林曉平, 汪珍光, 孫金海

1.第二軍醫(yī)大學(xué)衛(wèi)生勤務(wù)學(xué)系軍隊(duì)健康管理學(xué)教研室，上海 200433

2.第二軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，上海 200433

3.第二軍醫(yī)大學(xué)東方肝膽外科醫(yī)院膽道三科，上海 200433

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·論 著·

乙肝相關(guān)肝癌患者肝組織硬脂酰-輔酶A脫氫酶的表達(dá)與預(yù)后的相關(guān)性

林曉平1,2, 汪珍光3, 孫金海1*

1.第二軍醫(yī)大學(xué)衛(wèi)生勤務(wù)學(xué)系軍隊(duì)健康管理學(xué)教研室，上海 200433

2.第二軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，上海 200433

3.第二軍醫(yī)大學(xué)東方肝膽外科醫(yī)院膽道三科，上海 200433

目的： 探討乙肝相關(guān)肝癌組織中硬脂酰-輔酶A脫氫酶(stearoyl-CoA desaturase, SCD)的表達(dá)水平及臨床意義。方法： 構(gòu)建176例距離肝癌邊界3 cm以上肝組織的組織芯片，應(yīng)用免疫組化技術(shù)檢測(cè)SCD的表達(dá)水平，并分析其與臨床病理學(xué)特征之間的關(guān)系。結(jié)果： SCD在乙肝相關(guān)肝癌患者肝組織中的陽性率為85.80%(151/176)。且肝組織中SCD表達(dá)量與腫瘤數(shù)目、微血管侵犯、肝硬化等相關(guān)(P<0.05)，SCD高水平表達(dá)組患者無瘤生存時(shí)間和總體生存時(shí)間均短于SCD低水平表達(dá)組。結(jié)論： SCD在乙肝相關(guān)肝癌患者肝組織中的表達(dá)量與臨床病理及不良預(yù)后之間存在一定聯(lián)系，提示肝癌患者肝組織中SCD的表達(dá)量可以作為不良預(yù)后的標(biāo)志物。

肝癌；SCD；組織芯片；免疫組化

根據(jù)2014年世界衛(wèi)生組織報(bào)告，我國(guó)肝癌新增病例數(shù)和死亡病例數(shù)均居世界首位。最近的研究表明與肥胖相關(guān)的非酒精性脂肪肝病(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)不僅可導(dǎo)致肝癌，且肥胖相關(guān)的肝癌與丙肝病毒感染導(dǎo)致的肝癌相比預(yù)后更差[1]。與肥胖相關(guān)的非酒精性脂肪肝組織中，由于脂肪沉積，肝臟星狀細(xì)胞被激活。一方面，活化的星狀細(xì)胞會(huì)激活肝臟組織中的巨噬細(xì)胞，促進(jìn)炎癥；另一方面，激活的星狀細(xì)胞會(huì)直接調(diào)控肝細(xì)胞，促進(jìn)其發(fā)生表皮間質(zhì)樣轉(zhuǎn)化，從而加速肝癌的發(fā)生、發(fā)展過程[2]?？梢?，肝細(xì)胞的脂肪代謝的異常與肝癌的發(fā)生、發(fā)展有著密切的關(guān)系。肝癌患者手術(shù)后殘存肝組織中的肝細(xì)胞肩負(fù)著分裂增殖、恢復(fù)肝臟重量及功能的重任，肝細(xì)胞脂肪代謝的紊亂無疑會(huì)影響這一過程。此外，手術(shù)后殘存的肝組織也提供了肝癌復(fù)發(fā)的微環(huán)境，是“種子腫瘤細(xì)胞”生根發(fā)芽的“土壤”，紊亂的肝細(xì)胞脂肪代謝會(huì)參與其“微環(huán)境”的構(gòu)建。因此，肝癌病人手術(shù)后殘存肝組織中肝細(xì)胞脂肪代謝的關(guān)鍵調(diào)控基因的表達(dá)變化可能會(huì)對(duì)患者手術(shù)后的預(yù)后產(chǎn)生較大的影響。

硬脂酰-輔酶A脫氫酶(stearoyl-CoA desaturase, SCD)是催化飽和脂酰輔酶A生成單不飽和脂酰輔酶A的關(guān)鍵酶[3-4]。高熱量飲食[5]、運(yùn)動(dòng)、激素等因素均影響SCD的表達(dá)水平。調(diào)控SCD蛋白表達(dá)水平或者是蛋白活性會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)飽和與單不飽和脂肪酸比例的調(diào)整，從而進(jìn)一步影響整個(gè)機(jī)體的脂質(zhì)代謝。有研究結(jié)果顯示，肥胖以及肝細(xì)胞中脂肪累積與肝細(xì)胞中SCD的表達(dá)水平呈正相關(guān)[6-7]。SCD作為脂肪酸合成的關(guān)鍵調(diào)控基因，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切，參與腫瘤發(fā)展的多個(gè)方面，包括細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、凋亡、炎癥反應(yīng)等[8-10]。腫瘤細(xì)胞中降低SCD的表達(dá)能夠誘導(dǎo)凋亡，抑制多種不同類型腫瘤生長(zhǎng)[11-12]。盡管近期有研究表明與癌旁組織比較，SCD在肝癌組織中表達(dá)量增高，且其表達(dá)量與肝癌患者的預(yù)后相關(guān)[13]，但肝癌患者手術(shù)后殘存肝組織中SCD的表達(dá)量是否影響患者預(yù)后仍沒有定論。

本研究將探討肝癌患者手術(shù)后殘存肝組織中肝細(xì)胞SCD的表達(dá)對(duì)肝癌患者根治性切除術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)和患者生存時(shí)間的影響，明確肝癌患者肝組織中SCD高表達(dá)是否為肝癌切除術(shù)后復(fù)發(fā)和死亡的危險(xiǎn)因素，為肝癌患者肝癌切除術(shù)后健康管理措施的制定提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源及隨訪 收集在上海東方肝膽外科醫(yī)院進(jìn)行肝切除的176例乙肝相關(guān)肝癌患者的資料，包括手術(shù)時(shí)身高、體質(zhì)量、年齡、性別、肝硬化及肝炎史、甲胎蛋白(alpha fetoprotein, AFP)的大小及數(shù)目、癌栓、腫瘤分期等資料。術(shù)后1個(gè)月復(fù)查肝功能、AFP、乙肝病毒的脫氧核糖核酸(HBV-DNA)、肝臟增強(qiáng)磁共振，以后每3個(gè)月復(fù)查肝功能、AFP、HBV-DNA、B超，每6個(gè)月復(fù)查核磁共振、胸片。

1.2 組織芯片的構(gòu)建 選取遠(yuǎn)離肝癌邊界的(>3 cm)肝組織作為實(shí)驗(yàn)樣品。組織芯片由上海芯超生物科技有限公司協(xié)助制作，具體步驟包括：將組織陣列儀設(shè)計(jì)重提的組織陣列塊放置于52℃烤箱中加熱融合，采用全自動(dòng)組織切片機(jī)以4 μm/rad進(jìn)行切片，切片裱附在防脫載玻片上，并置于60℃恒溫烤箱中16 h，最后于4℃冰箱中保存。

1.3 免疫組織化學(xué)術(shù)檢測(cè)SCD的表達(dá) 免疫組織化學(xué)染色按照鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)法(SP法)標(biāo)準(zhǔn)操作步驟進(jìn)行。抗SCD單克隆抗體(HPA012107, Sigma-Aldrich)及二抗均購自sigma公司。結(jié)果判斷由3位病理科醫(yī)生完成，按目標(biāo)蛋白染色程度分為無(切片上的染色為無色，-)、輕度(切片上的染色為淺黃色，+)、中度(切片上的染色為棕黃色，)和重度染色(切片上的染色為深棕色，)。

1.4 測(cè)量方法 測(cè)量身高、體質(zhì)量：入院時(shí)，患者著輕便衣服接受身高、體質(zhì)量的測(cè)量，身高以m為單位，記小數(shù)點(diǎn)后2位，體質(zhì)量以kg為單位，精確到0.5 kg。根據(jù)身體質(zhì)量指數(shù)(body mass index, BMI)=體質(zhì)量(kg)/身高2(m2)，計(jì)算出患者的身體質(zhì)量指數(shù)值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件處理，分層變量比較采用χ2檢驗(yàn)。生存檢驗(yàn)采用Kaplan-Meirer和Log-rank檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)(α)為0.05。

2 結(jié) 果

2.1 SCD在肝癌患者肝組織中的表達(dá) 乙肝相關(guān)肝癌癌旁組織中SCD蛋白的陽性信號(hào)主要集中在細(xì)胞質(zhì)中(圖1)，偶爾也可見部分細(xì)胞核中陽性表達(dá)。176例組織中檢測(cè)出SCD的陽性表達(dá)率為85.80%(151/176)。

圖1 SCD在原發(fā)性肝癌癌旁肝組織中的表達(dá)(SP法)

2.2 肝癌患者肝組織中SCD表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 根據(jù)176例乙肝相關(guān)肝癌癌旁組織中SCD的陽性表達(dá)水平，將患者分成SCD高水平組(染色程度為中度和重度染色，n=75)和低水平組(染色程度為無和輕度，n=101)，比較兩組患者之間性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤數(shù)量、分化程度、微血管癌栓的差異情況，發(fā)現(xiàn)兩組患者肝硬化、微血管癌栓、腫瘤數(shù)目有顯著差異(表1)。腫瘤數(shù)目為多個(gè)(≥2)的比例，SCD高水平組(18/75=24.00%)高于SCD低水平組(12/101=11.88%)；有微血管侵犯的比例，SCD高水平組(20/75=26.67%)高于SCD低水平組(13/101=12.87%)；而發(fā)生肝硬化的比例則是，SCD高水平組(16/75=21.33%)低于SCD低水平組(41/101=40.59%)，說明癌旁組織中SCD高水平表達(dá)與腫瘤數(shù)目多、發(fā)生微血管侵犯呈正相關(guān)，而與肝硬化的發(fā)生呈負(fù)相關(guān)。

2.3 肝癌患者肝組織中SCD表達(dá)與患者手術(shù)后預(yù)后的關(guān)系 在預(yù)后方面，肝組織中SCD高水平組病人的無瘤生存時(shí)間和總體生存時(shí)間均短于SCD低水平組，見圖2。

表1 肝癌患者肝組織中SCD表達(dá)水平與臨床病理特征間的關(guān)系

圖2 在預(yù)后方面，SCD蛋白表達(dá)高水平組的無瘤生存時(shí)間(A)和總體生存時(shí)間(B)均要短于SCD蛋白表達(dá)低水平組

3 討 論

我國(guó)肝癌患者大部分來自于慢性乙肝患者，應(yīng)該重視慢性乙肝-肝硬化-肝癌的全過程、全方位的健康管理，肝癌復(fù)發(fā)率很高，對(duì)經(jīng)過治療的患者的健康管理同樣重要。目前我國(guó)肝癌患者的健康管理水平與肝癌發(fā)病大國(guó)的狀況是不相適應(yīng)的，在肝癌患者臨床治療期間的健康管理工作中還有很多問題需要深入研究。特別是肝癌患者手術(shù)切除后的健康管理和健康指導(dǎo)，需要整合基礎(chǔ)科研的肝癌分子分型研究、臨床循證醫(yī)學(xué)研究和流行病學(xué)調(diào)查等方面的成果。

乙型肝炎病毒(hepatitis b virus, HBV)的慢性感染是導(dǎo)致肝細(xì)胞癌變最重要的原因。近年來的相關(guān)研究結(jié)果表明，HBV可通過多種途徑對(duì)人肝細(xì)胞的功能產(chǎn)生諸多影響。對(duì)HBV轉(zhuǎn)基因鼠肝臟組織的蛋白質(zhì)組學(xué)以及代謝組學(xué)的研究結(jié)果表明，HBV抗原的表達(dá)會(huì)導(dǎo)致肝細(xì)胞脂肪酸代謝紊亂[14]。伴隨著感染肝細(xì)胞組裝并分泌完整HBV病毒顆粒，肝細(xì)胞膜的丟失非常明顯，從而需要肝細(xì)胞大量合成新的細(xì)胞膜。眾所周知，細(xì)胞膜的主要結(jié)構(gòu)是脂質(zhì)雙分子層，因此細(xì)胞膜的更新會(huì)在一定程度上促進(jìn)脂肪酸合成與代謝的活躍。此外，隨著肥胖、高脂血癥和糖尿病等代謝性疾病的全球化流行，NAFLD已成為目前對(duì)人類健康損害最嚴(yán)重的問題之一。據(jù)保守估計(jì)，全世界約有10億人口患有NAFLD，在生活水平相對(duì)較高的西方發(fā)達(dá)國(guó)家，該疾病的流行更是明顯，約有1/3的人口罹患該病[15]。Ascha等研究者近3年的隨訪數(shù)據(jù)表明，非酒精性脂肪性肝炎導(dǎo)致的肝硬化患者中約有12.8%的患者會(huì)進(jìn)展為肝癌[16]?？梢?，在肝癌的發(fā)生、發(fā)展過程中，肝細(xì)胞脂肪代謝紊亂起到重要作用[17]。而通過控制飲食、增加有氧運(yùn)動(dòng)等可行健康管理措施調(diào)整慢性乙型肝炎患者及肝癌患者肝細(xì)胞的脂肪代謝程度，可能會(huì)延緩疾病的進(jìn)展，改善其預(yù)后。本研究之所以選擇肝癌手術(shù)病人遠(yuǎn)離癌邊界(距離邊界3 cm以上)的肝組織(接近于手術(shù)后的殘存肝組織)進(jìn)行研究，是基于肝癌的復(fù)發(fā)主要有兩種可能：一種是可能殘存的肝細(xì)胞重新“癌化”生成了一個(gè)“新的”肝癌，此時(shí)，殘存肝組織中的肝細(xì)胞基因表達(dá)的異常及功能改變實(shí)際上提供了其向癌細(xì)胞轉(zhuǎn)變的基礎(chǔ)；另一種可能是隱藏于殘存肝組織中的“少量癌細(xì)胞”增殖成為“肝內(nèi)轉(zhuǎn)移性”肝癌，在這種情況下，殘存肝組織中的肝細(xì)胞參與構(gòu)建的“微環(huán)境”對(duì)其增殖等變化有重要影響。因此，肝癌病人手術(shù)后殘存肝組織中肝細(xì)胞是影響其復(fù)發(fā)的重要因素。本研究主要是在肝癌手術(shù)病人遠(yuǎn)離(距離邊界3 cm以上)癌邊界的肝組織中檢測(cè)脂肪代謝關(guān)鍵酶SCD的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其在殘存肝組織中的表達(dá)量越低，病人手術(shù)后的無瘤生存時(shí)間和整體生存時(shí)間就越長(zhǎng)，預(yù)后越好。綜上所述，肝臟細(xì)胞脂肪代謝關(guān)鍵酶SCD在肝癌患者手術(shù)后殘存肝組織的表達(dá)與肝癌的臨床病理學(xué)特征之間存在相關(guān)性，提示其在肝癌復(fù)發(fā)中起一定作用。因此，研究及檢測(cè)SCD在肝癌患者手術(shù)后殘存肝組織的表達(dá)，對(duì)肝癌的治療以及判斷預(yù)后具有一定的臨床意義，可將SCD作為肝癌發(fā)展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后的評(píng)估指標(biāo)。

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[本文編輯] 廖曉瑜, 賈澤軍

The relationship between the expression of stearoyl-CoA desaturase in liver tissue and the prognosis of HBV-related hepatocellular carcinoma patients

LIN Xiao-ping1,2, WANG Zhen-guang3, SUN Jin-hai1*

1. Department of Health Management, Faculty of Health Service, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China2. College of Basic Medical Sciences, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China3. Third Department of Biliary Tract, Shanghai Eastern Hepatobiliary Surgery Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China

Objective： To investigate the expression level and clinical significance of stearoyl-CoA desaturase (SCD) in liver tissues of HBV-related hepatocellular carcinoma (HCC) patients. Methods： We constructed the tissue microarray of liver tissue 3 cm beyond the HCC boundary (n=176), detected the expression level of SCD by immunohistochemistry, and analyzed the relationship between the expression level and clinical pathological features. Results： The positive rate of SCD in liver tissues of patients with HBV-related HCC patients was 85.80% (151/176). The SCD expression level was associated with tumor number, microvascular invasion, liver cirrhosis (P< 0.05). The tumor free survival time and overall survival time of SCD high level expression group were both shorter than those of SCD low level expression group. Conclusions： The SCD expression level in the liver tissues of HBV-related HCC patients is related to clinical pathology and prognosis, which suggests that the expression of SCD in the liver tissues of HCC patients can be used as a marker of poor prognosis.

hepatocellular carcinoma; stearoyl-CoA desaturase; tissue microarray; immunohistochemistry

2016-07-05 [接受日期] 2016-08-11

林曉平，碩士生，實(shí)驗(yàn)師. E-mail: xiaolin714714@126.com

*通信作者(Corresponding author). Tel: 021-81870913, E-mail: sunjinhai2003@sina.com

10.12025/j.issn.1008-6358.2016.20160026

R 735.7

A