肖 璐，鄔旭龍，王 印,2，姚學(xué)萍,2，楊澤曉,2，胡 凌，林星宇，任梅滲，曾相杰，羅忠永

(1 四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，四川 成都，611130；2 動物疫病與人類健康四川省重點實驗室，四川 成都 611130)

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豬源Bb SC-SN株的分離鑒定及其皮膚壞死毒素(DNT)全基因序列分析

肖 璐1，鄔旭龍1，王 印1,2，姚學(xué)萍1,2，楊澤曉1,2，胡 凌1，林星宇1，任梅滲1，曾相杰1，羅忠永1

(1 四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，四川 成都，611130；2 動物疫病與人類健康四川省重點實驗室，四川 成都 611130)

【目的】 了解當(dāng)前支氣管敗血波氏桿菌(Bb)地方菌株皮膚壞死毒素(DNT)基因的變異特點?！痉椒ā?利用分離培養(yǎng)、PCR及16S rRNA擴增片段同源性分析，對采自四川遂寧某規(guī)?；i場有明顯萎縮性鼻炎癥狀的鼻拭子進(jìn)行病原分離鑒定，并對分離株的DNT基因進(jìn)行克隆和序列分析，對其抗原域、氨基酸二級結(jié)構(gòu)、特定區(qū)域位于蛋白質(zhì)表面可能性等參數(shù)進(jìn)行預(yù)測，分析其B細(xì)胞抗原表位?！窘Y(jié)果】 成功分離得到一株支氣管敗血波氏桿菌，命名為支氣管敗血波氏桿菌SC-SN株。分離株DNT基因序列全長4 357 bp，與其他11株菌DNT基因的核苷酸序列同源性為93.1%～100.0%，但由于其356位插入堿基A，使得該序列僅編碼1 426個氨基酸，與上述11株DNT基因編碼的氨基酸序列同源性僅為12.8%～47.0%。遺傳進(jìn)化樹顯示，SC-SN 分離株與S798日本株和未知1株的親緣關(guān)系最近。軟件預(yù)測結(jié)果顯示，Bb SC-SN株DNT基因編碼氨基酸B細(xì)胞抗原表位發(fā)生較大變化?！窘Y(jié)論】 經(jīng)鑒定，分離株確為支氣管敗血波氏桿菌，且SC-SN株的DNT基因序列變異較大，第356位插入的堿基A，對其氨基酸序列、ORF及B細(xì)胞抗原表位分布產(chǎn)生了較大的影響。

支氣管敗血波氏桿菌；分離鑒定；皮膚壞死毒素基因；豬

支氣管敗血波氏桿菌(Bordetellabronchiseptica， Bb)從首次分離至今，其分類經(jīng)4次更改，最后由Moreno-Lopez[1]將其歸為波氏菌屬。該菌為革蘭氏陰性菌，可致犬、貓、兔等數(shù)種動物呼吸系統(tǒng)疾病，在豬中主要與多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocida，Pm)混合感染導(dǎo)致豬的萎縮性鼻炎(Atrophicrhinitis，AR)，好發(fā)于仔豬[2-3]。該菌還能與豬鏈球菌(Streptococcussuis，S.suis)、副豬嗜血桿菌(Haemophilussuis，HPS)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)等病原混合感染[4-6]，從而增加呼吸道疾病的發(fā)病率，加重病情，誘發(fā)豬呼吸道疾病綜合癥(Porcine respiratory disease complex，PRDC)，引起豬只死亡，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大危害[7]。Mattoo等[8]和Brockmeier等[9]指出Bb的主要毒力因子有粘附素和毒素。粘附素主要包括絲狀血凝素(Filamentous hemagglutinin, FHA)、百日咳桿菌粘附素(Pertactin)以及菌毛(Fimbriae)，毒素主要包括腺苷環(huán)化酶溶血素(Adenylate cyclase-hemolisin，AC-Hly)、氣管細(xì)胞毒素(Tracheal cytotocin，TCF)和皮膚壞死毒素(Dermonecrotic toxin，DNT)以及Ⅲ型分泌系統(tǒng)。DNT 是Bb導(dǎo)致豬發(fā)生鼻甲骨萎縮的重要直接致病因子[10]，也是Bb定居于上呼吸道的必備因子。DNT存在于Bb胞漿內(nèi)，對福爾馬林敏感，不耐熱，滅活后仍具有抗原性，可刺激機體產(chǎn)生抗毒素中和抗體[11]。此外Bb的免疫原性強弱很有可能與DNT有關(guān)[12]。鑒于此，對DNT基因的研究意義重大。目前在NCBI上可查到的BbDNT的全基因序列較少，國內(nèi)對DNT的研究也相對較少。本試驗通過對采集于四川的BbDNT基因克隆、測序及拼接，得到其全基因序列，并對其進(jìn)行分析，以期為支氣管敗血波氏桿菌病的理論研究、疫苗研制、疫病防控等提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

pMD19-T載體、大腸桿菌DH5ɑ，均購自TaKaRa公司；膠回收試劑盒、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(TIAN amp Bacteria DNA Kit)，均購于北京天根生化科技有限公司；SPF鼠，購于成都達(dá)碩實驗有限公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 Bb菌株的分離鑒定及動物回歸試驗

2015年采集四川遂寧某規(guī)模化豬場有明顯萎縮性鼻炎癥狀的豬鼻腔拭子，于胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基(TSA)上進(jìn)行Bb的分離。挑疑似菌落革蘭氏染色鏡檢后，取純化單一菌落于胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB)中擴大培養(yǎng)，使用TIAN amp Bacteria DNA Kit提取細(xì)菌基因組DNA，-20 ℃保存，備用。使用細(xì)菌16S rRNA 通用引物及Fla基因合成特異性引物[13](表1)對分離株進(jìn)行PCR鑒定，引物由InvitrogenTM公司合成。PCR反應(yīng)體系為25 μL：2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL，上、下游引物各1.5 μL，模板2 μL，ddH2O補至25 μL。陰性對照的模板采用ddH2O。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃ 變性30 s，按表1溫度退火30 s，72 ℃延伸45 s，30個循環(huán)；72 ℃總延伸10 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后于紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察，回收16S rRNA擴增產(chǎn)物，送InvitrogenTM測序，在NCBI上用BLAST進(jìn)行同源性比對。

將分離株接種至TSB中擴大培養(yǎng)，用磷酸鹽緩沖液(PBS)調(diào)整細(xì)菌密度為109CFU/mL，取菌液腹腔注射30～40 d SPF鼠5只作試驗組，每只0.2 mL，同時用同批次同日齡健康鼠5只腹腔注射等量PBS作為對照組。

1.3DNT基因的克隆

1.3.1DNT基因的分段擴增 根據(jù)NCBI上發(fā)布的DNT基因序列(GenBank登錄號：U59687)，使用Primer 5設(shè)計3對特異性引物(表1)，對DNT基因分3段(DNT1、DNT2、DNT3)進(jìn)行PCR擴增(圖1)，引物由InvitrogenTM公司合成。PCR反應(yīng)體系：2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL，上、下游引物各1.5 μL，模板2 μL，ddH2O補至25 μL。試驗設(shè)陰性對照，模板采用ddH2O。反應(yīng)條件：94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，按表1溫度退火30 s，72 ℃ 45 s，30個循環(huán)；72 ℃，10 min。產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，于全自動紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察。

表 1 本試驗PCR所用引物信息

圖 1 Bb DNT基因擴增示意圖

1.3.2DNT分段克隆及鑒定 純化回收上述3段PCR產(chǎn)物，分別與pMD19-T 16 ℃連接過夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，均勻涂布于含0.1 mg/mL 氨芐青霉素LA培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24 h。取單個鑒定為陽性的質(zhì)粒擴大培養(yǎng)，送InvitrogenTM公司測序。

1.4DNT基因的序列分析

利用NCBI上的BLAST及DNAMAN對測序結(jié)果初步分析，再利用DNA STAR中Seq Man模塊，將所測3段序列拼接得分離株DNT基因全序列，利用Meg Align模塊中 Clustal W對序列同源性及進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行分析，再采用Protean模塊的Chou-Fasman結(jié)合Gamier-Robson預(yù)測分離株DNT的1 426 個氨基酸的二級結(jié)構(gòu)分布情況，再利用Jameson-Wolf預(yù)測潛在的蛋白抗原決定簇，用Emini預(yù)測特定區(qū)域位于蛋白質(zhì)表面的可能性，用Karplus-Schulz預(yù)測蛋白質(zhì)骨架區(qū)的柔韌性，用Kyte-Doolittle結(jié)合Hopp-Woods預(yù)測蛋白質(zhì)的親水區(qū)和疏水區(qū)。采用ExPASy Prot Param tool(http://web.expas20.5y.org/protparam/)及ORF finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/)在線軟件，對克隆DNT序列與NCBI中已登錄的11株波氏菌屬菌株DNT序列進(jìn)行比對和分析。參比DNT序列信息見表2。

表 2 參比11株波氏菌屬菌株DNT序列的主要信息

表 2(續(xù)) Continued table 2

2 結(jié)果與分析

2.1 Bb病原菌的分離鑒定及動物回歸試驗

分離株在TSA上長出圓形隆起、不透明菌落，革蘭氏染色鏡檢可見兩極濃染的革蘭氏陰性桿菌(圖2-A)。用FLA-1/FLA-2及16S rRNA通用引物16S-R/16S-F的擴增產(chǎn)物經(jīng)1% 瓊脂糖凝膠電泳，分別可見長度約237，1 540 bp的條帶，陰性對照無條帶(圖2-B)。16S rRNA序列經(jīng)BLAST比對后結(jié)果顯示，分離株與未知1株、S798株等序列同源性均達(dá)99%。說明該分離菌株確為支氣管敗血波氏桿菌，命名為Bb SC-SN株。

動物回歸試驗結(jié)果顯示，注射菌液的試驗組5只小鼠在24～36 h死亡，對照組未見異常。蘸取死亡小鼠脾臟，于TSA上培養(yǎng)分離得到與豬源分離的Bb形態(tài)一致的細(xì)菌，經(jīng)鑒定證實鼠內(nèi)臟分離菌確為Bb，推知分離Bb對小鼠具有較強致病性。

A.革蘭氏染色鏡檢圖(1 000×);B.PCR鑒定，M.DL2000 DNA Marker，1.FLA，2.FLA陰性對照，3.16S rRNA，4.16S rRNA陰性對照

圖 2 Bb的分離與PCR鑒定結(jié)果

Fig.2 Bb isolation and PCR identification

2.2 BbDNT基因的分段克隆及鑒定

用3對特異性引物對DNT基因進(jìn)行PCR擴增，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，可見長度約為1 603，1 139和1 872 bp 的條帶，陰性對照無條帶(圖3)，證明DNT的3段基因均克隆成功。

2.3 BbDNT基因的序列分析

分析顯示,Bb SC-SN株DNT基因核苷酸序列與其他11個參比序列的同源性為93.1%～100.0%(表3)，其中SC-SN株DNT與日本株S798同源性高達(dá)100.0%;與美國株MO149同源性最低，僅93.1%。用DNAMAN軟件對上述12個序列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，SC-SN株DNT在356位插入堿基A，其對應(yīng)氨基酸序列與比對序列同源性僅12.8%～47.0%。由繪制進(jìn)化樹(圖4)可知，SC-SN株DNT基因與日本分離株S798及未知1株的親緣關(guān)系最近。

M.DL2000 DNA Marker；1.DNT1(1 603 bp)；2.DNT1陰性對照 Negative control of DNT1；3.DNT2(1 139 bp)；4.DNT2陰性對照 Negative control of DNT2；5.DNT3(1 872 bp)；6.DNT3陰性對照 Negative control of DNT3

菌株StrainSC?SN未知2株Unknown2B1917Bpp5CS未知3株Unknown3MO149RB50S798未知1株Unknown125312822SC?SN99．999．499．799．499．893．199．7100．099．999．699．6未知2株Unknown20．199．499．699．499．993．099．699．899．899．599．5B19170．60．699．6100．099．392．999．899．599．599．799．7Bpp50．30．40．499．699．593．199．999．799．799．899．8CS0．60．80．00．499．392．999．899．599．599．799．7未知3株Unknown30．20．10．70．50．792．999．599．899．799．499．4MO1497．37．47．57．37．57．593．193．193．193．193．0RB500．30．40．20．10．20．57．399．799．799．999．9S7980．00．10．50．30．50．27．30．3100．099．699．6未知1株Unknown10．10．20．50．30．50．37．30．30．099．699．62530．40．50．20．20．30．67．30．10．40．499．9128220．40．50．30．20．30．87．40．10．40．40．1

注：對角線以上表示不同菌株DNT基因核苷酸序列同源性，對解線以下表示不同菌株DNT基因核苷酸序列同源性差異。

Note:The right upper showed the homology ofDNTnucleotide of different strain,the left lower showed the homology divergence ofDNTnucleotide of different strain.

圖 4 Bb SC-SN株DNT的遺傳進(jìn)化分析

將SC-SN 株DNT基因序列與其親緣性最近的序列分析發(fā)現(xiàn)，其與未知1株的序列相比，核苷酸一致性達(dá)99.93%，除在356位插入堿基A外，224位、554位及617位也發(fā)生變異；與S798株DNT序列相比，核苷酸一致性達(dá)99.95%，在第356位插入堿基A，617位發(fā)生變異。但SC-SN 株DNT氨基酸序列與未知1株及S798株氨基酸序列同源性較低，均為20.5%，使用ExPASy Prot Param tool在線軟件對上述3個氨基酸序列分析得知其理化特性差異較大(表4)。

表 4 Bb DNT基因編碼氨基酸理化性質(zhì)比對結(jié)果

使用NCBI中ORF finder對SC-SN 株、未知1株及S798株DNT基因的開放閱讀框(ORF)進(jìn)行分析，預(yù)測結(jié)果顯示，SC-SN株、未知1株及S798株DNT基因分別有11，10，9個ORF，小于200 bp的ORF無差異，但SC-SN株DNT序列預(yù)測最大ORF為4 008 bp，增加了一個807 bp的ORF。據(jù)此可知SC-SN 株DNT雖與其余11個比對序列的核苷酸同源性較高，但其在第356位插入的堿基A，可能對該核苷酸序列編碼的氨基酸序列、ORF及蛋白質(zhì)理化性質(zhì)的預(yù)測結(jié)果有一定影響。

2.4 SC-SN株DNT相關(guān)預(yù)測

經(jīng)對DNT基因編碼氨基酸二級結(jié)構(gòu)、潛在蛋白抗原決定簇區(qū)、骨架區(qū)柔韌性、親水區(qū)和疏水區(qū)等因素的綜合分析，推測SC-SN株DNT基因編碼氨基酸B細(xì)胞抗原表位最可能位于以下10處：15-24，213-226，283-302，353-365，580-610，636-654，745-755，804-837，1 090-1 111，1 186-1 192氨基酸殘基。同法預(yù)測未知1株和S798DNT基因編碼氨基酸的B細(xì)胞抗原表位最可能位于以下14處：15-24，106-120，210-217，416-425，515-522，616-623，705-718，839-852，971-986，1 098-1 106，1 169-1 186，1 216-1 221，1 373-1 384，1 401-1 416氨基酸殘基。可知DNT基因編碼氨基酸B細(xì)胞抗原表位預(yù)測差別較大，預(yù)測的SC-SN株抗原表位主要在900位以下，而未知1株和S798的900位以上抗原表位有6處。另外，以上3個菌株的DNT序列在第100-700位的預(yù)測差異也較大，僅第15-24位之間的預(yù)測結(jié)果相同。

將SC-SN株、未知1株及S798株的DNT氨基酸序列進(jìn)行比對，從118位之后的預(yù)測蛋白抗原決定簇區(qū)域、特定區(qū)域位于蛋白質(zhì)表面可能性、蛋白質(zhì)骨架區(qū)柔韌性及親、疏水區(qū)均發(fā)生較大變化，推測這與SC-SN株DNT基因 356位插入堿基A有較大關(guān)聯(lián)。

3 討 論

Bb常以直接或間接方式與呼吸道病原協(xié)同致病，加重病情，造成損失，其潛在威脅不可小覷。DNT作為Bb最重要的致病因子，對Bb地方性豬波氏菌病的防治意義重大。

本試驗通過細(xì)菌分離培養(yǎng)、PCR鑒定及序列分析，成功分離出一株支氣管敗血波氏桿菌，并分3段對SC-SN株DNT基因進(jìn)行克隆及序列分析。核苷酸同源性分析可知，SC-SN株DNT基因核苷酸序列與其他11株波氏菌屬的DNT序列相似性較高；進(jìn)化樹顯示，SC-SN株DNT基因與CS中國株親緣性較低，與S798日本株及未知1株親緣關(guān)系最近。但由于SC-SN株DNT基因在第356位插入堿基A，使得其118位后的氨基酸排列發(fā)生較大變化，預(yù)測蛋白質(zhì)理化性質(zhì)也發(fā)生較大變化，與S798日本株及未知1株相比編碼氨基酸個數(shù)減少25個，序列同源性驟降，同時引起ORF發(fā)生較大變化。鑒于堿基插入引起的改變，對DNT基因編碼氨基酸的B細(xì)胞抗原表位進(jìn)行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)SC-SN株DNT基因編碼氨基酸相比其他DNT基因編碼氨基酸少了4個抗原表位，356位插入的堿基A理論上對應(yīng)第118-119氨基酸殘基，通過對預(yù)測結(jié)果對比，推測該堿基的插入可能僅影響106位后的B細(xì)胞的抗原表位分布預(yù)測，對15-24位區(qū)域的抗原表位預(yù)測影響較小。但該堿基的插入是否導(dǎo)致SC-SN株DNT基因編碼蛋白質(zhì)理化性質(zhì)、ORF改變及B細(xì)胞抗原表位的改變，以及該堿基的插入是否會引起該菌的皮膚毒性、致病力等特性的改變，還需要進(jìn)行進(jìn)一步研究探討。另外，關(guān)于DNT序列的生物學(xué)信息研究及DNT編碼的蛋白功能域的相關(guān)研究目前相對較少，可能是今后Bb研究的熱點之一。

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Identification of an Bb SC-SN isolated from Sichuan and sequence analysis ofDNTgene

XIAO Lu1,WU Xulong1,WANG Yin1,2,YAO Xueping1,2,YANG Zexiao1,2,HU Ling1,LIN Xingyu1,REN Meishen1,ZENG Xiangjie1,LUO Zhongyong1

(1 College of Veterinary Medicine,Sichuan Agricultural University,Chengdu，Sichuan 611130,China;2KeyLaboratoryofAnimalDiseaseandHumanHealthofSichuanProvince,Chengdu,Sichuan611130,China)

【Objective】 This study investigated the variation characteristics ofBordetellabronchisepticaDNTgene in Sichuan.【Method】 ABordetellabronchisepticastrain was identified from swine nose swab with respiratory disease from a pig farm in Suining,Sichuan by cultivation,PCR and 16S rRNA homology analysis.Then,DNTof the strain was cloned,the sequence,antigenicity,amino acid secondary structure,certain location surface accessibility in protein and B cell epitopes were analyzed.【Result】 ABordetellabronchisepticastrain was separated successfully and named Bb SC-SN.The sequence analysis showed that the length ofDNTwas 4 357 bp,and it coded 1 426 amino acids with A inserted in the 356th position.TheDNTsequence of SC-SN strain shared 93.1%-100.0% homology with other 11 strains,but the homology of amino acid sequences was 12.8%-47.0%.Phylogenetic tree showed thatDNTof SC-SN strain had closest relationship to S798.The B cell epitopes of Bb SC-SNDNTamino acid changed greatly according to model prediction.【Conclusion】 The isolated SC-SN strain wasBordetellabronchiseptica,and itsDNTvaried greatly.The base A at the 356th position had great influence on amino acids,ORFs and B cell epitopes.

Bordetellabronchiseptica;identification;DNT;swine

時間:2016-10-20 16:36

10.13207/j.cnki.jnwafu.2016.12.002

2015-07-10

國家“十二五”科技支撐計劃項目(2013BAD12B04)

肖 璐(1991-)，女，四川什邡人，碩士，主要從事預(yù)防獸醫(yī)研究。E-mail：yaanxiaolu@163.com

王 印(1968-)，男，四川南充人，教授，博士，博士生導(dǎo)師，主要從事預(yù)防獸醫(yī)研究。E-mail：yaanwangyin@tom.com

S855.1+2

A

1671-9387(2016)12-0009-07

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20161020.1636.004.html