徐巧玲，吳學(xué)軍，姜文清，鄺詠梅，金鵬飛，蔡小兵

(1.解放軍第三○五醫(yī)院，北京100017；2.北京醫(yī)院藥學(xué)部；3.中央軍委聯(lián)合參謀部警衛(wèi)局衛(wèi)生保健處)

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應(yīng)用高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)器篩查中藥及保健品中糖皮質(zhì)激素類非法添加劑

徐巧玲1，吳學(xué)軍2，姜文清2，鄺詠梅2，金鵬飛2，蔡小兵3

(1.解放軍第三○五醫(yī)院，北京100017；2.北京醫(yī)院藥學(xué)部；3.中央軍委聯(lián)合參謀部警衛(wèi)局衛(wèi)生保健處)

目的 探討應(yīng)用高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)器(HPLC-DAD)技術(shù)建立中藥及保健品中非法添加氫化可的松琥珀酸鈉、潑尼松龍、氫化可的松、潑尼松、甲潑尼龍、倍他米松、地塞米松、曲安奈德、醋酸潑尼松龍、醋酸氫化可的松、醋酸氟氫可的松、醋酸潑尼松、醋酸可的松、醋酸地塞米松、丁酸氫化可的松、醋酸曲安奈德、醋酸氟輕松和哈西奈德等18種糖皮質(zhì)激素類添加劑成分的檢查方法。方法 采用Alltima C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相為乙腈-10 mmol/L醋酸銨二元梯度洗脫，流速為0.5 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)242 nm。對(duì)于HPLC-DAD檢出的疑似陽(yáng)性樣品用液相色譜-質(zhì)譜法(LC-MS/MS)進(jìn)行進(jìn)一步確認(rèn)。結(jié)果 氫化可的松和潑尼松的色譜峰重疊，其他16種糖皮質(zhì)激素在5～320 mg/L內(nèi)線性關(guān)系良好，線性相關(guān)系數(shù)(r)均大于0.9998；靈敏度高，最低檢測(cè)限均在0.49～0.51 ng 之間，定量限均在1.23～1.27 ng之間；回收率良好，低、中、高3個(gè)濃度的回收率均在97.52%～104.2%之間；精密度良好，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均小于0.47%；穩(wěn)定性良好，12 h內(nèi)峰面積和保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均小于0.68%。14種不同劑型的樣品通過(guò)HPLC-DAD檢查和LC-MS/MS確認(rèn)，結(jié)果顯示：某片劑中檢測(cè)出醋酸地塞米松，某噴霧劑中檢出倍他米松。結(jié)論 HPLC-DAD技術(shù)應(yīng)用快速、靈敏、易推廣，可作為篩查藥品及保健品中非法添加18種糖皮質(zhì)激素的檢查方法。

氣相色譜-質(zhì)譜法；糖皮質(zhì)激素類；中草藥；營(yíng)養(yǎng)保健品

糖皮質(zhì)激素是由腎上腺皮質(zhì)最中層束狀帶分泌的一種代謝調(diào)節(jié)激素，具有調(diào)節(jié)糖、脂肪和蛋白質(zhì)的生物合成和代謝的作用，臨床上應(yīng)用于內(nèi)分泌代謝病、感染性疾病、血液病、心血管疾病、風(fēng)濕免疫病、呼吸疾病等的治療[1-2]。但不適當(dāng)?shù)氖褂每蓪?dǎo)致多種不良反應(yīng)，引起代謝紊亂。一些中藥制劑中非法添加糖皮質(zhì)激素，使患者短期內(nèi)病情得到改善，但會(huì)對(duì)健康造成嚴(yán)重威脅。目前，檢測(cè)藥品和保健品中糖皮質(zhì)激素的方法主要有TLC法、HPLC法、LC-MS/MS法、UPLC-MS/MS法或幾種方法的聯(lián)用[3-17]，但檢測(cè)的添加劑種類都在14種之內(nèi)，不能涵蓋常用的糖皮質(zhì)激素藥物種類。為更為快速、簡(jiǎn)便、廣泛地檢測(cè)中藥和保健品中非法添加的糖皮質(zhì)激素，本文采用HPLC-DAD快速篩查結(jié)合LC-MS/MS確認(rèn)的方法建立了各類基質(zhì)的中藥和保健品中18種糖皮質(zhì)激素類添加劑的檢查方法。

1 儀器與試藥

Agilent 1260 Infinity液相色譜分離系統(tǒng)(包括四元梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器和柱溫箱)、Agilent 1260 二極管陣列檢測(cè)器、OpenLAB工作站；Mettler XP -205 十萬(wàn)分之一電子天平(瑞士，梅特勒公司)；KQ—800KDE 型超聲儀(昆山市超聲儀器有限公司)；MilliQ 2150 型超純水器。乙腈、四氫呋喃為色譜純，醋酸銨為分析純。

氫化可的松琥珀酸鈉對(duì)照品(批號(hào)：100362-200501)、潑尼松龍對(duì)照品(批號(hào)：100153-199603)、氫化可的松對(duì)照品(批號(hào)：100152-200206)、潑尼松對(duì)照品(批號(hào)：100199-199401)、甲潑尼龍對(duì)照品(批號(hào)：100828-200501)、倍他米松對(duì)照品(批號(hào)：100118-200403)、地塞米松對(duì)照品(批號(hào)：100129-201105)、曲安奈德對(duì)照品(批號(hào)：100055-201103)、醋酸潑尼松龍對(duì)照品(批號(hào)：100124-200303)、醋酸氫化可的松對(duì)照品(批號(hào)：100013-200106)、醋酸氟氫可的松對(duì)照品(批號(hào)：100009-200704)、醋酸潑尼松對(duì)照品(批號(hào)：100012-200706)、醋酸可的松對(duì)照品(批號(hào)：100123-200303)、醋酸地塞米松對(duì)照品(批號(hào)：100122-200805)、丁酸氫化可的松對(duì)照品(批號(hào)：100303-200101)、醋酸曲安奈德對(duì)照品(批號(hào)：100125-200404)、醋酸氟輕松對(duì)照品(批號(hào)：100010-201108)和哈西奈德對(duì)照品(批號(hào)：100146-9502)均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。

檢測(cè)樣品：膠囊劑3種，其中國(guó)藥準(zhǔn)字2種，衛(wèi)食健字1種；片劑6種，其中國(guó)藥準(zhǔn)字4種，國(guó)食健字1種，衛(wèi)食健字1種；國(guó)藥準(zhǔn)字丸劑3種；國(guó)藥準(zhǔn)字口服液1種；進(jìn)口注冊(cè)的氣霧劑1種。

2 方法

2.1 色譜條件 色譜柱：Alltima C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：10 mmol/L醋酸銨(A)—乙腈(B)二元梯度洗脫，洗脫程序見(jiàn)表1；流速：0.5 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序

2.2 混合儲(chǔ)備液的制備 精密稱取氫化可的松琥珀酸鈉、潑尼松龍、氫化可的松、潑尼松、甲潑尼龍、倍他米松、地塞米松、曲安奈德、醋酸潑尼松龍、醋酸氫化可的松、醋酸氟氫可的松、醋酸潑尼松、醋酸可的松、醋酸地塞米松、丁酸氫化可的松、醋酸曲安奈德、醋酸氟輕松和哈西奈德對(duì)照品各約32 mg于50 mL量瓶中，加入甲醇30 mL溶解，加水定容至刻度，搖勻，即得。

2.3 混合對(duì)照液的制備 分別精密量取混合儲(chǔ)備液適量，用60%甲醇溶液稀釋成18種成分質(zhì)量濃度分別約為5、10、20、40、80、160、320 mg/L的混合對(duì)照品溶液應(yīng)用于考察氫化可的松琥珀酸鈉、潑尼松龍、甲潑尼龍、倍他米松、地塞米松、曲安奈德、醋酸潑尼松龍、醋酸氫化可的松、醋酸氟氫可的松、醋酸潑尼松、醋酸可的松、醋酸地塞米松、丁酸氫化可的松、醋酸曲安奈德、醋酸氟輕松和哈西奈德等16種成分的線性。其中質(zhì)量濃度約為40 mg/L的混合對(duì)照品溶液作為混合對(duì)照品工作液用于系統(tǒng)適應(yīng)性研究和實(shí)際樣品的篩查。

2.4 供試品溶液的制備 膠囊劑：取內(nèi)容物10粒，研細(xì)，混勻，精密稱取約一次服用量，置50 mL量瓶中，加入甲醇30 mL，震蕩1 min使分散，超聲15 min，加水定容至刻度，搖勻，即得?？诜海喝?支口服液混勻，精密量取1支量于50 mL量瓶中，加入甲醇30 mL，加水定容至刻度，搖勻，即得。丸劑：將丸劑壓扁至薄片狀，先用剪刀剪成細(xì)條進(jìn)而剪成粒狀，研細(xì)，精密稱取約2 g，置50 mL量瓶中，加入甲醇30 mL，震蕩1 min使分散，超聲25 min(部分不易分散樣品可浸泡過(guò)夜并增加超聲時(shí)間)，加水定容至刻度，搖勻，即得。片劑：取10片，研細(xì)，混勻，精密稱取約一次服用量，置50 mL量瓶中，加入甲醇30 mL，震蕩1 min使分散，超聲15 min，加水定容至刻度，搖勻，即得。氣霧劑：精密量取噴出液體10 mL到50 mL量瓶中，加入甲醇20 mL，加水定容至刻度，搖勻，即得。所有供試品溶液進(jìn)樣前，都用0.22 μm 孔徑微孔濾膜濾過(guò)。

2.5 樣品的檢測(cè)及判定

2.5.1 18種糖皮質(zhì)激素的初篩 分別對(duì)混合對(duì)照品工作液和供試品溶液進(jìn)樣分析，通過(guò)綜合比對(duì)供試品溶液和混合對(duì)照品工作液中色譜峰的保留時(shí)間和紫外圖譜初步判定可疑樣品。

2.5.2 加標(biāo)實(shí)驗(yàn) “2.5.1”中判定為可疑的樣品中加入適量疑似添加成分的對(duì)照品溶液，考察樣品和對(duì)照品色譜峰是否完全重合、紫外圖譜是否有變化，如色譜峰完全重合且紫外圖譜未見(jiàn)變化則初步判定為陽(yáng)性樣品。配制和陽(yáng)性樣品中檢出成分峰面積接近的對(duì)照品溶液，外標(biāo)法計(jì)算陽(yáng)性樣品中檢出成分的含量。

2.5.3 質(zhì)譜確認(rèn) 對(duì)初步判定為陽(yáng)性的樣品在同等的色譜條件下用LC-MS/MS進(jìn)行確認(rèn)，對(duì)比色譜峰質(zhì)譜圖和標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)譜圖的相似性，相似性大于70%的判定為陽(yáng)性樣品。

2.6 陰性空白溶液的制備 將不含上述18種糖皮質(zhì)激素的某國(guó)藥準(zhǔn)字鎮(zhèn)痛中成藥按照“2.4”的方法制備得到的供試品溶液作為陰性空白溶液。

3 結(jié)果

3.1 方法選擇性 分別考察了混合對(duì)照品工作液、陰性空白溶液和供試品溶液的色譜圖。結(jié)果顯示：陰性空白樣品的主要色譜峰都在9 min之前，不干擾18種糖皮質(zhì)激素的篩查。典型色譜圖見(jiàn)圖1。氫化可的松和潑尼松的色譜峰完全重合，對(duì)于這兩種成分的疑似陽(yáng)性樣品只能通過(guò)LC-MS/MS進(jìn)行確認(rèn)。

3.2 系統(tǒng)適應(yīng)性，最低檢測(cè)限、定量限和線性 混合對(duì)照品工作液連續(xù)進(jìn)樣6次，考察除氫化可的松和潑尼松外16種成分色譜峰的理論塔板數(shù)、對(duì)稱因子和分離度。將對(duì)照品溶液逐級(jí)稀釋，以信噪比(S/N)約為3.0時(shí)的濃度為各成分的最低檢測(cè)限，信噪比(S/N)約為10.0時(shí)的濃度為各成分的定量限。以各成分的質(zhì)量濃度(mg/L)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，在5～320 mg/L內(nèi)進(jìn)行線性考察。結(jié)果(表2)顯示：16種成分的理論塔板數(shù)均大于10 000，對(duì)稱因子均在0.76～1.01之間，分離度均大于1.3，表明方法具有良好的系統(tǒng)適應(yīng)性；線性相關(guān)系數(shù)均在0.9999～1.0000之間，表明方法具有良好的線性；最低檢測(cè)限均在0.49～0.51 ng 之間，定量限均在1.23～1.27 ng之間，表明方法具有良好的靈敏度。

注：混合對(duì)照品工作液(A)、陰性空白溶液(B)、醋酸地塞米松陽(yáng)性樣品(C)和醋酸地塞米松陽(yáng)性樣品+醋酸地塞米松(D)的典型色譜圖。1.氫化可的松琥珀酸鈉;2.潑尼松龍;3.氫化可的松;4.潑尼松;5.甲潑尼龍;6.倍他米松;7.地塞米松;8.曲安奈德 ;9.醋酸潑尼松龍;10.醋酸氫化可的松;11.醋酸氟氫可的松;12.醋酸潑尼松;13.醋酸可的松;14.醋酸地塞米松 ;15.丁酸氫化可的松;16.醋酸曲安奈德;17.醋酸氟輕松;18.哈西奈德

圖1 混合對(duì)照品工作液、陰性空白溶液和供試品溶液的典型色譜圖

3.3 回收率、精密度和穩(wěn)定性 取約相當(dāng)于一次服用量的陰性空白樣品18份，置于50 mL量瓶中，分別精密加入混合對(duì)照品儲(chǔ)備液(640 mg/L)、混合對(duì)照品溶液(160 mg/L)、混合對(duì)照品溶液(40 mg/L)各12.5 mL，按照“2.4”項(xiàng)下規(guī)定，用60%甲醇制備供試品溶液，每個(gè)濃度水平分別制備6份，進(jìn)樣分析，以峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算測(cè)得量，以測(cè)得量和加入量的比值作為方法回收率，以比值的RSD作為方法精密度。結(jié)果(見(jiàn)表3)顯示：低、中、高加樣濃度下，16種成分回收率均在97.5%～104.2% 之間，RSD均小于0.46%，表明方法回收率和精密度良好。另取低、中、高3種濃度的溶液分別于0、2、4、6、12 h進(jìn)樣分析，18種成分色譜峰峰面積的RSD(n=5)均小于0.68%，色譜峰保留時(shí)間的RSD(n=5)均小于0.35%，表明12 h內(nèi)方法穩(wěn)定性良好。

3.4 實(shí)際樣品篩查 應(yīng)用本實(shí)驗(yàn)建立的方法對(duì)14種中藥制及保健品進(jìn)行了18種糖皮質(zhì)激素的篩查。在一種標(biāo)注國(guó)藥準(zhǔn)字號(hào)的抗炎片劑中檢測(cè)到了保留時(shí)間和紫外圖譜與醋酸地塞米松完全一致的色譜峰，加標(biāo)實(shí)驗(yàn)中該色譜峰和醋酸地塞米松色譜峰也完全重復(fù)(見(jiàn)圖1)，LC-MS/MS確認(rèn)該色譜峰和醋酸地塞米松對(duì)照品的質(zhì)譜相似度大于70%，因而判定為醋酸地塞米松陽(yáng)性樣品，含量為128.1 微克/片。同法判定另一種標(biāo)注進(jìn)口注冊(cè)號(hào)的抗炎氣霧劑為倍他米松陽(yáng)性樣品，含量為13.57 μg/mL。其他樣品中未檢出上述18種糖皮質(zhì)激素。

4 討論

4.1 流動(dòng)相的選擇 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中考察了乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸溶液、乙腈-甲醇-水、乙腈-磷酸二氫銨、甲醇-磷酸二氫銨、乙腈-醋酸銨、甲醇-醋酸銨等多個(gè)流動(dòng)相系統(tǒng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙腈-磷酸二氫銨系統(tǒng)和乙腈-醋酸銨系統(tǒng)的分離度較好，但考慮到乙腈-醋酸銨系統(tǒng)可作為質(zhì)譜的流動(dòng)相，有利于進(jìn)一步的確認(rèn)，因而選擇乙腈-醋酸銨系統(tǒng)作為流動(dòng)相。在對(duì)醋酸銨緩沖液的pH值和濃度的優(yōu)化中發(fā)現(xiàn)：10 mM醋酸銨溶液用氨水調(diào)至pH7.5的分離效果最佳，但由于該溶液中的氨易揮發(fā)，存放過(guò)程中易出現(xiàn)pH下降的情況，影響保留時(shí)間的穩(wěn)定性。直接使用10 mM醋酸銨溶液配制更為方便，穩(wěn)定性更好，分離度雖稍差，但也均大于1.3，能滿足篩查的需要。但在上述各種色譜條件下，潑尼松和氫化可的松仍無(wú)法分離，下一步需要進(jìn)一步優(yōu)化色譜條件實(shí)現(xiàn)2種成分的完全分離。

4.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 18種糖皮質(zhì)激素化學(xué)結(jié)構(gòu)類似，其紫外最大吸收峰均在239～247 nm范圍內(nèi)，故選擇242 nm作為最終的檢測(cè)波長(zhǎng)。

4.3 樣品提取方法的選擇 18種糖皮質(zhì)激素在甲醇中的溶解度很好，易于提取，但峰形很差。本實(shí)驗(yàn)采用60%甲醇溶液進(jìn)行提取，有效地改善了峰形。超聲優(yōu)化中發(fā)現(xiàn)，不同的劑型所需的時(shí)間不同，一般制劑15 min就能完全提取，有些丸劑則需要25 min甚至更長(zhǎng)時(shí)間。

4.4 樣品篩查的注意點(diǎn) 該色譜系統(tǒng)下，用HPLC-DAD進(jìn)行檢查時(shí)，所有糖皮質(zhì)激素的出峰時(shí)間都在9～60 min內(nèi)，而絕大多數(shù)中藥本身含有的化學(xué)成分多集中在9 min之前出峰，很容易從保留時(shí)間上和添加的糖皮質(zhì)激素進(jìn)行區(qū)分，對(duì)于個(gè)別9 min后仍集中出峰的樣品，可適當(dāng)調(diào)整乙腈-緩沖液比例和各梯度水平的保持時(shí)間等梯度參數(shù)。

5 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立的檢查方法具有快速、靈敏、易推廣的特點(diǎn)，可應(yīng)用于中藥和保健品中非法添加氫化可的松琥珀酸鈉、潑尼松龍、氫化可的松、潑尼松、甲潑尼龍、倍他米松、地塞米松、曲安奈德、醋酸潑尼松龍、醋酸氫化可的松、醋酸氟氫可的松、醋酸潑尼松、醋酸可的松、醋酸地塞米松、丁酸氫化可的松、醋酸曲安奈德、醋酸氟輕松和哈西奈德的篩查。對(duì)于不具備LC-MS/MS的單位，僅憑本文建立的HPLC-DAD法也可初步實(shí)現(xiàn)對(duì)中藥和保健品中上述18種糖皮質(zhì)激素的篩查。

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Detection of glucocorticoids illegally adulterated into traditional chinese medicines and health foods by HPLC-DAD

XuQiaoling*,WuXuejun,JiangWenqing,KuangYongmei,JinPengfei,CaiXiaobing

(*The305thHospitalofthePLAofChina,Beijing100017,China)

CaiXiaobing，Email：caixiaobing5757@hotmail.com

Objective To detect 18 glucocorticoids (hydrocortisone sodium succinate,prednisolone,hydrocortisone,prednisone,methylprednisolone,betamethasone,dexamethasone,triamcinolone acetonide,prednisolone acetate,hydrocortisone,fludrocortisone acetate,prednisone acetate,cortisone acetate,dexamethasone acetate,hydrocortisone butyrate,triamcinolone acetonide acetate,fluocinonide,halcinonide) illegally adultered into Traditional Chinese Medicines and health foods by establish an HPLC-DAD method.Methods An Alltima C18column(4.6 mm×250 mm，5 μm)was used for the separations,The mobile phase were consisted of acetonitrile - 10 mmol/L ammonium acetate solution by gradient elution.The flow rate was 0.5 mL/min.The column temperature was 30 °C.The detection wavelength was 242 nm,Suspicious samples were confirmed by LC-MS/MS.Results The peaks of hydrocortisone and prednisone were overlapped,the linearity and sensitivity for other 16 glucocorticoids were fine with all correlation coeffcients (r) bigger than 0.9998 and all LODs between 0.49～0.51 ng,The spiked recoveries of low,middle and high levels ranged from 97.5% to 104.2%;the precisions were satisfactory with all RSDs<0.47%；the stability within 12h was acceptable with the RSDs of peak areas and retention times no more than 0.68% and 0.35%,Fourteen Traditional Chinese Medicines and health foods were test by HPLC-DAD and LC-MS/MS,and the result showed:dexamethasone acetate was found in a tablet sample,while betamethasone was found in a spray sample.Conclusion HPLC-DAD is fast and sensitive method for the detection of 18 glucocorticoids illegally adulterated into Traditional Chinese Medicines and health foods.

Mass spectrometry；Glucocorticoids；Drugs,Chinese herbal；Dietary supplements

中央保健科研課題專項(xiàng)資金(B2009B032)

徐巧玲，副主任藥師，Email：xuqiaoling305@163.com

蔡小兵，主任藥師，Email：caixiaobing5757@hotmail.com

R35-33

A

10.3969/J.issn.1672-6790.2016.06.003

2016-07-11)