康爭春， 梁 涵， 李 勃， 劉 巖， 蔡 慧， 馬立業(yè)*

1. 第二軍醫(yī)大學(xué)長海醫(yī)院胃腸外科，上海 200433 2. 第二軍醫(yī)大學(xué)熱帶醫(yī)學(xué)和公共衛(wèi)生學(xué)系環(huán)境衛(wèi)生學(xué)教研室，上海 2004333. 北戴河療養(yǎng)院，秦皇島 066100

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·論 著·

生長因子受體結(jié)合蛋白2表達(dá)與結(jié)直腸癌進(jìn)展和預(yù)后的相關(guān)性

康爭春1△， 梁 涵2△， 李 勃3， 劉 巖2， 蔡 慧1， 馬立業(yè)1*

1. 第二軍醫(yī)大學(xué)長海醫(yī)院胃腸外科，上海 200433 2. 第二軍醫(yī)大學(xué)熱帶醫(yī)學(xué)和公共衛(wèi)生學(xué)系環(huán)境衛(wèi)生學(xué)教研室，上海 2004333. 北戴河療養(yǎng)院，秦皇島 066100

目的： 評價生長因子受體結(jié)合蛋白2(growth factor receptor-bound protein 2,Grb2)表達(dá)水平與結(jié)直腸癌進(jìn)展及預(yù)后的關(guān)系。方法： 對Grb2的蛋白表達(dá)及細(xì)胞定位進(jìn)行免疫組化檢測。用t檢驗、chi-square檢驗等分析Grb2的表達(dá)與年齡、性別、腫瘤部位、分化等級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移個數(shù)、TNM分期、輔助化療、血清癌胚抗原(CEA)和血清 CA19-9之間的關(guān)系。用Kaplan-Meier法分析Grb2的表達(dá)水平對患者生存率的影響；用Cox回歸分析結(jié)直腸癌預(yù)后的影響因素。結(jié)果： Grb2主要表達(dá)于結(jié)直腸癌上皮細(xì)胞的胞質(zhì)。結(jié)直腸癌組織中胞質(zhì)Grb2的表達(dá)顯著高于腺瘤和癌旁組織(P<0.05)，而結(jié)腸癌組織、腺瘤、癌旁組織中胞核Grb2中的表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義。癌上皮細(xì)胞胞質(zhì)中Grb2高表達(dá)與年齡、性別、腫瘤部位、分化等級、TNM分期、輔助化療、血清CEA、血清CA19-9之間均無相關(guān)性，Grb2表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移個數(shù)有相關(guān)性(P=0.001)。Cox單因素分析發(fā)現(xiàn)，胞質(zhì)Grb2高表達(dá)能預(yù)測患者的不良預(yù)后；進(jìn)一步納入TNM等指標(biāo)，Cox多因素分析發(fā)現(xiàn)，Grb2是結(jié)直腸癌預(yù)后的獨立影響因素[無瘤生存風(fēng)險比(HR)=2.664，P=0.015；總體生存風(fēng)險比(HR)=2.574，P=0.019]。結(jié)論： Grb2高表達(dá)與結(jié)直腸癌進(jìn)展密切相關(guān)，是結(jié)直腸癌預(yù)后的獨立危險因素。

結(jié)直腸癌；生長因子受體結(jié)合蛋白2；不良預(yù)后

結(jié)直腸癌嚴(yán)重威脅人類生命健康，每年約有120萬的患者被診斷為結(jié)直腸癌，60多萬患者死于該病。男性的發(fā)病率高于女性，且隨著年齡的增長而增加。大多數(shù)結(jié)直腸癌呈散發(fā)性，發(fā)展緩慢，常由腺瘤逐漸發(fā)展而來。目前結(jié)直腸癌最有效的治療方法為手術(shù)[1-2]。然而，20%～25%的結(jié)直腸癌患者確診時已發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，20%～25%的結(jié)直腸癌患者治療后仍會發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致結(jié)直腸癌患者病死率達(dá)45%[3]。術(shù)后輔助化療可有效減少患者復(fù)發(fā)，但過度化療又易引起化療相關(guān)不良反應(yīng)。因此，尋找結(jié)直腸癌的有效標(biāo)志物并作為診斷依據(jù)對在疾病早期給予患者合理治療尤為重要。

目前，結(jié)直腸癌的預(yù)后和輔助治療主要依據(jù)其病理分期來確定。然而，相同分期患者的預(yù)后不盡相同。10%～20%的Ⅱ期結(jié)直腸癌患者和30%～40%的Ⅲ期患者在治療后會復(fù)發(fā)[4]。近年來發(fā)現(xiàn)了多種可以反映結(jié)直腸癌特性且能有效預(yù)測其預(yù)后的分子標(biāo)志物，但因這些標(biāo)志物特異性較差而未能用于臨床實踐。因此，亟需尋找特異性較好且能夠反映臨床療效的分子標(biāo)志物。

生長因子受體結(jié)合蛋白2(growth factor receptor-bound protein 2,Grb2)是一種廣泛表達(dá)于各種細(xì)胞的銜接蛋白，主要參與調(diào)控酪氨酸激酶受體信號通路。Grb2水平的異常與腫瘤的進(jìn)展密切相關(guān)[5]。何政等[6]用real-time PCR和Western印記檢測胰腺癌細(xì)胞株中的Grb2基因及蛋白后發(fā)現(xiàn)，Grb2與胰腺癌惡性程度及預(yù)后密切相關(guān)。魏希鋒等[7]及李旭東等[8]應(yīng)用免疫組織化學(xué)法發(fā)現(xiàn)，Grb2表達(dá)的高低與膀胱移行細(xì)胞癌的病理分級、臨床分期有關(guān)。Zhang等[9]發(fā)現(xiàn)，Grb2是miR-411-5p的直接靶點，敲除Grb2可以抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲；Grb2在乳腺癌中呈現(xiàn)高表達(dá)，且其高表達(dá)與乳腺癌患者不良預(yù)后密切相關(guān)；于觀貞等[10-11]通過免疫組織化學(xué)法發(fā)現(xiàn)，Grb2與胃癌的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)；陳麗妹等[12]研究發(fā)現(xiàn)，封閉Grb2可造成結(jié)直腸癌細(xì)胞內(nèi)增殖相關(guān)信號通路的分子表達(dá)下調(diào)。Grb2對胰腺癌、膀胱癌、乳腺癌、胃癌、結(jié)直腸癌等腫瘤均有重要的預(yù)后價值。但是，目前尚缺乏樣本量較多、病例資料較完整、隨訪時間較長的研究報道結(jié)直腸癌中Grb2蛋白水平與結(jié)直腸癌進(jìn)展及預(yù)后的關(guān)系。本研究通過分析第二軍醫(yī)大學(xué)長海醫(yī)院收治的結(jié)直腸癌患者較為完整的病例、標(biāo)本資料，進(jìn)一步探討Grb2與結(jié)直腸癌進(jìn)展及預(yù)后的關(guān)系。

1 資料和方法

1.1 一般資料 選擇2001年1月至2009年12月在第二軍醫(yī)大學(xué)長海醫(yī)院普通外科行結(jié)直腸癌根治術(shù)的341例患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)術(shù)前未合并其他部位惡性腫瘤；(2)術(shù)后病理證實為結(jié)直腸癌，病理分期為Ⅰ～Ⅲ期，患者的結(jié)直腸癌組織樣本經(jīng)甲醛固定、石蠟包埋；(3)手術(shù)根治性切除腫瘤，術(shù)后生存期大于1個月，未發(fā)生圍術(shù)期并發(fā)癥；(4)有完整規(guī)范的術(shù)后病理報告及隨訪資料。選取341例患者的癌組織樣本，其中37例患者的癌組織周圍正常黏膜的石蠟樣本作為對照。341例結(jié)直腸癌患者中，男性191例、女性150例，男性∶女性=1.3∶1；平均年齡(60±13.0)歲。341例標(biāo)本中，Ⅰ期32例，Ⅱ期155例，Ⅲ期154例。同時選取51例因結(jié)腸腺瘤于第二軍醫(yī)大學(xué)長海醫(yī)院行手術(shù)切除手術(shù)患者的瘤組織樣本，經(jīng)甲醛固定、石蠟包埋。

1.2 觀察指標(biāo) 分析入組患者的年齡、性別、腫瘤位置、清掃淋巴結(jié)數(shù)目、TNM分期(按照美國癌癥聯(lián)合委員會和國際抗癌聯(lián)盟結(jié)直腸癌TNM分期系統(tǒng)第7版進(jìn)行)、腫瘤細(xì)胞分化程度、術(shù)前血清癌胚抗原(CEA)濃度、血清癌抗原19-9(CA19-9)濃度、術(shù)后是否行FOLFOX化療方案。術(shù)后復(fù)發(fā)：局部復(fù)發(fā)包括局部淋巴結(jié)復(fù)發(fā)、吻合口復(fù)發(fā)等；遠(yuǎn)處復(fù)發(fā)包括血路轉(zhuǎn)移(如肝、肺等)、腹腔種植轉(zhuǎn)移等。術(shù)后復(fù)發(fā)診斷主要依據(jù)體格檢查、影像學(xué)檢查及內(nèi)鏡檢查。隨訪開始于患者出院，終于患者死亡；隨訪截止時間為2015年10月。

1.3 免疫組化

1.3.1 方法 甲醛固定、石蠟包埋的標(biāo)本經(jīng)上海芯超生物科技有限公司制作成組織芯片。組織芯片的免疫組織化學(xué)染色由第二軍醫(yī)大學(xué)長海醫(yī)院病理實驗中心完成。組織芯片置于二甲苯中脫蠟后，經(jīng)一系列不同濃度的乙醇浸泡水化，然后放入3%的過氧化氫(H2O2)溶液中以消除過氧化物酶活性。組織芯片經(jīng)蒸餾水沖洗后，置入檸檬酸緩沖劑中，98℃煮25 min，使Grb2的抗原位點暴露。然后將組織芯片放入體積濃度為20%的山羊血清中孵育，封閉非特異性位點，再用一抗(1∶150, #1517-1, Epitomics公司, 美國)、二抗(Dako公司, 加拿大)分別37℃孵育30 min，其間用PBS漂洗3次，每次5 min。上述步驟結(jié)束后，在組織芯片中加入顯色劑顯色15 min，用自來水充分沖洗，用蘇木精復(fù)染，脫水，加入中性樹膠封片。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料采用t檢驗，計數(shù)資料采用chi-square檢驗或雙側(cè)Fisher精確檢驗，分類變量采用Mann-WhitneyU檢驗。采用Kaplan-Meier法分析Grb2高表達(dá)組與低表達(dá)組的生存率差異；采用Cox單因素和多因素回歸分析法分析結(jié)直腸癌預(yù)后的影響因素。檢驗水準(zhǔn)(α)為0.05。

2 結(jié) 果

2.1 結(jié)直腸癌組織中Grb2的表達(dá) 免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)，Grb2在癌旁組織、腺瘤組織、結(jié)直腸癌組織呈不同程度的染色(圖1)。Grb2主要在上皮細(xì)胞表達(dá)，而間質(zhì)表達(dá)量較少。癌旁組織胞核Grb2的陽性率為48.6%(18/37)，腺瘤組織胞核Grb2的陽性率為56.9%(29/51)，癌組織胞核Grb2的陽性率為49.6%(169/341)；癌旁組織胞質(zhì)Grb2的陽性率為5.4%(2/37)，腺瘤組織胞質(zhì)Grb2的陽性率為21.6%(11/51)，癌組織胞質(zhì)Grb2的陽性率為73.9%(252/341)。癌旁、腺瘤、結(jié)直腸癌組織胞核Grb2的表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義,胞質(zhì)Grb2的表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖2)。因此，以下研究均僅采用胞質(zhì)Grb2。

圖1 癌旁組織、腺瘤組織、結(jié)直腸癌組織中Grb2免疫組化染色(×200)

圖2 癌旁、腺瘤、結(jié)直腸癌組織胞質(zhì)、胞核Grb2表達(dá)比較

2.2 結(jié)直腸癌組織中Grb2表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系 免疫組化評估(表1)發(fā)現(xiàn)，341例結(jié)直腸癌組織中，98例胞質(zhì)Grb2高表達(dá)，243例胞質(zhì)Grb2低表達(dá)；胞質(zhì)Grb2的表達(dá)情況可能與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移個數(shù)有關(guān)(P=0.001)，與年齡、性別、腫瘤部位、分化等級、TNM分期、輔助化療、血清 CEA和血清 CA19-9無相關(guān)性。

表1 結(jié)直腸癌胞質(zhì)Grb2表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系

2.3 Grb2的表達(dá)水平與結(jié)直腸癌預(yù)后的關(guān)系

2.3.1 胞質(zhì)Grb2高表達(dá)組和低表達(dá)組患者的生存曲線 采用Kaplan-Meier法分析胞質(zhì)Grb2高、低表達(dá)組無瘤生存率及總體生存率差異，發(fā)現(xiàn)在不同的TNM分期，胞質(zhì)Grb2高表達(dá)組均較低表達(dá)組無瘤生存率低、預(yù)后差(P<0.05)(圖3A～3C)；在不同的TNM分期，胞質(zhì)Grb2高表達(dá)組均較低表達(dá)組總生存率低、預(yù)后差(P<0.05)(圖3D～3F)。

圖3 胞質(zhì)Grb2高表達(dá)組與低表達(dá)組患者的生存曲線

A：Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ期結(jié)直腸癌患者無瘤生存曲線；B：Ⅰ+Ⅱ期結(jié)直腸癌患者無瘤生存曲線；C：Ⅲ期結(jié)直腸癌患者無瘤生存曲線；D：Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ期結(jié)直腸癌患者總體生存曲線；E：Ⅰ+Ⅱ期結(jié)直腸癌患者總體生存曲線；F：Ⅲ期結(jié)直腸癌患者總體生存曲線

2.3.2 結(jié)直腸癌預(yù)后影響因素的Cox單因素和多因素分析 患者總體生存期的Cox單因素分析顯示，胞質(zhì)Grb2表達(dá)水平(P=0.005)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移個數(shù)(P=0.029)是結(jié)直腸癌預(yù)后的影響因素，而TNM分期、分化等級、輔助化療、年齡、性別、腫瘤部位、血清CEA和血清CA19-9不是結(jié)直腸癌預(yù)后的影響因素；Cox多因素分析顯示，胞質(zhì)Grb2表達(dá)水平是結(jié)直腸癌預(yù)后的獨立影響因素(P=0.019)，TNM分期、分化等級、輔助化療、年齡、性別、腫瘤部位、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移個數(shù)、血清 CEA和血清 CA19-9不是預(yù)后的獨立影響因素(表2)?；颊邿o瘤生存期的Cox單因素分析顯示，胞質(zhì)Grb2表達(dá)水平(P=0.005)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移個數(shù)(P=0.035)是結(jié)直腸癌預(yù)后的影響因素，而TNM分期、分化等級、輔助化療、年齡、性別、腫瘤部位、血清CEA和血清 CA19-9不是結(jié)直腸癌預(yù)后的影響因素；Cox多因素分析顯示，胞質(zhì)Grb2表達(dá)水平(P=0.015)是結(jié)直腸癌預(yù)后的獨立影響因素，TNM分期、分化等級、輔助化療、年齡、性別、腫瘤部位、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移個數(shù)、血清 CEA和血清CA19-9不是結(jié)直腸癌預(yù)后的獨立影響因素(表3)。

表2 結(jié)直腸癌患者總體生存期的影響因素

表3結(jié)直腸癌患者無瘤生存期的影響因素

3 討 論

Grb2主要通過調(diào)控受體酪氨酸激酶信號通路而調(diào)控細(xì)胞生長、增殖、分化等生理功能，其異常表達(dá)可促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。目前研究發(fā)現(xiàn)，Grb2和多種惡性腫瘤進(jìn)展及預(yù)后關(guān)系密切。Li等[13]通過免疫組織化學(xué)法發(fā)現(xiàn)，Grb2蛋白在食管鱗狀細(xì)胞癌組織胞質(zhì)中呈高表達(dá)，并且提示不良預(yù)后。本研究發(fā)現(xiàn)，與癌旁結(jié)直腸組織及腺瘤組織相比，結(jié)直腸癌組織中Grb2蛋白高表達(dá)，并且胞質(zhì)陽性率高于胞核，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。趙廷寬等[14]研究發(fā)現(xiàn)，膽管癌Grb2蛋白高表達(dá)的患者易發(fā)生淋巴轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，推測Grb2可能與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移相關(guān)。研究[15]則證實，結(jié)直腸癌中Grb2蛋白高表達(dá)可能促進(jìn)腫瘤的生長、侵襲及轉(zhuǎn)移。本研究發(fā)現(xiàn)，Grb2表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移個數(shù)有相關(guān)性(P=0.001)，而與年齡、性別、腫瘤部位、分化等級、TNM分期、輔助化療、血清CEA和血清CA19-9無相關(guān)性；Grb2蛋白高表達(dá)組患者術(shù)后復(fù)發(fā)時間短于低表達(dá)組，Grb2蛋白高表達(dá)組生存率低于低表達(dá)組，提示Grb2蛋白可能對結(jié)直腸癌患者的遠(yuǎn)期生存有預(yù)測作用。

甘肅省臨澤縣轄鴨暖、倪家營2鄉(xiāng)，新華、蓼泉、板橋、平川、沙河 5鎮(zhèn)，74個村，765個村民小組，總?cè)丝?4.63萬人，其中農(nóng)業(yè)人口12.52萬人，占總?cè)丝诘?6%。近年，臨澤縣在各級政府高度重視和有關(guān)部門的大力支持配合下，著力解決農(nóng)村飲水衛(wèi)生、供水量不足等問題，取得了顯著成效。截至目前，全縣已建成農(nóng)村集中供水工程34項，解決了44個村1.8萬戶6.92萬人的飲水問題。

Grb2蛋白作為信號通路中的關(guān)鍵蛋白，近幾年受到廣泛關(guān)注。針對Grb2蛋白的靶點治療是目前研究的熱點。針對Grb2抑制劑的研究均取得了較好的進(jìn)展。封閉Grb2后，結(jié)直腸癌細(xì)胞內(nèi)增殖相關(guān)信號通路的分子表達(dá)下調(diào)[12]；有研究研制出針對其信使RNA的抑制劑，發(fā)現(xiàn)其也可抑制癌細(xì)胞增殖[16]。在關(guān)于Grb2的SH2和SH3結(jié)構(gòu)域的研究中，Burke等[17]發(fā)現(xiàn)，針對其SH2結(jié)構(gòu)域的抑制劑可降低乳腺癌細(xì)胞的增殖速度；Guan等[18]發(fā)現(xiàn)，針對其SH3結(jié)構(gòu)域的抑制劑可以逆轉(zhuǎn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的多藥耐藥性。

本研究樣本量較大、病例資料較完整、隨訪時間較長，但由于缺乏克隆形成、細(xì)胞增殖等實驗數(shù)據(jù)，無法深入論證Grb2與結(jié)直腸癌的相關(guān)性及Grb2的作用機(jī)制。但本研究仍為進(jìn)一步論證Grb2與結(jié)直腸癌的關(guān)系提供了依據(jù)。

綜上所述，近年來，有關(guān)結(jié)直腸癌早期診斷的生物標(biāo)志物研究較多，但均缺乏特異性，臨床應(yīng)用價值較低。本次研究中，Cox單因素分析顯示，胞質(zhì)Grb2高表達(dá)能預(yù)測結(jié)直腸癌患者的不良預(yù)后；進(jìn)一步納入TNM等指標(biāo)，Cox多因素分析顯示，Grb2是結(jié)直腸癌患者總生存期、無瘤生存期的獨立影響因素(P<0.05)，而TNM分期、分化等級、輔助化療、年齡、性別、腫瘤部位、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移個數(shù)、血清 CEA和血清CA19-9不是結(jié)直腸癌患者預(yù)后的獨立影響因素。本研究提示，Grb2蛋白在結(jié)直腸癌中高表達(dá)，與不良預(yù)后密切相關(guān)。Grb2蛋白有希望成為預(yù)測結(jié)直腸癌侵襲及轉(zhuǎn)移新的生物標(biāo)志物。

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[本文編輯] 姬靜芳

The relationship between growth factor receptor-bound protein 2 expression and the progression and prognosis of colorectal cancer

KANG Zheng-chun1△, LIANG Han2△, LI Bo3, LIU Yan2, CAI Hui1, MA Li-ye1*

1. Department of Gastrointestinal Surgery, Changhai Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China 2. Department of Environmental Hygiene, Faculty of Tropical Medicine and Public Health, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China 3. Beidaihe Sanatorium, Qinhuangdao 066100, Hebei, China

Objective： To evaluate the correlation between growth factor receptor-bound protein 2 (Grb2) expression and the progression and prognosis of colorectal cancer. Methods： Grb2 expression and its location were detected by immunohistochemisty. The relationship between Grb2 expression and clinicopathologic factors (including age, sex, tumor location, differentiation grade, number of metastatic lymph nodes, TNM staging, adjuvant chemotherapy, serum carcinoembryonic antigen (CEA) and serum CA19-9 were analyzed by t-test, chi-square test and so on. Kaplan-Meier method was used to analyze the influence of Grb2 expression on the survival rate of patients, and Cox regression analysis was used to analyze factors contributing to prognosis of colorectal cancer. Results： Grb2 was mainly expressed in the cytoplasm of colorectal cancer epithelial cells. The expression of cytoplasmic Grb2 in colorectal cancer was significantly higher than that in adenoma and adjacent tissues (P<0.05), while there was no significant difference in nucleic Grb2. There was no correlation between cytoplasmic Grb2 expression and such clinicopathologic factors as age, sex, tumor location, differentiation grade, TNM staging, adjuvant chemotherapy, serum CEA and serum CA19-9, but correlation between Grb2 expression and the number of metastatic lymph nodes(P=0.001). Cox univariate analysis showed that high expression of cytoplasmic Grb2 may predict poor prognosis; after indices such as TNM were included, Cox multivariate analysis showed that Grb2 is an independent prognostic factor for colorectal cancer: its high expression predicted a shorter disease-free survival (HR=2.664,P=0.015) and overall survival (HR =2.574,P=0.019). Conclusions： The high expression of Grb2 is closely related to the progression of colorectal cancer, and it is an independent risk factor for colorectal cancer prognosis.

colorectal cancer; growth factor receptor-bound protein 2; poor prognosis

2016-01-29 [接受日期] 2016-08-18

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金(81402433),中國博士后科學(xué)基金(2015T81088).Supported by National Natural Youth Science Foundation of China(81402433),and China Postdoctoral Science Foundation(2015T81088).

康爭春, 碩士生. E-mail: ytrkzc@163.com; 梁 涵, 碩士生. E-mail: 15026966839@163.com

10.12025/j.issn.1008-6358.2016.20160103

R 735.3

A

△共同第一作者(Co-first authors).

*通信作者(Corresponding author). Tel: 021-31161591, E-mail: malydr@163.com