蔣進(jìn)軍, 高 磊

復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院呼吸科, 上海 200032

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·論 著·

小鼠急性肺損傷后肺內(nèi)CFTR和ENaC的表達(dá)變化

蔣進(jìn)軍, 高 磊

復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院呼吸科, 上海 200032

目的： 探討囊性纖維化跨膜調(diào)節(jié)因子(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator，CFTR)氯離子通道和上皮細(xì)胞鈉通道(epithelial sodium channel，ENaC)蛋白在內(nèi)毒素誘發(fā)急性肺損傷小鼠肺內(nèi)的表達(dá)變化。方法： 將內(nèi)毒素經(jīng)小鼠氣管注入肺內(nèi)后誘發(fā)急性肺損傷，24 h、48 h、72 h后取肺組織，檢測其CFTR和ENaC的mRNA濃度變化、肺泡液體清除率、濕干重比。結(jié)果： 小鼠急性肺損傷后24 h、48 h、72 h，CFTR在肺內(nèi)的表達(dá)均降低(P<0.05)。小鼠急性肺損傷后24 h、48 h、72 h，α-ENaC在肺內(nèi)表達(dá)均降低(P<0.05)；β-ENaC、γ-ENaC在急性肺損傷后24 h、48 h表達(dá)降低(P<0.05)，而在急性肺損傷后72 h恢復(fù)正常。小鼠急性肺損傷后24 h、48 h、72 h，肺泡液體清除率和肺濕干重比出現(xiàn)類似的改變。結(jié)論： 內(nèi)毒素誘發(fā)的小鼠急性肺損傷組織中，CFTR和ENaC的表達(dá)均下降，肺泡液體清除率與其一致，肺濕干重的變化與其相反。

急性肺損傷; 囊性纖維化跨膜調(diào)節(jié)因子; 上皮細(xì)胞鈉通道; 內(nèi)毒素; 肺泡液體清除率

生理狀態(tài)下肺泡上皮細(xì)胞具有主動吸收肺泡內(nèi)液體的功能，從而保持肺泡腔內(nèi)干燥。急性肺損傷時(shí)，肺泡上皮細(xì)胞主動吸收液體能力下降，導(dǎo)致肺水腫持續(xù)存在。我們以往的研究提示，小鼠肺泡內(nèi)液體吸收主要是通過肺泡Ⅰ型上皮細(xì)胞鈉通道(epithelial sodium channel，ENaC)主動吸收肺泡腔內(nèi)的鈉離子實(shí)現(xiàn)的[1]。囊性纖維化跨膜調(diào)節(jié)因子(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator，CFTR)是一種氯離子通道，其通過調(diào)節(jié)上述鈉離子通道的離子轉(zhuǎn)運(yùn)來影響跨肺泡上皮的液體吸收和清除過程[2]。急性肺損傷時(shí)，肺泡液體清除功能受到抑制，主要原因可能是肺泡上皮細(xì)胞膜上這兩種離子通道功能受到抑制。因此，在急性肺損傷肺泡上皮清除水腫時(shí)，ENaC和CFTR是重要的離子通道。本研究通過內(nèi)毒素誘發(fā)的小鼠急性肺損傷模型，研究其肺損傷組織中ENaC和CFTR mRNA的表達(dá)變化。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 清潔級昆明小鼠，6～8周齡，(23±2) g，由復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心提供并協(xié)助飼養(yǎng)。

1.2 動物模型的建立 實(shí)驗(yàn)小鼠于固定容器內(nèi)給予吸入異氟烷麻醉，然后將其仰臥位固定于小鼠操作平臺，常規(guī)消毒切開皮膚，逐層鈍性分離直至暴露氣管，在吸氣相用1 mL注射器將脂多糖(lipopolysaccharide，LPS，Sigma公司)經(jīng)小鼠氣管快速注入肺內(nèi)(2 mg/mL ,50 μL)，注射完后立即將小鼠翻轉(zhuǎn)直立1 min，縫合切口。氣管內(nèi)注射LPS后 24 h、48 h、72 h，將小鼠麻醉處死，取肺組織。另選擇正常小鼠作為對照組。每組納入5只小鼠。通過蘇木精-伊紅(H-E)染色切片確認(rèn)急性肺損傷小鼠模型建立。

1.3 ENaC和CFTR mRNA表達(dá)的分析 小鼠肺組織勻漿后，抽提總RNA，采用分光光度儀(721型，上海精科儀器有限公司)分別在260 和280 nm波長處測定其光密度(D)，根據(jù)公式計(jì)算總RNA濃度及總量。

取總RNA進(jìn)行RT-PCR, CFTR和ENaC的PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物設(shè)計(jì)見表1。取1 μL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(cDNA)進(jìn)行PCR(Perkin Elmer GeneAmp PCR system 2400)，建立PCR反應(yīng)體系(表2)。每個(gè)樣本取10 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析，獲取電泳圖，測得條帶的量化值，計(jì)算與相應(yīng)看家基因條帶的相對比值，以此進(jìn)行分析。每個(gè)數(shù)據(jù)取標(biāo)本擴(kuò)增3次的平均值。

表1 ENaC、CFTR和GAPDH引物設(shè)計(jì)

表2 RT-PCR反應(yīng)體系

1.4 肺泡液體清除率(alveolar fluid clearance，AFC)的測定 AFC的測定方法參照既往文獻(xiàn)[1]。麻醉處死小鼠后，置于恒溫37℃的操作臺，迅速氣管切開插管，在30 s內(nèi)將10 mL/kg肺灌注溶液緩慢注入肺內(nèi)，導(dǎo)管末端連接純氧裝置，并通過PEEP閥全程予以5 cm H2O的氣道內(nèi)正壓。將灌注液注入小鼠氣管內(nèi)30 min后，通過氣管導(dǎo)管抽取液體50 μL，測量同位素濃度，根據(jù)下列公式計(jì)算AFC：

AFC=(Vi-Vf)/Vi×100

Vf=(Vi×TPi)/TPf

其中，TPi為注入氣管內(nèi)液體的初始蛋白濃度，TPf為實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)氣管內(nèi)收集液體的蛋白濃度。

1.5 肺濕干重比 急性肺損傷后24 h、48 h、72 h，取小鼠肺，獲取的質(zhì)量為濕重；隨后放入60℃烘箱內(nèi)3～5 d，質(zhì)量不變后獲取的質(zhì)量即為干重。濕重除以干重的值即為肺濕干重比。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠急性肺損傷后ENaC的α、β、γ亞型mRNA水平變化

2.1.1 α亞型(α-ENaC) 急性肺損傷后24 h、48 h、72 h，小鼠肺內(nèi)α-ENaC mRNA濃度均降低(P<0.05)，其中損傷后72 h降低最明顯(圖1)。

圖1 急性肺損傷后肺內(nèi)ENaC的α亞型(α-ENaC)濃度的變化

2.1.2 β亞型(β-ENaC) 急性肺損傷后24 h、48 h，β-ENaC mRNA濃度明顯降低(P<0.05)；急性肺損傷后72 h恢復(fù)正常水平，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2)。

2.1.3 γ亞型(γ-ENaC) 急性肺損傷后24 h、48 h，γ-ENaCmRNA濃度明顯降低(P<0.05)；急性肺損傷后72 h恢復(fù)正常，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3)。

圖2 急性肺損傷后肺內(nèi)ENaC的β亞型(β-ENaC)濃度的變化

圖3 急性肺損傷后肺內(nèi)ENaC的γ亞型(γ-ENaC)濃度的變化

2.2 小鼠急性肺損傷后CFTR mRNA表達(dá) 急性肺損傷后，CFTR的表達(dá)較正常水平明顯降低，24 h最低，48 h、72 h略有回升，但仍比正常水平低(P<0.05，圖4)。這提示，急性肺損傷小鼠模型中，肺內(nèi)CFTR表達(dá)被抑制。

2.3 急性肺損傷后AFC和肺濕干重比的變化 急性肺損傷后24 h，肺濕干重比由正常時(shí)的4增加到5.1(P<0.05)，同時(shí)AFC由12.5%降至9.85%(P<0.05)；急性肺損傷后48 h，肺濕干重比升至6.6(P<0.05)，同時(shí)AFC降至最低點(diǎn)7.5%(P<0.05)；急性肺損傷后72 h，肺濕干重比下降到5.5，但是仍較正常值高(P<0.05)，同時(shí)AFC上升至10.9%(P<0.05)。這說明小鼠LPS誘發(fā)急性肺損傷后48 h，肺損傷最為嚴(yán)重。

圖4 急性肺損傷后肺內(nèi)CFTR mRNA濃度的變化

圖5 急性肺損傷后AFC和肺濕干重比的變化

3 討 論

新生兒出生前，肺泡內(nèi)充滿羊水，而出生后數(shù)分鐘內(nèi)肺泡上皮能迅速清除肺泡內(nèi)的所有液體，使肺泡內(nèi)充滿氣體，新生兒即可呼吸。肺泡上皮細(xì)胞通過主動吸收肺泡腔內(nèi)的鈉離子和氯離子而實(shí)現(xiàn)肺泡液體清除的功能。

研究[3]表明，哺乳動物的各級支氣管和肺泡上皮細(xì)胞膜上ENaC的3個(gè)亞型均表達(dá)；氣管支氣管黏膜下腺體上也有少量ENaC表達(dá)。如果將ENaC的1個(gè)亞型基因敲除，小鼠出生后會很快死于急性呼吸衰竭，原因是：肺泡上皮ENaC功能不全，小鼠在出生時(shí)肺泡上皮細(xì)胞不能將肺泡腔內(nèi)的液體完全清除，從而形成肺水腫，導(dǎo)致氧彌散障礙[4]。因此，ENaC在肺泡液體清除中起非常重要的作用。ENaC調(diào)節(jié)劑可以促進(jìn)或抑制AFC，在正常小鼠模型中，ENaC抑制劑氨氯吡脒能明顯降低AFC，激動劑特布他林則能增加AFC；而在急性肺損傷模型中，特布他林促進(jìn)肺泡液體吸收[5]。

由于ENaC和CFTR的特異性抗體純度均不佳，因此很難直接檢測上皮鈉通道ENaC和氯離子通道蛋白CFTR在氣道和肺組織內(nèi)的表達(dá)。因此，本研究通過檢測其mRNA濃度來間接反映蛋白的表達(dá)情況。本研究顯示，小鼠急性肺損傷后24 h、48 h，肺內(nèi)ENaC的α、β、γ亞型的mRNA表達(dá)顯著下降，同時(shí)AFC降低；急性肺損傷后72 h，β、γ亞型的表達(dá)基本恢復(fù)正常，AFC也基本接近正常。這說明肺內(nèi)ENaC的表達(dá)變化與AFC的變化趨勢基本一致。研究[1-2,6]提示，急性肺損傷時(shí)小鼠AFC的下降原因之一是肺泡上皮正常結(jié)構(gòu)破壞，導(dǎo)致正常肺泡上皮細(xì)胞數(shù)量明顯減少；或者肺泡上皮細(xì)胞ENaC的mRNA產(chǎn)生下降，導(dǎo)致ENaC蛋白表達(dá)降低，使肺泡上皮鈉通道缺乏，從而引起液體清除功能下降。

在整個(gè)氣道上皮和肺泡上皮細(xì)胞膜上均有CFTR表達(dá)[7]。而我們之前的研究[1]也顯示，cAMP依賴性肺泡上皮液體轉(zhuǎn)運(yùn)必須依靠CFTR通道，CFTR在肺泡液體吸收中有一定作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，LPS誘發(fā)小鼠急性肺損傷后，CFTR的mRNA表達(dá)顯著降低，提示CFTR蛋白在肺上皮細(xì)胞膜的表達(dá)可能隨之減少，從而對急性肺損傷應(yīng)激導(dǎo)致的cAMP刺激性的液體吸收的增加起抑制作用；而且CFTR的表達(dá)變化與AFC的變化趨勢較一致，說明急性肺損傷時(shí)肺上皮細(xì)胞CFTR表達(dá)減少可能是AFC降低的原因之一。

目前，還少有研究報(bào)道小鼠急性肺損傷時(shí)，ENaC和CFTR mRNA在肺內(nèi)的表達(dá)變化。急性肺損傷(依據(jù)柏林定義，將其稱為急性呼吸窘迫綜合征[8])時(shí)，患者AFC越低，則相應(yīng)的生存率也就越低[3,9-10]。如果通過相應(yīng)的藥物來增加急性肺損傷時(shí)肺內(nèi)ENaC和CFTR的表達(dá)，就可以增加這些離子通道的數(shù)量，最終提高AFC，改善急性肺損傷患者的預(yù)后。既往研究[11-12]表明，糖皮質(zhì)激素、角化細(xì)胞生長因子等可以增加ENaC和CFTR在大鼠肺內(nèi)的表達(dá)，從而增加急性肺損傷時(shí)的AFC。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，在內(nèi)毒素誘發(fā)的小鼠急性肺損傷模型中，ENaC 3種亞型和CFTR mRNA損傷后短期內(nèi)(24～48 h)在肺內(nèi)的表達(dá)水平都明顯降低，與AFC和肺濕干重的變化基本同步。因此認(rèn)為，急性肺損傷時(shí)肺內(nèi)離子通道蛋白的表達(dá)下降可能導(dǎo)致AFC的下降，這是治療急性肺損傷的一個(gè)潛在靶點(diǎn)。

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[本文編輯] 姬靜芳

Changes of expression of CFTR and ENaC in lung of mice after acute lung injury

JIANG Jin-jun, GAO Lei

Department of Respiratory Medicine, Zhongshan Hospital，F(xiàn)udan University, Shanghai 200032, China

Objective： To investigate the changes in the expression of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) chloride channel and epithelial sodium channel (ENaC) protein in lung of mice with acute lung injury induced by endotoxin. Methods： Lipopolysaccharide (LPS) was instilled into the tracheas of the mice to induce acute lung injury. After 24 h, 48 h and 72 h, the lung tissue was taken to detect the changes in the mRNA levels of ENaC and CFTR, alveolar fluid clearance (AFC) and wet/dry ratio. Results： 24 h, 48 h, and 72 h after acute lung injury in mice, the expression of CFTR all decreased in the lung (P<0.05). 24 h, 48 h, and 72 h after acute lung injury in mice, the expression of α-ENaC all decreased in the lung (P<0.05). 24 h and 48 h after acute lung injury in mice, the expression of β-ENaC and γ-ENaC both decreased in the lung (P<0.05), but at 72 h, the level returned to normal. 24 h, 48 h, and 72 h after acute lung injury in mice, the same change occurred in alveolar fluid clearance, but the lung wet/dry ratio increased. Conclusions： In endotoxin-induced acute lung injury in mice, the expression of CFTR and ENaC both decreased, alveolar fluid clearance also decreased but the wet/dry ratio increased.

acute lung injury; cystic fibrosis transmembrane conductance regulator；epithelial sodium channel; endotoxin; alveolar fluid clearance

2016-06-12 [接受日期] 2016-10-16

上海市科學(xué)技術(shù)委員會重點(diǎn)項(xiàng)目(15DZ1930602), 上海市衛(wèi)生局應(yīng)用研究項(xiàng)目(20134056).Supported by Shanghai Municipal Science and Technology Commission Program(15DZ1930602)，and Shanghai Municipal Public Health Bureau Program(20134056).

蔣進(jìn)軍, 博士，副主任醫(yī)師. E-mail:jiang.jinjun@zs-hospital.sh.cn

10.12025/j.issn.1008-6358.2016.20160520

R 73-76+2

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