氧化碳、75% 氮?dú)?；缺氧培養(yǎng)條件：37℃、1% 氧氣、5%二氧化碳、94%氮?dú)猓ǚρ跖囵B(yǎng)箱提供缺氧細(xì)胞培養(yǎng)的條件），常氧和缺氧條件下分別同時(shí)培養(yǎng)人肺癌細(xì)胞A549 24h。（2）蛋白印跡法（Western blot）：采用強(qiáng)裂解液提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，總上樣量為50μg，采用流程為：電泳（恒壓100V，90min）、轉(zhuǎn)膜（濕轉(zhuǎn)，恒壓120V，90min）、封閉（5%脫脂奶粉的TBST，常溫2h）、孵育一抗（4℃，過夜）、洗膜（5min×3次）、孵育二抗（常溫，2h）、洗膜（10min×3次）、ECL顯色。（3）劃痕試驗(yàn)：上述常氧及乏氧條件下培養(yǎng)細(xì)胞，重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)，六孔板內(nèi)加入約5×105個(gè)細(xì)胞，過夜鋪滿。用20μl槍頭劃痕，用PBS洗細(xì)胞3次，去除劃下的細(xì)胞，加入無血清培養(yǎng)基，分別放入常氧及乏氧培養(yǎng)箱培養(yǎng)。按0、12、24h取樣，攝照，計(jì)算細(xì)胞爬行的距離。（4）Transwell 侵襲試驗(yàn)：常氧和缺氧條件下將A549培養(yǎng)24h，消化細(xì)胞，PBS洗2遍，無血清培養(yǎng)基重懸。調(diào)整細(xì)胞密度至1×105個(gè)/ ml。取細(xì)胞懸液200μl加入至已鋪Matrigel膠的8μm孔徑Transwell小室上室，將600μl含20%胎牛血清的1640培養(yǎng)基加入下室，分別于常氧和缺氧條件下培養(yǎng)24h后，取出小室，棉簽小心擦去室內(nèi)未轉(zhuǎn)移細(xì)胞，4%多聚甲醛固定12min，結(jié)晶紫溶液染色15min，PBS 洗3 遍，顯微鏡下隨機(jī)取5個(gè)視野，細(xì)胞計(jì)數(shù)。（5）Transwell 遷移試驗(yàn)：Transwell 小室不進(jìn)行Matrigel膠包被，其余步驟同（4）。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1Western blot檢測缺氧對A549的MPR1A及HIF-1α蛋白表達(dá)的影響 Western blot結(jié)果顯示，在A549缺氧24h培養(yǎng)后，HIF-1α蛋白的表達(dá)水平明顯上升（P＜0.05），相反，MPR1A蛋白的表達(dá)水平明顯下降（P＜0.05）；見圖1。

圖1　常氧及乏氧條件培養(yǎng)下HIF-1α及MPR1A蛋白的表達(dá)水平（★P=0.0074，★★P=0.0060）

2.2劃痕試驗(yàn)檢測不同培養(yǎng)條件下細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測常氧及乏氧細(xì)胞24h后劃痕的寬度，以0h的寬度減24h的寬度作為爬行的距離，A549在24h乏氧培養(yǎng)條件下爬行的寬度大于常氧培養(yǎng)條件下爬行的寬度（P＜0.05），見圖2。

圖2　常氧及乏氧條件下細(xì)胞遷徙運(yùn)動(dòng)的寬度（★P=0.0008）

2.3Transwell 侵襲試驗(yàn)檢測不同培養(yǎng)條件下細(xì)胞遷徙能力 常氧及乏氧條件下細(xì)胞遷徙運(yùn)動(dòng)的能力（*P=0.0011），見圖3（×400）。

圖3　Transwell 侵襲試驗(yàn)檢測不同培養(yǎng)條件下細(xì)胞遷徙能力

2.4Transwell 遷移試驗(yàn)檢測不同培養(yǎng)條件下細(xì)胞侵襲能力 常氧及乏氧條件下細(xì)胞遷徙運(yùn)動(dòng)的能力（*P=0.0006），見圖4（×400）。

圖4　Transwell 遷移試驗(yàn)檢測不同培養(yǎng)條件下細(xì)胞侵襲能力

3　討論

侵襲轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致非小細(xì)胞肺癌患者死亡的主要原因，而腫瘤周圍微環(huán)境在腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移中扮演著重要角色［8］。腫瘤細(xì)胞周圍的低氧環(huán)境是腫瘤細(xì)胞微環(huán)境的重要組成部分之一，其能通過調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生長、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移及耐藥等促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展［9］。

骨形成蛋白受體1A是BMP家族受體之一，最早研究發(fā)現(xiàn)BMPR-1A通過與BMP家族蛋白結(jié)合，主要參與胚胎發(fā)育及骨形成，隨后發(fā)現(xiàn)其調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、分化以及遷移。研究發(fā)現(xiàn)，降低BMPR-1A的表達(dá)可促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌的增殖及阻礙凋亡［6-7］，缺氧環(huán)境中可下調(diào)胃癌細(xì)胞BMPR-1A的表達(dá)而促進(jìn)細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移［5］，在前列腺癌中發(fā)現(xiàn)可介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的發(fā)生及侵襲與轉(zhuǎn)移，并且其表達(dá)與轉(zhuǎn)移程度及浸潤深度成負(fù)相關(guān)［10］。但缺氧與肺癌細(xì)胞中的表達(dá)及其與肺癌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)侵襲能力的關(guān)系仍未見報(bào)道。

本研究通過乏氧培養(yǎng)非小細(xì)胞肺癌A549，檢測HIF-ɑ蛋白的表達(dá)驗(yàn)證成功構(gòu)建乏氧細(xì)胞模型。HIF-1是1992年Semenza等在研究紅細(xì)胞生成素（EPO）基因表達(dá)時(shí)發(fā)現(xiàn)的核轉(zhuǎn)錄因子，由HIF-1α及HIF-1β亞單位構(gòu)成［11］，HIF-1α只在缺氧細(xì)胞核中表達(dá)且與多種腫瘤發(fā)展密切相關(guān)，故可作為缺氧細(xì)胞模型構(gòu)建成功的標(biāo)志物［12］。Ei Bizri N等［13］報(bào)道，其在缺氧的血管壁中表達(dá)明顯下調(diào)的，可促進(jìn)肺動(dòng)脈壓力增高及其他變化。在腫瘤中，BMPR-1的表達(dá)與HIF-1α表達(dá)的關(guān)系不明確，本資料結(jié)果顯示BMPR-1的表達(dá)水平隨HIF-1α表達(dá)水平的升高而降低，具體機(jī)制需要進(jìn)一步探討。進(jìn)一步觀察缺氧條件下BMPR-1A低表達(dá)對肺癌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)侵襲過程的影響，劃痕實(shí)驗(yàn)及Transwell遷移實(shí)驗(yàn)證明缺氧條件下肺癌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)及遷移能力明顯強(qiáng)于常氧條件下的肺癌細(xì)胞，同時(shí)，Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)也證明缺氧培養(yǎng)下的肺癌細(xì)胞侵襲能力顯著增強(qiáng)。

綜上所述，缺氧條件下BMPR-1A的下降可能促進(jìn)肺癌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)和侵襲。分析缺氧條件下BMPR-1A調(diào)節(jié)肺癌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)及侵襲的分子機(jī)制，可作為肺癌侵襲轉(zhuǎn)移的標(biāo)志及靶向治療的依據(jù)。缺氧作為腫瘤生長的微環(huán)境，受復(fù)雜的分子網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)，缺氧導(dǎo)致腫瘤的侵襲和遷移能力增強(qiáng)不僅是BMPR-1A單一個(gè)分子所決定的，需要進(jìn)一步研究闡明BMPR-1A在缺氧條件下促進(jìn)肺癌細(xì)胞遷移侵襲過程中與其他因子的關(guān)系，為肺癌的防治提供進(jìn)一步的理論依據(jù)。

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Objective To explore the expression of BMPR-1A in the human lung cancer cells A549 under normoxia and hypoxia，and investigate the infl uence of the different expression of BMPR-1A under normoxia and hypoxia on the migration and invasion in human lung cancer cells. Methods The lung cancer cells A549 was cultured in normoxic condition and hypoxic condition，The protein levels of HIF-1αand BMPR-1A were determined by Western blot. Infl uence of different expression of BMPR-1A under normoxia and hypoxia on the migration and invasion of A549 was detected via using Wound-repair and Transwell. Results The results of Western blot showed that BMPR-1A was expressed down-regulated and HIF-1α was expressed up-regulated after A549 exposed to hypoxia for 24h； Wound-repair and Transwell assay showed that the migratory and invasive ability were enhanced when the lung cancer cells were exposed to hypoxia for 24h. Conclusions Hypoxia could enhance the migratory and invasive ability of lung cancer cells via down-regulating BMPR-1A.

Hypoxia Lung cancer BMPR-1A migration Invasion

410006湖南省腫瘤醫(yī)院（中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院）