陳 浩,王桂榮,劉同杰,何國慶

(1.浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院,浙江杭州 210058;2.浙江省杭州市原種場,浙江杭州 311115)

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雙菌發(fā)酵豆豉工藝條件篩選

陳 浩,王桂榮,劉同杰,何國慶

(1.浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院,浙江杭州 210058;2.浙江省杭州市原種場,浙江杭州 311115)

本文采用米曲霉和黑曲霉菌粉混合發(fā)酵制作豆豉,分別以蛋白酶活力和氨基態(tài)氮含量為測定指標(biāo),通過單因素實(shí)驗(yàn)確定了豆豉制曲和發(fā)酵條件。結(jié)果表明,制曲條件為每1 kg黃豆接種菌粉15 g,米曲霉∶黑曲霉的用量比=4∶1,溫度30 ℃,相對濕度75%,制曲48 h,最終蛋白酶活力可以達(dá)到1033 u/g;發(fā)酵條件為每1 kg豆豉曲加入500 mL無菌水和50 g食鹽,溫度45 ℃,相對濕度65%,發(fā)酵11 d后氨基態(tài)氮含量達(dá)到2.1 g/100 g。

豆豉,制曲,發(fā)酵,工藝參數(shù)

豆豉是我國傳統(tǒng)的發(fā)酵豆制品,由于其豐富的營養(yǎng)和獨(dú)特的風(fēng)味深受廣大消費(fèi)者的喜愛。特別是在南方,既做菜肴,又作為調(diào)味品被廣泛食用。由于微生物發(fā)酵作用,不僅含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物、維生素和礦物質(zhì)等營養(yǎng)成分[1],還形成了豐富的多肽、氨基酸、寡糖、單糖等,更容易被人體吸收,促進(jìn)消化,適合于腸胃吸收障礙的人群、消化能力減退的老人和消化不良的兒童食用。

由于地域差異,所利用的微生物也不盡相同,主要有曲霉型豆豉[2-3],如湖南瀏陽豆豉;細(xì)菌型豆豉,如利用納豆芽孢桿菌生產(chǎn)的日本納豆[4];毛霉型豆豉,如重慶的永川豆豉[5];根霉型豆豉,如印尼的天培[6]。目前普遍采取的單菌種制曲生產(chǎn)豆豉,參與發(fā)酵的微生物較少,分泌的酶種類不全,常使豆豉成品的風(fēng)味不及傳統(tǒng)發(fā)酵的豆豉,此研究利用多菌種發(fā)酵生產(chǎn)豆豉以提高其品質(zhì)具有重要意義。同時(shí),由于傳統(tǒng)工藝制作豆豉主要是在自然條件下發(fā)酵,豆豉制曲和發(fā)酵時(shí)間一般較長,而且豆豉的生產(chǎn)還受到季節(jié)的限制,大部分豆豉都是在氣溫較高的夏季制作的,并不能常年生產(chǎn),因此嚴(yán)重影響了企業(yè)廠房的利用、豆豉的市場供求和生產(chǎn)規(guī)模的擴(kuò)大,增加了生產(chǎn)成本。故本文對影響曲霉型豆豉制曲和發(fā)酵工藝因素進(jìn)行研究,以提高豆豉的品質(zhì),縮短豆豉的制作周期。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃豆 黑龍江五常大豆;米曲霉(滬釀3.042)、黑曲霉(As 3.350)菌粉 山東沂源康源生物科技有限公司;福林(Folin)試劑、三氯乙酸、乙酸、乙酸鈉、碳酸鈉、L-酪氨酸、氫氧化鈉、鹽酸、甲醛 分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

BSA124S型電子分析天平 賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司;YXQ-LS-立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;CTHI-250B恒溫恒濕培養(yǎng)箱 施都凱儀器設(shè)備(上海)有限公司;SJB-CJ-1FX超凈工作臺(tái) 蘇州佳寶凈化工程設(shè)備有限公司;PB-10型酸度計(jì) 賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司;MULTISKAN GO酶標(biāo)儀 Thermo Scientific公司;86-1型磁力攪拌器 上海司樂儀器有限公司;FSH-2A型勻漿機(jī) 江蘇金元市醫(yī)療儀器廠;TG16-WS臺(tái)式高速離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 豆豉制作工藝流程 黃豆→浸泡→蒸煮→接種→制曲→添加食鹽、水→發(fā)酵→曬干→調(diào)味→產(chǎn)品

挑選顆粒飽滿的黃豆,以大豆質(zhì)量3倍的30 ℃溫水浸泡4 h,瀝干后置于高壓蒸煮鍋內(nèi)121 ℃蒸煮20 min,冷卻至室溫,按一定的接種量接種菌粉,放入恒溫恒濕培養(yǎng)箱中,在一定的溫度和濕度條件制曲一定時(shí)間,制曲完成后裝入廣口玻璃瓶中,加入一定質(zhì)量的食鹽和一定體積的無菌水,在一定的條件下發(fā)酵一段時(shí)間,發(fā)酵完成后烘干得到干豆豉,后續(xù)加入其它香辛料進(jìn)行調(diào)配即可得到產(chǎn)品。

1.2.2 豆豉制曲工藝條件參數(shù)篩選 以蛋白酶活力為指標(biāo),對菌粉配比、接種量、制曲溫度、相對濕度和制曲時(shí)間等因素進(jìn)行評估。

1.2.2.1 菌粉配比 挑選飽滿的原料大豆100 g,用清水洗干凈,然后加入300 mL,30 ℃的水浸泡4 h,瀝干后接入1 g菌粉(接種量1.0%,w/w),其中米曲霉和黑曲霉菌粉配比設(shè)置為5∶0、4∶1、3∶2、2∶3,在溫度為30 ℃、相對濕度75%的條件下制曲60 h后測定蛋白酶活力。

1.2.2.2 接種量 挑選飽滿的原料大豆100 g,用清水洗干凈,然后加入300 mL、30 ℃的水浸泡4 h,瀝干后按前一步篩選后的菌粉配比進(jìn)行接種,接種量為2.0%、1.5%、1.0%、0.5%,在溫度為30 ℃、相對濕度75%的條件下制曲60 h后測定蛋白酶活力。

1.2.2.3 溫度 挑選飽滿的原料大豆100 g,用清水洗干凈,然后加入300 mL、30 ℃的水浸泡4 h,瀝干后按照篩選的菌粉配比和接種量進(jìn)行接種,溫度設(shè)置為25、30、35、40 ℃,相對濕度75%的條件下制曲60 h后測定蛋白酶活力。

1.2.2.4 相對濕度 挑選飽滿的原料大豆100 g,用清水洗干凈,然后加入300 mL、30 ℃的水浸泡4 h,瀝干后按篩選的菌粉配比、接種量和發(fā)酵溫度進(jìn)行接種,相對濕度設(shè)置為65%、70%、75%、80%和85%,制曲60 h后測定蛋白酶活力。

1.2.2.5 時(shí)間 挑選飽滿的原料大豆100 g,用清水洗干凈,然后加入300 mL,30 ℃的水浸泡4 h,瀝干后按上述篩選的工藝參數(shù)進(jìn)行制曲,分別在12、24、36、48、60和72 h后取樣測定蛋白酶活力。

1.2.3 豆豉發(fā)酵工藝條件參數(shù)篩選 以氨基態(tài)氮含量為指標(biāo),對發(fā)酵溫度、相對濕度、含水量、加鹽量、發(fā)酵時(shí)間等因素進(jìn)行評估。

1.2.3.1 溫度 大豆制曲完成后,每100 g加入15%的食鹽水40 mL,其中發(fā)酵溫度設(shè)置為30、37、45、50 ℃,相對濕度為75%的條件下發(fā)酵,測定氨基態(tài)氮含量。

1.2.3.2 相對濕度 大豆制曲完成后,每100 g加入15%的食鹽水40 mL,相對濕度分別設(shè)置為65%、75%、85%,在上一步篩選出的溫度條件下發(fā)酵,測定氨基態(tài)氮含量。

1.2.3.3 含水量 大豆制曲完成后,每100 g豆豉分別加入25、50、75、100 mL 15%的食鹽水,在前兩步篩選的溫度和濕度條件下發(fā)酵,測定氨基態(tài)氮含量。

1.2.3.4 加鹽量 大豆制曲完成后,每100 g豆豉曲加入50 mL水,分別加入2.5、5、7.5、10 g的食鹽,按上述篩選的工藝參數(shù)發(fā)酵,測定氨基態(tài)氮含量。

1.2.3.5 時(shí)間 大豆制曲完成后,按上述篩選的工藝參數(shù)發(fā)酵,每天測定氨基態(tài)氮含量。

1.3 指標(biāo)的測定方法

1.3.1 蛋白酶活力的測定 按GB/T 23527-2009進(jìn)行[7]。

1.3.2 氨基態(tài)氮含量的測定[8]樣品制備:稱取5 g(記為m)樣品于200 mL燒杯中,加入50 mL蒸餾水,用勻漿機(jī)打碎,轉(zhuǎn)入離心管中,在3500 r/min的條件下離心15 min,將上清液移入100 mL容量瓶中,再加10 mL蒸餾水于離心管沉淀中,搖勻并再次離心,上清液倒入容量瓶中,此操作反復(fù)3次,最后用蒸餾水定容至100 mL,混勻。

樣品測定:吸取10 mL樣品液于200 mL燒杯中,加入60 mL蒸餾水,用0.05 mol/L的NaOH溶液滴定至pH8.2,加入10 mL甲醛溶液混勻,再用0.05 mol/L的NaOH滴定至pH9.2,記下pH從8.2到9.2消耗的NaOH體積V1;空白實(shí)驗(yàn)只需要將樣品換成10 mL蒸餾水,記下消耗的NaOH體積V2,氨基態(tài)氮含量(X)的計(jì)算公式如下:

1.4 數(shù)據(jù)處理

本文數(shù)據(jù)處理采用Microsoft Office Excel 2013,所有測定均平行進(jìn)行3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 制曲工藝條件參數(shù)的確定

2.1.1 菌粉配比對豆豉制曲蛋白酶活力的影響 由圖1可知,當(dāng)米曲霉和黑曲霉菌粉的配比為4∶1時(shí),制曲所產(chǎn)的蛋白酶活力最高。米曲霉滬釀3.042作為釀造動(dòng)力微生物,其產(chǎn)酶豐富,如蛋白酶、肽酶、淀粉酶、纖維素酶等[9],這些酶系對豆豉制作發(fā)揮著不同作用,其中蛋白酶是關(guān)鍵酶。米曲霉產(chǎn)中性蛋白酶能力較強(qiáng),而豆豉發(fā)酵是在中性和偏酸性的環(huán)境,而米曲霉產(chǎn)酸性蛋白酶的能力相對較弱,所以添加一定的黑曲霉可以互補(bǔ)[10],但黑曲霉產(chǎn)蛋白酶能力相對米曲霉弱些,故當(dāng)米曲霉和黑曲霉菌粉的配比為4∶1時(shí),制曲所產(chǎn)的蛋白酶活力最高。

圖1 米曲霉與黑曲霉菌粉配比對豆豉制曲蛋白酶活力的影響Fig.1 Effect of different proportion between Aspergillus oryzae and Aspergillus niger on protease activity in koji-making

2.1.2 接種量對豆豉制曲蛋白酶活力的影響 由圖2可知,隨著接種量的增加,蛋白酶活力逐漸增加,在接種量為1.5%達(dá)到最大,但當(dāng)接種量進(jìn)一步增加時(shí),蛋白酶活力卻反而下降,可能是因?yàn)榻臃N量太大,微生物生長過多,從而產(chǎn)生的溫度要高于微生物最適生長溫度,以及受于可被利用的營養(yǎng)物質(zhì)的限制。所以確定1.5%的接種量為最佳接種量。

圖2 接種量對豆豉制曲蛋白酶活力的影響Fig.2 Effect of inoculum size on protease activity in koji-making

圖3 溫度對豆豉制曲蛋白酶活力的影響Fig.3 Effect of culture temperature on protease activity in koji-making

2.1.3 制曲溫度對豆豉制曲蛋白酶活力的影響 由圖3可知,隨著發(fā)酵溫度逐漸升高,豆豉曲蛋白酶活力逐漸升高,在35 ℃時(shí)酶活達(dá)到最大,但隨著溫度進(jìn)一步增加,酶活力急劇下降。霉菌最適生長的溫度一般在室溫左右,溫度過低不利于微生物的生長及代謝,溫度過高容易產(chǎn)生“燒曲”現(xiàn)象,不利于微生物生長,且易使酶失活。30 ℃和35 ℃制曲產(chǎn)生的酶活相差不大,從環(huán)保節(jié)能的角度選擇30 ℃作為制曲的最佳溫度。

2.1.4 制曲濕度對豆豉制曲蛋白酶活力的影響 從圖4可以看出,隨著相對濕度的增加,蛋白酶活力先增加后又下降,在相對濕度為75%的酶活達(dá)到最大。這是因?yàn)槊咕L需要一定的水分,適宜的濕度能使得原料保持較好的水分同時(shí)使得微生物處于平衡狀態(tài),這樣有利于霉菌的生長,增加產(chǎn)酶量,但是濕度過大,使得培養(yǎng)箱內(nèi)水分過高,這樣可能妨礙霉菌與外界環(huán)境的物質(zhì)交換,不利于微生物的生長,從而使得酶活力下降。

圖4 濕度對豆豉制曲蛋白酶活力的影響Fig.4 Effect of culture humidity on protease activity in koji-making

2.1.5 制曲時(shí)間對豆豉制曲蛋白酶活力的影響 由圖5可知,隨著制曲時(shí)間的延長,蛋白酶活力呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢,在48 h時(shí)達(dá)到最大。這是因?yàn)樵?8 h之前,微生物在生長,從而酶活也逐漸增加,在48 h時(shí)霉菌生長得旺盛,產(chǎn)酶能力也達(dá)到最大,酶活也相應(yīng)得很高,而在48 h后,可能受于可利用的營養(yǎng)物質(zhì)的限制以及菌種產(chǎn)酶能力衰退的緣故,蛋白酶活力逐漸下降。

圖5 制曲時(shí)間對豆豉制曲蛋白酶活力的影響Fig.5 Effect of culture time on protease activity in koji-making

2.2 豆豉發(fā)酵條件參數(shù)的確定

2.2.1 發(fā)酵溫度對豆豉發(fā)酵產(chǎn)氨基態(tài)氮的影響 由圖6可知,豆豉發(fā)酵在45 ℃時(shí)產(chǎn)生的氨基態(tài)氮含量最高,溫度或低或高都不利于豆豉發(fā)酵。豆豉的發(fā)酵首先是大分子物質(zhì)如蛋白質(zhì)在酶的催化下產(chǎn)生小分子的氨基態(tài)氮,溫度低不利于酶催化反應(yīng),過高易使酶失活,實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)45 ℃為最佳發(fā)酵溫度。

圖6 溫度對豆豉發(fā)酵產(chǎn)氨基態(tài)氮含量的影響Fig.6 Effect of temperature on amino nitrogen content during fermentation

2.2.2 發(fā)酵濕度對豆豉發(fā)酵產(chǎn)氨基態(tài)氮的影響 從圖7可知,當(dāng)濕度為65%時(shí),豆豉發(fā)酵產(chǎn)氨基態(tài)氮含量最高,濕度過高或過低都不利于發(fā)酵。這是因?yàn)橄鄬穸扰c豆豉中的含水量相關(guān),只有在合適的濕度下,豆豉和微生物才能保持較好的水分,從而有利于豆豉發(fā)酵,濕度過低,豆豉內(nèi)的水分會(huì)蒸發(fā)出來,這樣不利于微生物的生長以及蛋白質(zhì)水解成氨基態(tài)氮,濕度過高,豆豉含水量高,豆豉表面附著水分,不利于內(nèi)外界的物質(zhì)交換,因此65%的相對濕度為最佳。

2.2.3 加水量對豆豉發(fā)酵產(chǎn)氨基態(tài)氮的影響 豆豉發(fā)酵前期是大豆中的蛋白質(zhì)在微生物分泌的酶的催化下發(fā)生的水解反應(yīng),所以必須有水參加,從圖8可知,當(dāng)加水量太低,不利于蛋白質(zhì)水解成氨基態(tài)氮,保持較高的水分有利于蛋白質(zhì)的分解,但是水分過高,豆豉呈現(xiàn)醬狀或者糊狀,不能夠保持豆豉原有的顆粒狀。從而控制加水量在一定范圍內(nèi)有利于豆豉發(fā)酵,從節(jié)約的角度,優(yōu)先選擇水∶豆豉曲=1∶2。

圖8 含水量對豆豉發(fā)酵產(chǎn)氨基態(tài)氮含量的影響Fig.8 Effect of water content on amino nitrogen content during fermentation

2.2.4 加鹽量對豆豉發(fā)酵產(chǎn)氨基態(tài)氮的影響 由圖9可知,當(dāng)含鹽量為5.0%時(shí),豆豉發(fā)酵效果較好。豆豉發(fā)酵過程中需要添加一定的食鹽,這不僅有利于最終成品的風(fēng)味品質(zhì),而且還與微生物生長有很大關(guān)系。高鹽能夠抑制微生物的生長以及蛋白酶活力,阻礙了蛋白質(zhì)分解,從而氨基態(tài)氮含量下降,影響豆豉的營養(yǎng)和風(fēng)味,所以控制加鹽量對于豆豉成品品質(zhì)至關(guān)重要。

圖9 加鹽量對豆豉發(fā)酵產(chǎn)氨基態(tài)氮含量的影響Fig.9 Effect of salt content on amino nitrogen content during fermentation

2.2.5 發(fā)酵時(shí)間對豆豉發(fā)酵產(chǎn)氨基態(tài)氮的影響 發(fā)酵時(shí)間決定了豆豉成品品質(zhì),比如風(fēng)味,口感[11-12]。從圖10可知,隨著發(fā)酵天數(shù)的增加,豆豉發(fā)酵產(chǎn)氨基態(tài)氮含量逐漸增加,在11 d達(dá)到最高,之后趨于穩(wěn)定。從節(jié)約成本和縮短周期的角度確定11 d為最佳發(fā)酵時(shí)間。

圖10 時(shí)間對豆豉發(fā)酵產(chǎn)氨基態(tài)氮含量的影響Fig.10 Effect of time on amino nitrogen content during fermentation

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

取1 kg飽滿的黃豆顆粒,用清水清洗直至干凈,加入3 L的30 ℃溫水浸泡4 h后,瀝干水分,放入121 ℃高壓蒸煮鍋內(nèi)蒸煮20 min,冷卻至室溫,獲得煮熟的黃豆顆粒。向煮熟的黃豆顆粒中接入15 g混合菌粉,其中米曲霉和黑曲霉菌粉的質(zhì)量比為4∶1,混合均勻,放入培養(yǎng)箱中制曲48 h,溫度為30 ℃,相對濕度為75%,取樣測定蛋白酶活力。

制曲完成過后,添加食鹽和無菌水,以質(zhì)量計(jì),每1 kg的豆豉曲加入50 g食鹽和500 mL的無菌水,將溫度調(diào)到45 ℃,相對濕度調(diào)為65%,發(fā)酵11 d,得到發(fā)酵豆豉,取樣測定氨基態(tài)氮含量。

制曲完成后,蛋白酶活力達(dá)到1033 u/g;發(fā)酵完成后,氨基態(tài)氮含量達(dá)到2.1 g/100 g;成品豆豉呈黑褐色顆粒狀,有濃濃的豆香味,口感柔軟,有一定的咸味。

3 結(jié)論

通過單因素實(shí)驗(yàn)考查不同條件對豆豉制曲產(chǎn)蛋白酶的影響,得到的制曲條件為每1 kg黃豆接種15 g菌粉、米曲霉∶黑曲霉=4∶1、溫度30 ℃、相對濕度75%,制曲48 h,最終蛋白酶活力可以達(dá)到1033 u/g;在此制曲條件下,通過單因素實(shí)驗(yàn)考查不同條件對豆豉發(fā)酵產(chǎn)氨基態(tài)氮的影響,得到的發(fā)酵條件為溫度45 ℃、濕度65%、每1 kg豆豉曲加入500 mL無菌水和50 g食鹽,發(fā)酵11 d后氨基態(tài)氮含量達(dá)到2.1 g/100 g。傳統(tǒng)工藝生產(chǎn)豆豉需要一個(gè)月甚至更長,該工藝條件能夠縮短豆豉生產(chǎn)周期,降低成本,對豆豉生產(chǎn)規(guī)?；哂兄匾饬x。

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Selection of technological parameters of Douchi fermented by multi-strains

CHEN Hao1,WANG Gui-rong2,LIU Tong-jie1,HE Guo-qing1,*

(1.College of Biosystems Engineering and Food Science,Zhejiang University,Hangzhou 310058,China;2.Hangzhou Original Seed Farm,Hangzhou 311115,China)

The starter mixture ofAspergillusoryzaeandAspergillusnigerwere used to produce Douchi and the protease activity and amino nitrogen content were respectively used as the indexes to explore the parameters of koji-making and fermentation by single factor test. The results showed that one good conditions of koji-making are as follows:15 g fungus powder in 1 kg soybean,Aspergillusoryzae∶Aspergillusniger=4∶1,30 ℃,75% RH and duration of 48 h,under these conditions,the protease activity reached 1033 u/g. One good conditions of fermentation were as follows:500 mL water and 50 g salt in 1 kg koji,45 ℃,65% RH and duration of 11 days,under these conditions,the amino nitrogen content reached 2.1 g/100 g.

Douchi;koji-making;fermentation;technological parameters

2016-03-09

陳浩(1990-),男,碩士研究生,研究方向:發(fā)酵工程,E-mail:21413057@zju.edu.cn。

*通訊作者:何國慶(1957-),男,博士,教授,研究方向:發(fā)酵工程,E-mail:gqhe@ zju.edu.cn。

TS264.2

A

1002-0306(2016)20-0000-00

10.13386/j.issn1002-0306.2016.20.000